Determinazione metabolismo del glucosio Cinetica Utilizzando<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG micro-PET / TC

Riepilogo

This study describes a protocol that uses ¹⁸F-FDG and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging, together with kinetic modelling, to quantify the in vivo, real-time uptake of ¹⁸F-FDG into tissues.

Abstract

This paper describes the use of ¹⁸F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). Impaired uptake and metabolism of glucose in multiple organ systems due to insulin resistance is a hallmark of type 2 diabetes. The ability of this technique to extract an image-derived input function from the vena cava using an iterative deconvolution method eliminates the requirement of the collection of arterial blood samples. Fitting of tissue and vena cava time activity curves to a two-tissue, three compartment model permits the estimation of kinetic micro-parameters related to the ¹⁸F-FDG uptake from the plasma to the intracellular space, the rate of transport from intracellular space to plasma and the rate of ¹⁸F-FDG phosphorylation. This methodology allows for multiple measures of glucose uptake and metabolism kinetics in the context of longitudinal studies and also provides insights into the efficacy of therapeutic interventions.

Introduzione

Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare una tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT) metodologia basata quantificare in vivo, captazione tempo reale del glucosio dal flusso sanguigno nei tessuti specifici nei topi. Ciò è stato ottenuto utilizzando fluorodeossiglucosio ¹⁸ F-marcato (FDG) per misurare l'assorbimento di glucosio e modellazione cinetica per stimare i tassi di ¹⁸ F-FDG dal plasma allo spazio intracellulare, la velocità di trasporto dallo spazio intracellulare al plasma e il tasso di ¹⁸ F-FDG fosforilazione.

Nei roditori, ¹⁸ F-FDG è stato utilizzato nella valutazione pre-clinica di numerosi trattamenti contro il cancro ^1, studi di progressione del tumore ² e il metabolismo del tumore ³ così come l'imaging di depositi di grasso bruno, ⁴ neuroinflamation ⁵ e il cervello metabolismo ⁶ .

I metodi tradizionali utilizzati per esaminare l'assorbimento specifico tissutale di glucosio nel topo e nel ratto () comportano generalmente il trattamento con 2-deossiglucosio radiomarcato sia con ³ H o ¹⁴ C seguita da eutanasia, raccolta dei tessuti e misura della radioattività in ogni tessuto ^7. L'uso della PET / CT consente per la determinazione non invasiva di assorbimento del glucosio e del metabolismo in molteplici organi e regioni contemporaneamente di animali vivi. Inoltre, come eutanasia non è un requisito, questa tecnica è adatto per l'uso in studi longitudinali.

Diabete mellito tipo 2 (DM2) è caratterizzata da metabolismo del glucosio e perturbato iperglicemia secondaria a ridotta risposta dei tessuti all'insulina (insulino-resistenza) e l'incapacità di -cellule pancreas a produrre adeguate quantità di insulina ^8. analisi cinetica di assorbimento del glucosio e il metabolismo può fornire importanti intuizioniil meccanismo d'azione e l'efficacia di interventi terapeutici e consentire il monitoraggio avanzato di progressione della malattia.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo studio sono stati approvati dal Sydney locale Distretto Sanitario e Università di Sydney animali Comitati Etici e seguito la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio, Ottava edizione (2011).

1. Preparazione animale

NOTA: In questo protocollo maschio db / topi db (BKS.Cg- Dock7 ^m + / + Lepr ^db / J) sono state mantenute in caso di coabitazione con accesso ad libitum a chow e acqua fino a 6 settimane di età. Al momento della formazione immagine, i topi hanno pesato ~ 30 g. Tutti i topi utilizzati in questo protocollo erano a digiuno i livelli di glucosio nel sangue tra 10 e 14 mmol / L.

1. Se necessario, digiunare i topi. Nel presente esempio, digiunare i topi per 5 ore prima della procedura sperimentale.
2. Trattare i topi con l'agente desiderato (ad esempio farmaci, proteine, peptidi) prima dell'inizio delle immagini. In questo esempio, somministrare un'iniezione sottocutanea di insulina (3volume equivalente U / kg di insulina umana) o PBS 30 min prima dell'inizio di imaging.

2. flusso di lavoro configurato

NOTA: Questo protocollo è stato implementato su uno scanner PET / TC. Acquisire dati PET prima, seguita dalla acquisizione di dati CT.

1. Impostazioni in PET:
   1. Selezionare isotopo come ¹⁸ F, impostare la durata della scansione di 3.600 s, e il livello di discriminazione di energia superiore e inferiore a 350 keV - 650 keV (default) con una finestra di temporizzazione coincidenza di 3.432 ns (default). Istogramma dati list-mode in 16 fotogrammi (6 × 10 s, 4 × 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) per il periodo 0 - 60 min dopo l'iniezione del tracciante. Ricostruire emissione sinogrammi utilizzando 2D-FBP con uno zoom 1.5.
      NOTA: Le immagini ricostruite consisteva di 16 fotogrammi dinamici, ciascuno con 128 × 128 × 159 voxel e una dimensione voxel di 0,52 × 0,52 × 0,796 millimetri ^3.
2. Impostazioni CT:
   1. Perun'intera scansione del corpo CT, impostare la corrente a 500 A, tensione a 50 kV, tempo di esposizione di 500 ms e 200 proiezioni su una rotazione di 360. Impostare il campo di visione del rivelatore (FOV) a 30.722.048, numero di posizioni letto a 3 (per coprire tutta la gamma FoV PET), sovrapposizione tra le posizioni letto = 30,234,713 mila% e rivelatore categorizzazione 4.
      NOTA: ricostruzione TC è stata eseguita utilizzando cone beam tomografia software di ricostruzione dell'immagine con calibrazione HU, interpolazione bilineare e filtro Shepp-Logan.
3. ¹⁸ F-FDG:
   1. Ordinare sufficiente ¹⁸ F-FDG (ad esempio 450 MBq in 0,5 mL) da un fornitore locale per arrivare ~ 30 minuti prima della prima iniezione. Aliquotare e diluire il ¹⁸ F-FDG in modo che gli animali ricevono ~ 10 MBq di ¹⁸ F-FDG in un volume finale di 0,1 mL.

3. Protocollo Imaging

1. Pulire camera di induzione e letto di imaging con 80% (v / v) di etanolo per mantenere condizioni asettiche. PlaCE Il topo in una camera di induzione e anestetizzare con 5% isoflurano in ossigeno.
2. Posizionare il mouse su un letto di immagini dotato di un rilievo di riscaldamento elettrico per mantenere la temperatura corporea ed una precisione vaporizzatore naso cono per fornire isoflurano (manutenzione, 1,5 - 2%) ad una portata di 1 l / min. Applicare una pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. Posizionare il mouse in posizione prona su un tappetino sensore per monitorare la respirazione e garantire un adeguato piano di anestesia viene mantenuta.
4. Riscaldare la coda usando un pacchetto di calore per 1 - 2 min per dilatare la vena della coda laterale. Cateterizzarla vena caudale laterale inserendo un ago da 30 gauge nella vena caudale laterale. Fissare l'ago in posizione con colla chirurgica e fissare il catetere.
5. Imaging carico bed nello scanner e spostare il letto attraverso la macchina in modo che il catetere può essere accessibile dal retro della macchina.
6. Fissare il catetere alla siringa ¹⁸ F-FDG in uno syrautista Inge. Calcolare l'esatta dose di ¹⁸ F-FDG (10 MBq) in base all'attività in siringa prima dell'iniezione e il volume da somministrare (<100 uL, iniettati in 10 s).
7. Per minimizzare l'impatto dell'anestesia variabilità di captazione del glucosio, assicurano una costante di tempo tra l'induzione di anestesia e iniezione di ¹⁸ F-FDG (ad esempio, 30 minuti).
8. Iniziare la PET immediatamente prima dell'iniezione di ¹⁸ F-FDG. Dopo aver terminato il PET (3.600 s), eseguire una TAC (~ 10 min) per consentire un co-registrazione del radiofarmaco captazione con i tessuti.
9. Spostare il letto di imaging alla posizione di partenza, rimuovere l'animale dal letto.
10. A questo punto l'eutanasia l'animale o lasciarlo recuperare:
    1. Per eutanasia, eseguire dislocazione cervicale mentre ancora sotto anestesia e raccogliere organi di interesse per la successiva analisi.
    2. Se permette il mouse per recuperare, posizionare il mouse in unico alloggiamento su una piastra elettrica odavanti ad una lampada riscaldante. Monitorare il mouse fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Lasciare che il mouse per recuperare per 1 ora prima di tornare alla casa di gruppo.

4. PET Image Processing

NOTA: la ricostruzione delle immagini è stata effettuata utilizzando il software di acquisizione sul posto di lavoro v1.5.0.28 e analisi in v4.2 software di ricerca sul posto di lavoro.

1. Co-registro CT e PET immagini e per assicurare che l'allineamento è corretto nelle 3 dimensioni.
   1. Nel menu 'File', selezionare 'Ricerca cartella / Importa' e selezionare la cartella contenente i dati. Selezionare i dati PET e CT desiderati e fare clic sulla scheda 'analisi generale'.
   2. Ordina i dati in modo che il CR è designato 'Source' e PET è designato 'target'. Nel menu 'workflow', selezionare 'registrazione'. Se le immagini richiedono una regolazione di essere correttamente co-registrati, utilizzare gli strumenti in thmenù e 'Registrazione'.
2. Nel menu 'workflow', selezionare 'ROI Quantificazione'.
   1. Usare le funzioni del 'Pan' e 'Zoom' nella scheda 'Immagine' per individuare la regione desiderata. Nel menu 'Strumenti', selezionare la scheda 'Crea' e fare clic sull'icona pennello. Disegnare il ROI sull'immagine
3. Estrarre le curve tempo-attività selezionando 'Salva ROI Quantificazione' dal menu 'Salva'. Salvare i dati in un file CSV.
4. Quantificare la radioattività assorbimento come Bq per cm ³ di tessuto. Convertire i valori in percentuale della dose iniettata per cm ³ (% ID / cm ³⁾ caricando il file CSV in un foglio di calcolo.

Funzione 5. Ingresso

1. Per correggere la funzione di diffusione del punto di sistema, deconvolve PSF sistema stimato per 5 iterazioni con il metodo deconvoluzione Van Cittert reblurred come descritto in precedenza ^9.
   NOTA: Questo è necessario a causa delle piccole dimensioni della vena cava in un mouse.
2. Utilizzare immagini postali deconvoluzione per generare una curva di funzione tempo di attività di ingresso del sangue come descritto sopra.

6. Modellazione cinetica

NOTA: I due-tessuto modello vano FDG (Figura 1) richiede la funzione di ingresso plasma.

1. Convertire la funzione di ingresso del sangue nel file CSV per la funzione di ingresso al plasma usando la seguente equazione ^10: Input_plasma = × Input_blood (0,386 e ^{- 0.191t} + 1.165).
2. Nello strumento di modellazione cinetica fare clic sul pulsante 'cinetica'. Importa il tessuto e l'attività plasmatica totale contano file CSV nel strumento di modellazione cinetica selezionando 'tempo di caricamento Activity Curve' dal 'Menu'.
3. Nel menu 'Modello' selezionare 2 compartimenti. Assicurarsi che la casella accanto a k4 non è selezionatae inserire un valore di 0. Per il montaggio iniziale, deseleziona la casella vB (frazione di volume del sangue) e inserire un valore di 2%.
4. Fare clic sul 'area corrente Fit'. Correggere la regione estratto di interesse per dispersione ^{11, 12.} Raggiungere questo minimizzando il valore del chi-quadro per il modello FDG per diversi tempi di dispersione.
5. Eseguire una seconda forma utilizzando valore vB galleggiante (seleziona la casella accanto alla casella per VB) e il valore di dispersione ottimizzata per calcolare le costanti di velocità regionali (k ₁ -k _3). Calcolare l'afflusso regionale costante K _i = (k ₁ × k ₃₎ / (k + ₂ k _3).

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Risultati

Abbiamo già usato il / modello di topo db db per studiare l'impatto di aumentare i livelli plasmatici di apoA-I sulla cinetica di assorbimento del glucosio e del metabolismo ^13. In questo studio abbiamo utilizzato topi db / db trattati con insulina per dimostrare l'utilità delle immagini PET / CT di monitorare l'assorbimento di ¹⁸ F-FDG dal plasma nel muscolo gastrocnemio in tempo reale.

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Discussione

Il protocollo qui descritto rappresenta una robusta metodologia, non invasivo per determinare la cinetica di assorbimento del glucosio dal sangue nel tessuto e la successiva metabolizzazione nei topi.

Il topo db / db è un è un modello animale ben consolidata di diabete di tipo 2 ¹⁴ che è stato ampiamente utilizzato per esaminare la resistenza all'insulina e interventi rilevanti. Tuttavia, studi precedenti hanno quantificato solo endpoint assorbimento nel cuore ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PET/CT Scanner	Siemens	Inveon
18F-FDG	PETNET Solutions
Isoflurane	Pharmachem
30 guage needle	BD	305106
PMOD modelling software	PMOD Technologies
BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratory	000642
Human insulin	Sigma-Aldrich