Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture e il suo uso in Antimicrobial Host Defense Studies

Riepilogo

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

Abstract

L'intestino mostra un'architettura di strutture cripta ripetitive costituite da diversi tipi di cellule epiteliali, propia lamina contenente cellule immunitarie, e stroma. Tutte queste cellule eterogenei contribuiscono a omeostasi intestinale e partecipare a difesa ospite antimicrobica. Pertanto, l'identificazione di un modello di surrogato per studiare la risposta immunitaria e attività antimicrobica dell'intestino in un ambiente in vitro è estremamente impegnativo. Gli studi in vitro utilizzando linee cellulari epiteliali intestinali immortalato o cripta addirittura primario organoide cultura non rappresentano l'esatta fisiologia intestinale normale e del suo microambiente. Qui, si discute un metodo di tessuto del colon coltura del mouse in un piatto di cultura e di come questo organo ex vivo sistema di coltura può essere implementato in studi relativi a risposte di difesa antimicrobici ospitanti. In esperimenti di rappresentanza, abbiamo dimostrato che i due punti nella cultura d'organo esprimono peptidi antimicrobici in response per esogena IL-1β e IL-18. Inoltre, le molecole effettrici antimicrobiche prodotte dai tessuti del colon nella cultura organo uccidono efficacemente Escherichia coli in vitro. Questo approccio, pertanto, può essere utilizzato per analizzare il ruolo dei modelli molecolari di patogeni e pericolo associati ed i loro recettori cellulari nella regolazione intestinale risposte immunitarie innate e risposte di difesa antimicrobiche dell'ospite.

Introduzione

L'intestino rappresenta un sistema dinamico che agisce come una barriera per i microrganismi commensali, combatte contro patogeni, e regola la composizione microbica ^1. Le cellule epiteliali intestinali, composto da enterociti, cellule caliciformi, le cellule e le cellule Paneth enteroendocrine, sono le principali popolazioni di cellule che forniscono accoglienza risposte di difesa contro microbiota intestinale. Le cellule caliciformi producono mucine che creano una zona smilitarizzata sulla parte superiore dello strato epiteliale ^2. Le cellule Paneth e enterociti producono peptidi antimicrobici, citochine, e specie di ossigeno e di azoto reattivo che costituiscono antimicrobici risposte di difesa dell'ospite e contribuiscano a dare forma alla composizione microbica intestinale ^{3, 4.} In aggiunta alle cellule epiteliali, le cellule immunitarie compresi macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, cellule natural killer, linfociti e inna cellule linfoidi te nella lamina propria e sottomucosa giocano un ruolo critico nella intestinali risposte di difesa ospite antimicrobici da citochine, chemochine, che producono e altri mediatori ^{5 - 7.} Per comprendere come il sistema immunitario mucosale regola microflora e fornisce protezione contro l'infezione microbica, è importante considerare la complessa interazione delle popolazioni cellulari eterogenee dell'intestino. Tuttavia, un modello in vitro che comprende tutte le caratteristiche dell'intestino non è disponibile. Pertanto, gli studi molecolari sulla interazione ospite-patogeno a livello intestinale sono altamente impegnativo.

Nel corso degli ultimi anni, diversi sistemi modello che imitano gli aspetti della mucosa intestinale sono stati sviluppati per indagare i processi fisiopatologici coinvolti nelle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) e altri disturbi gastrointestinali ^{8 -}= "xref"> 14. linee di cellule epiteliali intestinali immortalati sono spesso usati per studiare le risposte specifiche delle cellule epiteliali. Tuttavia, a causa di espressione genica differenziale e funzione in cellule immortalizzate, i dati ottenuti dal usando tali cellule non coincidono spesso con quelli osservati negli studi in vivo. Cripta intestinale organoide cultura è emerso recentemente come un potenziale strumento per valutare la risposta del epitelio intestinale a stimoli diversi ^13. In questo sistema, le cellule staminali cripta sono autorizzati a crescere e sviluppare una struttura organoide 3D. Mentre il sistema di coltura organoide è molto utile per studiare molti aspetti dell'epitelio intestinale, che non imita la complessa interazione di cellule immuni, cellule epiteliali e prodotti microbici. La cultura ex vivo del tessuto intestinale offre una migliore rappresentazione in vivo ospitanti risposte di difesa. In questo metodo, una parte dell'intestino è coltivato in un piatto bianco coltura cellulareh mezzi appropriati che offrano i diversi tipi di popolazioni cellulari nell'intestino di essere metabolicamente attivi per almeno 48 ore. Così, un ex vivo coltura dell'organo può essere usato per misurare l'espressione di geni antimicrobici e l'host risposte di difesa dell'intestino ad uno stimolo particolare.

Gli investigatori hanno utilizzato il sistema d'organo ex vivo della cultura per studiare ospitanti risposte di difesa contro l'infezione microbica nell'intestino ^15-21. Recentemente abbiamo adottato il sistema di coltura di organi per studiare il ruolo del inflammasome nelle risposte di difesa antimicrobici ospitanti in due punti di topo ^22. Il inflammasome è una piattaforma molecolare per l'attivazione della caspasi-1, che è richiesto per la produzione di IL-1β maturato e IL-18. Abbiamo dimostrato che IL-1β e IL-18 inducono peptidi antimicrobici che uccidono efficacemente pathobionts commensali come E. coli . Questa osservazione è coerente con un aumento coli onere E. in due punti del mouse inflammasome-difettoso ^22. Questo sistema può quindi essere utilizzato per studiare il ruolo dei recettori pattern recognition (PRR) e di altre molecole immunitarie innate in intestinali risposte di difesa ospite antimicrobici nonché patogenesi dei disturbi intestinali come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e il cancro del colon-retto (CRC). Ci sono più di 200 geni di suscettibilità IBD, e mutazioni in molti di questi geni sono associati con alterata composizione microbica nell'intestino. E 'di grande importanza clinica per determinare il meccanismo preciso attraverso il quale i geni IBD-suscettibilità regolano flora intestinale. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di introdurre un protocollo di base di ex vivo della cultura d'organo del colon e dimostrare come questo metodo di coltura può essere usato per studiare antimicrobici risposte di difesa ospite dell 'intestino.

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti qui sono stati effettuati utilizzando 6-8 settimane di età topi maschi wild-type (C57BL6 / J) mantenuto in libera una struttura specifica patogeno (SPF) presso il Centro risorse animali (ARC), UT Southwestern Medical Center. Tutti gli studi sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) e sono state condotte in conformità con le linee guida IACUC e il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Raccolta e preparazione del colon

1. Euthanize topi con CO ₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale.
2. Spray topi con il 70% di etanolo e il pin arti per una scheda di pinning mantenendo il lato del mouse dorsale verso il basso sul tabellone.
3. Utilizzando forbici e pinze pre-sterilizzati dissezione, fare una incisione linea mediana nel peritoneo dell'addome. Aprire l'addome piegando il peritoneo con una pinza.
4. Rimuovere l'intestino dalla cavità addominale wiesimo dissezione pinze e forbici. Separare il colon dal piccolo intestino tagliando al fondo cieco e l'altra estremità al retto.
5. Posizionare i due punti in una capsula di Petri sterile contenente ghiacciata PBS. Lavare il contenuto del lume del colon con PBS freddo utilizzando una siringa da 20 ml in possesso di un ago G 20 o un ago sonda gastrica fino feci nel lume del colon è completamente rimosso.
6. Tagliare i due punti con le forbici in senso longitudinale. Lavare il colon agitando vigorosamente in PBS ghiacciato in una piastra di Petri sterile.
7. Tagliare il tessuto del colon in pezzi lunghi circa 1 cm con un bisturi sterile o forbici.
8. Registrare il peso dei pezzi colon.
   NOTA: tutti i passaggi della sezione 1 possono essere eseguite sia all'interno che all'esterno di una cappa di sicurezza biologica. Una volta che i due punti sono pronti per la cultura, tutti i passaggi devono essere eseguiti all'interno di una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità.

2. Colon Orguna cultura

1. Inserire un filtro cella (100 micron) su una piastra di coltura cellulare 6 pozzetti. Trasferire tutti i pezzi colon raccolti da un topo nel filtro cella.
2. Aggiungere 5 ml di terreno DMEM / F12 contenente il 5% di FBS, penicillina-streptomicina (1x), e Gentamicina (20 mg / ml). coprire completamente i pezzi del colon con i media.
3. Incubare per 2 ore a 37 ° C in un incubatore con 5% di CO ₂ e dell'aria 95%.
4. Sollevare il filtro delle cellule e aspirare i media.
5. Posizionare il filtro delle cellule di nuovo sul bene e aggiungere 5 ml di mezzi freschi senza antibiotici. Sollevare il filtro delle cellule e aspirare i media.
6. Ripetere la stessa operazione di lavaggio (passo 2,5) altre due volte (3x totale) per rimuovere tutti i residui antibiotici.
7. Trasferire i pezzi colon da una singola colino cellula in un singolo pozzetto di una piastra di coltura cellulare sterile 12 pozzetti.
8. Aggiungere DMEM medio / F12 contenente 5% FBS (senza antibiotici). Regolare il volume del mezzo con il weight dei pezzi colon, ad esempio, 1 medio ml per 100 mg di tessuto. Incubare per 12 ore a 37 ° C in un incubatore iniezione 5% di CO ₂ e dell'aria 95%.
9. Raccogliere il supernatante della coltura in una provetta sterile da 1,5 ml.
10. Centrifugare a 12.000 xga 4 ° C per 5 min. Separare il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml per uso nei batteri uccidendo dosaggio e / o altri saggi immunitari. Il supernatante può essere conservato a -80 ° C fino alla dosaggio.
11. Raccogliere i pezzi del colon in un tubo per l'isolamento di RNA.

3. E. coli Analisi Uccidere

1. Seminare E. coli in 5 mL Luria-Bertani (LB) brodo in una provetta da 15 ml e incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm durante la notte. Mantenere il tappo della provetta leggermente allentato.
2. Centrifugare la provetta di coltura batterica a 1.200 xg per 10 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet batterico in 5 ml di PBS ghiacciato.
3. Trasferire 1 ml della bactsospensione erial nella cuvetta e misurare OD a 600 nm. Utilizzare PBS come bianco.
4. Calcolare l'unità formanti colonia (cfu) utilizzando una curva standard prestabilito. Qui, si supponga che 1 OD = 2 x 10 ⁹ CFU / ml (circa).
5. Diluire la sospensione batterica per rendere la sospensione madre 1 x 10 ⁵ CFU / ml.
6. Trasferire il surnatante cultura colon organo (500 microlitri / pozzetto) raccolte nella sezione 2.10 nei pozzetti duplicati di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti.
7. Aggiungere 10 ml cultura coli E. (1.000 ufc) in un pozzetto contenente 500 microlitri colon organo cultura surnatante. Lasciare l'altra e senza alcun coli inoculazione E. per confermare che la cultura surnatante colon organo non contiene alcuna contaminazione.
8. Incubare lo stesso numero di batteri (1000 cfu) nei mezzi di coltura (DMEM / F12 più 5% FBS) senza antibiotici come controllo.
9. Incubare a 37 ° C per 1 h.
10. Mettere 50 ml di ogni campione drop-wiSE su piastre di agar MacConkey. Incubare le piastre MacConkey agar a 37 ° C durante la notte.
11. Contare il numero di colonie e calcolare la ufc / ml.

4. L'effetto di fattori estrinseci ed intrinseci sul colon antimicrobici Host Difesa Risposte

NOTA: Il saggio uccisione antimicrobico come descritto qui può essere adottato per esaminare l'effetto dei modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e citochine sull'attività battericida della cultura d'organo surnatante. Un esempio di tale esperimento utilizzando IL-1β e IL-18 è descritta di seguito.

1. Raccogliere i due punti di topi come descritto nella Sezione 1.
2. Posizionare i due punti su un tovagliolo di carta sterile. Tagliare il colon longitudinalmente in tre parti con le forbici (Figura 2).
3. Lavare ogni parte del colon in ghiaccio freddo PBS come descritto nella Sezione 1.
4. Tagliare ogni parte del colon in piccoli pezzi e pesare in modo asettico. Trasferire i pezzi di ogni partedel colon in tre filtri di cellule separate (100 micron) disposte su tre pozzetti di una piastra di coltura cellulare 6 pozzetti (Figura 2).
5. Aggiungere 2 ml di DMEM medio / F12 contenente il 5% di FBS, penicillina-streptomicina (1x), e Gentamicina (20 mg / ml).
6. Incubare per 2 ore a 37 ° C in un incubatore iniezione 5% di CO ₂ e dell'aria 95%.
7. Lavare i pezzi del colon, come descritto nella 2,4-2,6. Trasferire i pezzi colon di un singolo colino cellula in un singolo pozzetto di una piastra di coltura cellulare sterile 12 pozzetti. I tre pozzetti contenenti tre parti del colon da un singolo mouse dovrebbero essere designati come greggia, IL-1β e IL-18 (Figura 2).
8. Aggiungere DMEM medio / F12 contenente 5% FBS (senza antibiotici). Regolare il volume del mezzo con il peso dei pezzi colon, ad esempio, 1 ml di mezzo per 100 mg di tessuto.
9. Stimolare la cultura organo colon con IL-1β (20 ng / ml) o IL-18 (20 ng / ml) per 12 h. I due punti non trattati cultura organo serve come controllo.
10. Dopo 12 h di incubazione a 37 ° C in un incubatore iniezione 5% di CO ₂ e il 95% di aria, raccogliere il supernatante della coltura in una sterile 1,5 mL provetta.
11. Trasferire 500 microlitri cultura surnatante in pozzetti duplicati di un 24-pozzetti.
12. Seminare E. coli (1.000 CFU) nel colon organo cultura surnatante come descritto nella Sezione 3. Per ogni condizione, inoculare E. coli in un singolo pozzo. L'altro pozzetto contenente stesso organo cultura surnatante senza E. coli servirà come controllo per la contaminazione batterica.
13. Incubare la stessa quantità di batteri in terreni di coltura senza antibiotici come controllo.
14. Incubare a 37 ° C per 1 h.
15. Mettere 50 ml di ogni campione goccia a goccia su piastre di agar MacConkey. Incubare le piastre MacConkey agar per una notte a 37 ° C.
16. Contare il numero di colonie e calcolare la ufc / ml (Figura 4).

e_title "> 5. Misurazione della espressione dei geni antimicrobici

1. Dopo incubazione per una notte (12 ore) di cultura d'organo del colon, come descritto nelle sezioni 2 e 4, lavare i pezzi del colon con 2 ml ghiacciata PBS (2x).
2. Raccogliere i pezzi del colon in una provetta libera tappo a vite 2 ml RNasi / DNasi. Mettere i tubi in ghiaccio.
3. Aggiungere 1 ml di reagente Trizol commerciale e lisi perline matrice nel tubo.
4. Lyse il tessuto utilizzando un omogeneizzatore tessuto automatizzato.
5. Raccogliere il lisato di tessuto in una nuova provetta.
6. Isolare RNA utilizzando il protocollo standard.
7. Misurare la concentrazione di RNA.
8. Diluire RNA opportunamente con acqua deionizzata e utilizzando 500 ng di RNA per sintetizzare cDNA.
9. Utilizzare il cDNA per real-time RT-PCR dei geni mirati antimicrobici, citochine, chemochine, e altri geni di interesse.

Risultati

Un quadro rappresentativo di due punti nella cultura d'organo è mostrato in Figura 1. I pezzi del colon nella cultura rimangono metabolicamente e fisiologicamente attiva. Essi rispondono in modo efficace agli stimoli esogeni aggiunti al mezzo di coltura. Un flusso di lavoro schematica della preparazione del tessuto colon per coltura ex vivo e stimolazione con stimoli esogeni, per esempio IL-1β e IL-18, è mostrata in figura 2. I d...

Discussione

Le cellule epiteliali intestinali sono molto sensibili in termini di requisiti di crescita e quindi difficile da coltura. Le cellule epiteliali isolate mediante trattamento EDTA non sopravvivono in mezzi di coltura cellulare convenzionali come DMEM ^8. Pertanto, studi di interazione ospite-patogeno utilizzando cripta isolata o cellule epiteliali primarie sono molto impegnativo. Recentemente, Sato et al. descritto un sistema di coltura organoide cripta che è molto promettente e utile per gli studi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/ F12	Life Technologies	12634-010
Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride	Sigma	5634
FBS, heat inactivated	Sigma	F4135
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063
Gentamicin solution	Sigma	G1272
Mouse IL-1b recombinan	Reprokine	RKP10749
Mouse IL-18 recombinant	Reprokine	RKP70380
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Difco Luria-Bertani Broth	BD Bioscience	244620
BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar	Fisher Scientific	DF0075-17-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		Uded to measure RNA concentration
UV/Vis Spectrophotometer	BECKMAN	DU 530	Used to determine E. coli count
iScript RT Supermix, 100 rxns	Bio-Rad	1708841
iTaq Univer SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725125
Lysing Matrix S (1/8"), 2 ml Tube	MP Biomedicals	116925500	Used to homgenize colon organ for RNA isolation
FastPrep-24 5G System	Bio-Rad	116005500
100 mm x 15 mm Petri Dish	Falcon	5687
Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile	Cellstar	5085
100 μm cell strainer	Falcon	5698
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Sorvall ST40R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Forma Scientific orbital shaker	Thermo Fisher Scientific