JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

I lipidi sono noti per svolgere un ruolo importante nelle funzioni cellulari. Qui, si descrive un metodo per determinare la composizione lipidica di neutrofili, con enfasi sul livello di colesterolo, utilizzando sia HPTLC e HPLC per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi alla base di neutrofili extracellulare formazione trappola.

Abstract

analisi dei lipidi eseguita da cromatografia su strato sottile ad alta prestazione (HPTLC) è un metodo relativamente semplice e conveniente di analizzare una vasta gamma di lipidi. La funzione dei lipidi (ad esempio, nelle interazioni ospite-patogeno o voce host) è stato segnalato per svolgere un ruolo cruciale nei processi cellulari. Qui mostriamo un metodo per determinare la composizione dei lipidi, con una particolare attenzione per il livello di colesterolo neutrofili emoderivati ​​primari, da HPTLC rispetto a cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). L'obiettivo era quello di indagare il ruolo delle alterazioni dei lipidi / colesterolo nella formazione di neutrofili trappole extracellulari (NET). rilascio NET è noto come un meccanismo di difesa dell'ospite per impedire la diffusione di agenti patogeni all'interno dell'ospite. Pertanto, neutrofili umani derivati ​​dal sangue sono stati trattati con metil-β-ciclodestrina (MβCD) per indurre alterazioni lipidiche nelle cellule. Utilizzando HPTLC e HPLC, abbiamo dimostrato che il trattamento MβCD delle cellule porta alla lipidicaalterazioni associate con una significativa riduzione del contenuto di colesterolo della cella. Allo stesso tempo, il trattamento MβCD dei neutrofili ha portato alla formazione di reti, come dimostrato da immunofluorescenza. In sintesi, qui vi presentiamo un metodo dettagliato per studiare alterazioni lipidiche neutrofili e la formazione di reti.

Introduzione

I lipidi hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella omeostasi cellulare, morte cellulare, interazioni ospite-patogeno, e di citochine rilascio 1. Nel corso del tempo, l'interesse e la conoscenza sull'impatto dei lipidi nelle interazioni ospite-patogeno o infiammazioni sono aumentati, e diverse pubblicazioni confermano il ruolo centrale di alcuni lipidi, in particolare il colesterolo di steroidi, in risposte cellulari. trattamento farmacologico con statine, che vengono utilizzati come inibitori della biosintesi del colesterolo bloccando 3-idrossi-3-metilglutaril-Coenzima-A-reduttasi (HMG-CoA reduttasi), può agire come agenti anti-infiammatori abbassando i livelli sierici di interleuchina 6 e proteina C-reattiva 2. Colesterolo e strutture glicosfingolipidi arricchiti possono essere usate da diversi agenti patogeni, come batteri e virus, come un gateway nell'ospite 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sfingolipidi (ad esempio, sfingomielina) hanno dimostrato di essere utilizzati da patogeni per promuovere la loro patogenicità 7. Nei macrofagi, domini per entrare nelle cellule uso micobatteri colesterolo arricchita; una deplezione di colesterolo inibisce l'assorbimento micobatterica 8. Inoltre, infezione di macrofagi con Francisella tularensis, un agente zoonotico responsabile tularemia (noto anche come febbre dei conigli) 9, ha portato ad un'infezione che è stata abolita quando il colesterolo è stata esaurita dalle membrane 10. Analogamente, l'invasione delle cellule ospiti di Escherichia coli tramite strutture ricche di lipidi è stata dimostrata per essere il colesterolo-dipendente 4. Inoltre, Salmonella typhimurium esperimenti di infezione di cellule epiteliali hanno dimostrato che il colesterolo è essenziale per l'ingresso del patogeno nelle cellule 11. Colesterolo esaurimento inhibited l'assorbimento di Salmonella 11. Inoltre, un recente studio condotto da Gilk et al. ha dimostrato che il colesterolo svolge un ruolo importante nella diffusione di Coxiella burnetti 12. Inoltre, Tuong et al. rilevato che il 25-idrossicolesterolo gioca un ruolo cruciale nella fagocitosi da lipopolisaccaride (LPS) -stimulated macrofagi 13. La fagocitosi è stato ridotto quando i macrofagi sono stati trattati farmacologicamente per esaurire il colesterolo 14. Così, il colesterolo e altri lipidi sembrano giocare un ruolo importante nella infezione e infiammazione, dal momento che il loro esaurimento può ridurre il rischio di invasione da diversi agenti patogeni 10, 11, 12.

Recentemente, siamo stati in grado di dimostrare che alterazioni lipidiche, in particolare l'esaurimento del colesterolo dalla cella, indurre la formazione di spazio extracellulare neutrofilir trappole (NET) in derivati dal sangue umano neutrofili 15. Dalla scoperta del NET nel 2004, essi hanno dimostrato di giocare un ruolo critico nel intrappolamento batterica, e quindi nel ostacolare la diffusione di infezioni 16, 17. NET consistono di una dorsale DNA associato con istoni, proteasi, e peptidi antimicrobici 16. Il rilascio delle reti da neutrofili può essere indotta da patogeni invasori 18, 19 e sostanze chimiche come forbolo miristato-acetato (PMA) o statine 16, 20. Tuttavia, i meccanismi cellulari dettagliati e in particolare il ruolo dei lipidi in questo processo, non sono ancora del tutto chiaro. L'analisi dei lipidi può portare ad una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti in una varietà di processi e interazioni cellulari, come ad esempio il rilascio di NET. Cholesterol e sfingomielina sono costituenti fondamentali della membrana cellulare e lipidi microdomini, dove si aggiungono la stabilità e facilitare il raggruppamento delle proteine coinvolte nel traffico di proteine e gli eventi 21 di segnalazione. Per studiare il ruolo meccanicistico di alcuni lipidi, agenti farmacologici anfifilici, come il ciclico oligosaccaride metil-β-ciclodestrina (MβCD), può essere utilizzato per modificare la composizione lipidica di una cella e per ridurre il colesterolo in vitro 15. Qui vi presentiamo un metodo per utilizzare HPTLC per analizzare la composizione lipidica dei neutrofili in risposta a MβCD. HPLC è stata utilizzata per confermare il livello di colesterolo nella popolazione dei neutrofili. Inoltre, si descrive un metodo per visualizzare la formazione di NET mediante immunofluorescenza microscopia in neutrofili derivati ​​dal sangue umano in risposta a MβCD.

Protocollo

La raccolta di sangue periferico in questo protocollo è stato approvato dalla commissione etica della ricerca umane locale. Tutti i soggetti umani, purché il loro consenso informato scritto.

1. Isolamento dei neutrofili Sangue umano-derivate dal gradiente di densità centrifugazione

  1. Isolamento di neutrofili derivati dal sangue umano
    1. Strato ~ 20 ml di sangue su 20 mL di sodio diatrizoato / soluzione destrano vicino a una fiamma e senza mescolare.
    2. Centrifugare per 30 minuti a 470 xg senza freno.
    3. Rimuovere le cellule mononucleari e lo strato di plasma giallastro. Trasferire la fase cellule polimorfonucleati (PMN) (seconda fase con accumulo cellule; le figure 1 e 2) in un nuovo tubo da 50 ml e riempire fino a 50 ml con soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS).
    4. Centrifugare per 10 minuti a 470 xg con freno.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di acqua sterile for 5 s per la lisi degli eritrociti.
    6. Immediatamente riempire fino a 50 ml con PBS 1x e centrifugare per 10 minuti a 470 x g.
    7. Rimuovere il surnatante. Il pellet dovrebbe essere bianco. Se è ancora rosso, ripetere i punti 1.1.5 e 1.1.6.
    8. Risospendere il pellet in 1.000 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) di media. Contare il numero di cellule utilizzando trypan colorazione blu in un emocitometro sotto un microscopio ottico.
    9. Preparare una sospensione di cellule in RPMI ad una concentrazione di 2 x 10 6 / ml. Circa 2,5 x 10 7 neutrofili possono essere raccolte da 20 ml di sangue.
  2. Il trattamento farmacologico dei neutrofili per l'analisi dei lipidi
    1. Utilizzare 5 x 10 7 cellule dal punto 1.1.9. Regolare il numero di cellule in puro soluzione salina bilanciata (HBSS) medium Hank's in presenza o assenza di 10 mM MβCD o 25 nM PMA in un volume totale di 300 microlitri in un tubo di reazione da 1,5 ml.
    2. Incubare i campioni delprovette di reazione per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
    3. Centrifugare per 10 minuti a 470 xg con freno.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 300 ml di HBSS.
    5. Centrifugare per 10 minuti a 470 xg con freno.
    6. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di cloroformio / metanolo (1: 1), omogeneizzare con una cannula da 26 G aspirando il campione in e fuori in una siringa da 1 ml per 10 volte, e conservare i campioni a -20 ° C.
  3. Il trattamento farmacologico dei neutrofili per la quantificazione NET mediante immunofluorescenza
    1. Preparare poli-L-lisina rivestite piastre da 48 pozzetti con vetrino.
      1. Posizionare un coprioggetto di vetro 8 mm in ciascun pozzetto, aggiungere 55 ml di soluzione sterile 0,01% Poli-L-lisina, e incubare per ~ 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
    2. Lavare due volte con 200 microlitri di PBS 1x. Conservare le piastre con 200 microlitri di PBS 1x per pozzetto in frigorifero fino al momento dell'uso.
    3. Autoefully aggiungere 100 ml di sospensione cellulare (2 x 10 5/100 mL) dal punto 1.1.9 per pozzetto nel centro di ogni coprioggetto.
    4. Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di una finale 10 mM MβCD o la finale di 25 nM PMA.
    5. Centrifugare per 5 min a 370 xg con freno.
    6. Incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
    7. Centrifugare per 5 min a 370 xg con freno.
    8. Fissare le cellule con 155 microlitri del 4% PFA, avvolgerli in pellicola plastica paraffina, e memorizzarli notte a 4 ° C o per 10 min a RT.
      NOTA: Per i dati sulla formazione NET indotta da MβCD, vedi Neumann et al. 15.

2. Isolamento dei lipidi e analisi dei neutrofili umani derivati ​​dal sangue

  1. Isolare i lipidi dai neutrofili periferici umani derivati dal sangue, basate su Bligh e Dyer 22 e Brogden et al. 23
    1. Prendere neutrofili dal punto 1.2.6 e disporli sul ghiaccio.
    2. Su ghiaccio, pipettare i neutrofili (presenti in metanolo e la soluzione cloroformio) in una provetta con tappo a vite 15 ml con una guarnizione di politetrafluoroetilene (PTFE) e omogeneizzare agitando per 1 min. Utilizzare tubi di vetro per impedire i lipidi di legarsi a superfici plastiche. Utilizzare PTFE tappi per prevenire la contaminazione da gomma / plastica.
    3. Aggiungere 2 mL di metanolo seguiti 1 min più tardi da 1 mL di cloroformio. Agitare ancora per 1 min.
    4. Ruotare i tubi di vetro a temperatura ambiente e 50 rpm per 30 min.
    5. Pellet la frazione proteica mediante centrifugazione della soluzione a 7 ° C e 1.952 xg per 10 min.
    6. decantare attentamente il supernatante in una nuova provetta con tappo a vite 15 mL glass, lasciando il pellet contenente proteine. Conservare il pellet a -20 ° C per il futuro quantificazione.
    7. Aggiungere 1 ml di cloroformio, attendere 1 min, aggiungere 1 ml di acqua bidistillata, e invertire il tubo coperchio a vite vetro con il campione per 30 s.
    8. Centrifugare a 7 ° C e 1.952 xg per 10 min e scarta la fase superiore, fino a, ma non incluso, lo strato nuvoloso.
    9. Se richiesto, eseguire una ulteriore fase di purificazione opzionale ripetendo il passo 2.1.8.
    10. Essiccare i campioni in un concentratore a vuoto a 60 ° C e conservarli a -20 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Alte prestazioni cromatografia su strato sottile (HPTLC) a semi-quantificare la quantità di diversi lipidi, quali colesterolo, fosfolipidi, e sfingomielina
    1. Preparare le seguenti quattro soluzioni di gestione e soluzione colorante.
      1. Soluzione 1: Mescolare acetato di etile (26,6%), 1-propanolo (26,6%), cloroformio (26,6%), metanolo (26,6%), e cloruro di potassio (9,6%). Preparare KCl sciogliendo 0,25 g di KCl in 100 mL di acqua HPLC qualità.
      2. Soluzione 2: Mescolare n-esano (73%), etere etilico (23%) e acido citrico (2%).
      3. Soluzione 3: 100% di n-esano.
      4. Preparare la soluzione colorante damiscelazione acqua distillata (90 mL) con 7,5 g di solfato di rame, e quindi aggiungere 10 ml di acido fosforico.
    2. Riempire fino a 5 mm di ciascuna soluzione in un vetro camera separata. Aggiungere qualsiasi tipo di carta da filtro per aumentare la velocità di marcia in ciascuna camera.
    3. Pre-incubare un HPTLC silice gel 60 lastra di vetro 20 x 10 cm nella prima soluzione corsa fino a che la soluzione raggiunge la marcia superiore della piastra. Poi asciugare per 10 minuti a 110 ° C.
      NOTA: Queste piastre possono essere memorizzati per un uso futuro in foglio di alluminio ed essiccati per 10 minuti a 110 ° C prima dell'uso.
    4. Sciogliere il pellet lipidica ottenuto dalla fase 2.1.10 in 200 ml di cloroformio / metanolo (1: 1) soluzione e incubare per 15 min a 37 ° C per sciogliere.
    5. Utilizzare un righello e una matita morbida, tracciare i punti di carico per il numero desiderato di campioni, più almeno uno standard. Mark distanza percorsa a circa 4 cm e 6 cm per la prima e seconda soluzione funzionamento, rispettivamente.
    6. Per caricare i campioni, lavare la siringa 10 microlitri 3 volte in cloroformio / metanolo (1: 1) prima di caricare ciascun nuovo campione. Carico 10 microlitri di ciascun campione goccia a goccia, cercando di concentrare il campione come piccola l'area possibile. I campioni devono essere caricati almeno in duplicati.
    7. Posizionare la piastra verticalmente nella prima camera con la gestione di soluzione 1 (passo 2.2.1.1). Assicurarsi che la piastra sia parallela alla parete della camera di vetro per ottenere una velocità di migrazione uniforme.
    8. Una volta che la linea del solvente ha raggiunto la prima boa, rimuovere la piastra, asciugarlo, e posizionarlo nella seconda soluzione. Ripetere i passaggi simili per il secondo e per il terzo soluzioni di funzionamento; lasciare la piastra nella soluzione fino a che il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra, quindi rimuovere e asciugare a temperatura ambiente per 1 min.
    9. Mettere piastra in una soluzione di solfato di rame per 7 s. Rimuovere la piastra, asciugare bene, e cuocere in forno per 7 minuti a 170 ° C. Attendere che il piatto si raffreddi.
    10. Using una cromatografia su strato sottile e analisi di gel, così come un software di elaborazione delle immagini, scansione e analizzare come descritto in precedenza da Brogden et al. 23.
  3. Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per quantificare la quantità di colesterolo
    1. Collegare una colonna 100 x 4,6 mm ad una cartuccia mm guardia 5 um / 4,6 e riscaldare a 32 ° C. Utilizzare metanolo come fase mobile ad una velocità di flusso di 1 ml / min a 65 bar e un rivelatore UV di misurazione a 202 nm per quantificare la quantità di colesterolo in ciascun campione.
    2. Lavare la macchina HPLC accuratamente prima di analizzare i campioni, effettuare le seguenti operazioni: pulizia della pompa, lavando l'ago, risciacquo la pentola, spurgo la siringa, e lavaggio del spurgo pompa. Lavare il tutto con acqua. Infine, eseguire la pulizia del sistema con metanolo ad una velocità di flusso di 5 ml / min per 5 min.
    3. Per stabilire una curva standard colesterolo, preparare almeno 4 concentrazioni variabilida 0,05 mg / ml a 2 mg / mL di colesterolo in cloroformio / metanolo (1: 1) 24.
    4. Risospendere campioni ottenuti dal passo 2.1.10 in 500 ml di cloroformio / metanolo (1: 1) in bottiglie di vetro da 1,5 ml di color ambra con tappo a vite rosso PTFE / silicone coperchi bianchi.
    5. Quantificare le concentrazioni di colesterolo che utilizzano lo standard preparato al punto 2.3.3.
      NOTA: inserire il protocollo di campionamento, iniziando con almeno uno standard e un controllo negativo, seguito dai campioni.
    6. Esprimere i risultati come l'area sotto la curva e confronta tra campioni appropriati utilizzando qualsiasi software statistico.
      NOTA: I risultati possono anche essere quantificati contro una curva standard e possono essere visualizzati come la quantità totale di colesterolo per mL, g, o numero di cellule. L'equazione curva standard deve essere calcolato utilizzando i valori ottenuti al punto 2.3.3.

3. Visualizzazione e quantificazione dei NET

  1. Visualization di NET
    NOTA: La visualizzazione di NET si basa sul lavoro precedentemente pubblicato da Neumann et al. 15.
    1. Lavare i campioni fissati dal punto 1.3.8 3 volte con 200 ml di PBS 1x.
    2. Blocco e permeabilize con 100 ml di 2% BSA, 0,2% Triton X-100 in PBS per pozzetto per 45 minuti a RT.
    3. Aggiungere 100 ml di anticorpi primari: topo monoclonale anti DNA-istone 1-anticorpo (diluire le azione con 2,2 mg / ml 1: 5000 in PBS contenente 2% di BSA e 0,2% Triton X-100) o anticorpo policlonale contro mieloperossidasi (MPO; coniglio anti-MPO, diluito 1: 300 in PBS contenente 2% di BSA e 0,2% Triton X-100). Incubare per una notte a 4 ° C.
    4. Lavare 3 volte con 200 microlitri di PBS 1x.
    5. Aggiungere 100 ml di anticorpo secondario (fluorescenza marcato di capra anti-topo, 1: 1.000 in BSA-PBS-Triton X-100 e di capra anti-coniglio, 1: 1.000 BSA-PBS-Triton X-100) per 1 ora a RT al buio.
    6. Lavare 3 volte con 200 & #181; L di PBS 1x.
    7. Rimuovere coprioggetto usando pinzette e posizionare a faccia in giù con 3 ml di mezzo di montaggio contenente DAPI su vetrini.
    8. Esaminare i campioni utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza confocale-base dotato di 0,75-1,25 olio HCX PL APO 40X obiettivo ad immersione 15.
  2. La quantificazione dei nuclei NET-releasing
    1. Aprire un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, ImageJ) e trascinare e rilasciare un'immagine di interesse nella barra degli strumenti.
    2. Clicca su "plugins", "analizzare" e "contro Cell."
    3. Premere il pulsante "Inizializza" nella finestra del contatore e scegliere un tipo di contatore (ad esempio, cliccare su 7 in rosso per celle NET-rilascio e 8 in giallo per cellule non-rilascio, come mostrato nella Figura 6B-i e ii).
      NOTA: I criteri di cellule NET-positive: nucleo verde Positivamente macchiato + un nucleu meno densas (perdita di lobulation) o una perdita della forma rotonda del nucleo + un aumento delle dimensioni del nucleo, o un evento di un extracellulare distinta diramazione.
    4. Istruzioni ogni aderente cella per i criteri di cui sopra e scrivere il numero di cellule contate in un foglio di dati di un software di analisi.
    5. Calcolare la percentuale di cellule NET rilasciante utilizzando i numeri di cellule contate di cellule NET rilasciante e non-rilascio.

Risultati

Neutrofili derivati dal sangue umano sono state isolate mediante centrifugazione a gradiente di densità (Figura 2). Per studiare l'effetto di alterazioni lipidiche sui neutrofili, le cellule sono state trattate con 10 mM MβCD, che esaurisce colesterolo dalla cella. Successivamente, i lipidi sono stati isolati dai campioni di Bligh e Dyer (figura 1, pannello di sinistra), come descritto da Brogden et al. 23. I campio...

Discussione

I metodi qui descritti possono essere utilizzati per analizzare specifici lipidi, come il colesterolo, per HPTLC o HPLC e per studiare gli effetti delle alterazioni lipidiche farmacologici sulla formazione di reti (vedi Neumann et al. 15).

HPTLC è un metodo relativamente economico e semplice per analizzare una vasta gamma di lipidi in un gran numero di campioni. Questo metodo è stato utilizzato in molte aree di ricerca, compresa la quantificazione antibioti...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio della Akademie für Tiergesundheit (AFT) e una borsa di studio del corso di dottorato, "Animal e zoonotiche infezioni", dell 'Università di Medicina Veterinaria, Hannover, Germania, a condizione di Ariane Neumann.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgGInvitrogenA-21070
Anti-MPOα antibodyDakoA0398
BSASigma-Aldrich3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamberCeleromicsMF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scannerLeicaDMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10xSigma-AldrichP5493-1LDilute 1:10 in water for 1x working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbedThermo Fisher Scientific35503
ExcelMicrosoft2010
DNA/Histone 1 antibodyMilliporeMAB3864
ImageJNIH1.8http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscopeVWR630-1554
Methyl-β-cyclodextrinSigma-AldrichC4555-1G
PFACarl Roth0335.3dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution
PMASigma-AldrichP8139-1MGStock 16 µM, dissolved in 1x PBS
Poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
PolymorphprepAXIS-SHIELDAN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentInvitrogenP7581
RPMI1640PAAE 15-848
HBSS with CaCl and MgSigmaH6648
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ml
TrypanblueInvitrogen15250-0610.4% solution
WaterCarl Roth3255.1endotoxin-free
NameCompanyCatalog Number Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanolSigma-Aldrich33538
10 µL syringeHamilton701 NR 10 µl
Diethyl etherSigma-Aldrich346136
Ethyl acetateCarl Roth7336.2
Canullla 26 GBraun4657683
Copper(II)sulphatepentahydrateMerck1027805000
ChloroformCarl Roth7331.1
CP ATLAS softwareLazarsoftware2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm columnMerck152022
High Performance Liquid Chromatograph ChromasterHitachiHITA 892-0080-30YParamaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV DetectorHitachi5410
HPLC Column OvenHitachi5310
HPLC Auto SamplerHitachi5260
HPLC PumpHitachi5160
MethanolCarl Roth7342.1
n-HexaneCarl Roth7339.1
Phosphoric acidSigma-Aldrich30417
Potassium chlorideMerck49,361,000
PottersLAT Garbsen5 ml
SDSCarl RothCN30.3
HPTLC silica gel 60Merck105553
Vacufuge plus basic deviceEppendorf22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottomSigmaCLS3548
CoverslipThermo Fisher Scientific1198882
Glass slideCarl Roth1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 mLBD Bioscience309659

Riferimenti

  1. Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
  2. Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
  3. Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
  4. Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
  5. Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
  6. Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
  7. Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
  8. Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
  9. Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
  10. Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
  11. Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
  12. Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
  13. Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
  14. Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
  15. Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
  16. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  17. von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
  18. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  19. Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
  20. Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  21. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
  22. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  23. Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
  24. Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
  25. Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
  26. Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
  27. Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
  28. Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
  29. Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
  30. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
  31. Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
  32. Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
  33. Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
  34. Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
  35. Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
  36. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  37. Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
  38. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  39. Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
  40. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Immunologianeutrofilineutrofili extracellulare Trappole retiColesteroloMetil ciclodestrina M CDcromatografia liquida ad alta prestazione HPLCad alte prestazioni cromatografia su strato sottile HPTLC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati