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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

Abstract

In colture hippocampal fetta organotipiche (OHSC), le caratteristiche morfologiche e funzionali di neuroni e cellule gliali sono ben conservate. Questo modello è adatto per affrontare questioni di ricerca diversi che coinvolgono studi sulla neuroprotezione, esperimenti elettrofisiologici sui neuroni, reti neuronali o l'invasione del tumore. L'architettura hippocampal e attività neuronale nei circuiti multisinaptici sono ben conservati in OHSC, anche se la stessa procedura per affettare inizialmente lesioni e conduce alla formazione di una cicatrice gliale. La formazione della cicatrice presumibilmente altera le proprietà meccaniche e comportamento diffusivo di piccole molecole, ecc. Fette di consentono il monitoraggio dei processi dipendenti tempo dopo il trauma cranico senza chirurgia animale e gli studi sulle interazioni tra vari tipi di cellule di cervello-derivato, vale a dire gli astrociti, microglia e neuroni sotto sia fisiologiche che patologiche condizioni. Un aspetto ambivalente di questo modello è l'assenza di flusso di sangue e le cellule immunitarie del sangue. Durante la progressione della lesione di un neurone, migrazione di cellule immuni dai giochi un ruolo importante di sangue. Come quelle cellule mancano in fette, i processi intrinseci nella cultura possono essere osservati senza interferenze esterne. Inoltre, in OHSC la composizione dell'ambiente medio-esterno è controllata con precisione. Un ulteriore vantaggio di questo metodo è il più basso numero di animali sacrificati rispetto alle preparazioni standard. OHSC diversi possono essere ottenuti da un animale, rendendo possibile la simultanei studi con trattamenti multipli in un animale. Per questi motivi, OHSC sono ben si adatta per analizzare gli effetti di nuove terapie protettive dopo danno tissutale o durante l'invasione del tumore.

Il protocollo presentato qui descrive un metodo di preparazione di OHSC che permette di generare altamente riproducibili, ben conservato fette che possono essere utilizzati per una varietà di ricerca sperimentale, come studi di invasione del tumore o di neuroprotezione.

Introduzione

OHSC sono un modello ben caratterizzati in vitro per studiare proprietà fisiologica e patologica di neuroni, astrociti e microglia1. È facile controllare l'ambiente extracellulare e monitorare i cambiamenti morfologici e cellulari dopo vari stimoli. L'organizzazione dei neuroni ippocampali e le loro connessioni sono ben conservati dopo preparazione2,3. Fuori parecchi vantaggi, OHSC consentire il monitoraggio dell'invasione del tumore e lesioni di cervello senza chirurgia degli animali. Sei-otto OHSC ottenibile da un singolo cervello del roditore. OHSC consentono pertanto significativamente ridurre il numero di animali e test più concentrazioni nella droga, manipolazioni genetiche o modelli differenti della lesione dello stesso animale. Nelle analisi basate su fetta, condizioni sperimentali possono essere controllate con precisione. Inoltre, può essere facilmente monitorato lo sviluppo dipendente dal tempo di condizioni patologiche come danni secondari da formazione immagine di time-lapse.

Nel protocollo specificato, originariamente costituito da Stoppini et al. 4, le operazioni di preparazione sono descritte e importanti punti di riferimento morfologici per la selezione delle fette appropriati vengono evidenziati. Si consiglia la preparazione postnatale giorno 7-9 ratti o topi postnatale giorno 4-5. In questi periodi, OHSC mostrano una robusta resistenza a traumi meccanici e un elevato potenziale di riorganizzazione dei circuiti neuronali. Al contrario, preparati dai ratti embrionali o adulti rapidamente cambiare la loro struttura e perdono la loro morfologia organotipiche durante la coltivazione e quindi sono meno adatti per lo studio dei processi a lungo termine in ricerca di base5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. un altro punto critico per il tasso di sopravvivenza di OHSC è lo spessore della fetta stessa, come la diffusione e quindi l'apporto nutritivo sono limitata12,13,14.

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Protocollo

gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo criteri di etica e la politica di uso di animali nella ricerca in neuroscienza, come approvato dall'europeo comunità Consiglio direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio dell'Unione europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

1. preparazione degli strumenti e mezzi di coltura

  1. per la preparazione di OHSC utilizzare il seguente set di strumenti: due piccole forbici, due Pinzette curve, una pinzetta con punta sottile, tre lame (due di dimensioni 11, uno di dimensioni 15), tre titolari di bisturi, tondo di carta da filtro (diametro: 35 mm), agar, una lama di rasoio, uno non modificato pipetta Pasteur, e uno per volta pipetta Pasteur senza un suggerimento. Sterilizzare tutti i materiali in autoclave prima dell'uso ( Figura 1).
  2. Pesare 5 g di agar e dissolverlo in 100 mL di acqua distillata. Sterilizzare la soluzione per 20 min a 121,7 ° C a 210,8 kPa in autoclave. Distribuire la soluzione di liquido agar 3 mL in piastre di Petri 60-mm utilizzando una pipetta di vetro sterile, lasciarlo solidificare per 5 h, coprire con la pellicola di plastica paraffina per evitare contaminazione e conservare a 4 ° C fino al successivo utilizzo. Blocchi di agar sono necessari per stabilizzare il cervello durante la procedura d'affettatura.
  3. Media
    1. fare 200 mL di terreno preparazione (pH 7,35) costituito da 198 mL di terreno minimo essenziale (MEM) e 2 mL di soluzione di L-Glutammina (concentrazione finale di 2 mM). Preparare la soluzione il giorno della preparazione media e conservarla a 4 ° C.
    2. Preparare 100 mL di terreno di coltura costituito da 49 mL MEM, 25ml Hanks ' equilibrato soluzioni saline (HBSS), 25 mL (v/v) di siero di cavallo normale (NHS), 1 mL di soluzione di L-Glutammina (concentrazione finale di 2 mM), 100 µ g insulina, glucosio 120 mg, streptomicina 10 mg , 10.000 U penicillina e 800 µ g di vitamina C come riportato in precedenza. Riscaldare il mezzo (37 ° C), regolare il valore di pH al filtro pH 7,4 e sterile (dimensione dei pori di 0,2 µm). Ripetere la procedura (riscaldamento, regolazione del pH, ecc.) ogni secondo giorno prima di cambiare il mezzo. Utilizzare il mezzo al massimo per una settimana se conservato a 4 ° C.
  4. Riempire una scatola di Petri 35 mm con preparazione mezzo per memorizzare il cervello. Posizionare due capsule di Petri vuota per raccogliere il tessuto su un pacchetto di raffreddamento nell'area di lavoro.

2. Preparazione e affettare con un vibratomo

  1. uso cervelli dai ratti di 7-9 ° giorno vecchio o 4-5 gg vecchi topi per la preparazione di OHSC secondo Stoppini et al. 4 dopo la decapitazione di animali, togliere la pelle dal cranio con le forbici.
  2. Introdurre la lama di una forbice bene il foro occipitale e aprire il cranio di taglio lungo l'asse (anteriore) (posteriore) rostrale caudale. Fare due tagli perpendicolari ad esso, cosicché le forbici puntino verso l'orecchio sinistro e destro, rispettivamente (" T-incisione ").
  3. Apre il cranio accuratamente con una pinzetta, facendo attenzione di non danneggiare il cervello. Utilizzare un bisturi (dimensione lama 11) per tagliare la parte più rostrale del palo frontale e il cervelletto.
  4. Per mezzo di una spatola, rimuovere il cervello e inserirlo con cautela di Petri riempito con il mezzo di preparazione ( Figura 2). Posizionare il cervello sul portacampioni e fissarlo con colla del cianoacrilato medico. Utilizzare i pezzi di agar per assicurare la stabilizzazione meccanica.
  5. Sezionare il tessuto orizzontalmente a 350 µm spessore OHSC utilizzando una scorrevole vibratome.
  6. Valutare le fette otticamente utilizzando un microscopio binoculare. Scartare immediatamente OHSC di bassa qualità. È importante prendere solo quelli fette con intatto cytoarchitecture isolato dalla parte centrale dell'ippocampo (Vedi figure 3 e 4) tra la dorsale e l'ippocampo ventrale.
  7. Separare la regione ippocampale e nella corteccia di entorhinal usando un bisturi (tondo lama taglia 15; Figura 3). Deve essere preservata la corteccia di pathway ed entorinale perforant.
  8. Sei-otto OHSC sono ottenuti da ogni cervello. 2-3 fette di trasferimento nell'inserto di cultura di una cella (poro taglia 0,4 µm) e posizionarlo in un pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti contenenti 1 mL di coltura per pozzetto.
  9. Incubare i piatti 6 pozzetti a 35 ° C in atmosfera umidificata completamente con 5% (v/v) di CO 2 e modificare il terreno di coltura cellulare ogni secondo giorno.
    Nota: Il tuo esperimenti al giorno 6 in vitro (div). Reazioni infiammatorie associate alla procedura per affettare scompaiono di giorno 6. In questa fase, le cellule microgliali mostrano una morfologia ramificata nuovamente e connessioni sinaptiche hanno fatto maturare.

3. Valutazione della qualita ' del tessuto

  1. fissazione, etichettatura e visualizzazione di degenerazione neuroni in OHSC
    1. dopo aver eseguito gli esperimenti, incubare la OHSC con ioduro di propidio (PI) di 5 µ g/mL per 2 h prima della fissazione, in ordine a macchiare i nuclei dei neuroni in degenerazione.
      Attenzione: PI è un sospetto cancerogeno, indossare sempre dispositivi di protezione individuale (PPE) ad esempio guanti.
    2. Lavare il OHSC con 0.1 M tampone fosfato (pH 7,4) e fissarle con una soluzione al 4% (v/v) di paraformaldeide (PFA) per 24 h.
      Attenzione: PFA è un tossico e sospetto cancerogeno. Lavorare sotto cappa e indossare PPE.
    3. Lavare il OHSC in inserti con 1 mL di PBS e utilizzare un pennello rigger per separare le fette dalla membrana.
    4. Etichetta OHSC con IB 4 colorante in una piastra a 24 pozzetti ( Figura 5).
  2. Conduzione di esperimenti di invasione tumorale utilizzando fluorescente etichettati celluli
    1. 24 h prima dell'inizio di un esperimento, etichettare le cellule del tumore usando la tintura fluorescente Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl estere (SE CFDA).
    2. Detach e contare le cellule del tumore utilizzando una camera di Neubauer.
    3. Risospendere le cellule in mezzo, tale che 10 µ l di sospensione contiene il numero di cella desiderata (normalmente 50.000 o 100.000 cellule).
    4. Applicare 10 µ l della sospensione delle cellule sulla cultura fetta e permettono alle cellule di invadere per 3 giorni.
    5. Alla fine dell'esperimento, correggere le culture fetta utilizzando 4% (v/v) PFA per 24 h ed etichettare le co-culture con PI per altre 24 ore per visualizzare la citoarchitettura.
      Attenzione: PFA è un tossico e sospetto cancerogeno. Lavorare sotto cappa e indossare PPE.
    6. Montare il co-colture su un vetrino coprioggetto per ulteriori analisi utilizzando i supporti di montaggio.

4. Valutazione di OHSC esperimenti

analizzare il OHSC con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM). Per rilevazione di PI etichettati, degenerando neuroni o il PI etichettato cytoarchitecture utilizzare luce monocromatica di lunghezza d'onda λ = 543 nm e una banda di emissione passare filtro per lunghezze d'onda λ = 585-615 nm. Per CFDA etichettato le cellule del tumore o IB 4 microglia, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di λ = 488 nm. Per entrambi i tipi sperimentali, registrano un z-stack con 2 µm spessore ottico fette e utilizzati per la valutazione.

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Risultati

Studi di neuroprotezione: Per determinare il danno neuronale, il numero di nuclei positivi PI e IB4 positivo microglia in ogni terza sezione ottica di strato delle cellule del granello (GCL) del giro dentato (DG) è stata contata. Per esperimenti di invasione tumorale, la z-proiezione di intensità massima dello stack è stata usata per calcolare l'area coperta dalle cellule del tumore, come una misura di invasione e di visualizzare i flussi di invasione divers...

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Discussione

Il presente protocollo descrive la preparazione di OHSC. Questo modello consente di testare delle capacità intrinseche e reazioni del tessuto cerebrale dopo l'applicazione di stimoli fisiologici e patologici. Oltre alle analisi dei parametri elettrofisiologici, OHSC può essere leso e gli effetti di danni su tutti i tipi di cellule possono essere determinati. Trattamento con sostanze diverse e la descrizione dettagliata di lesioning processi o guarigione in assenza di macrofagi e linfociti è possibile.

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Riconoscimenti

Gli autori vorrei ringraziare Christine Auste per il suo sostegno con la registrazione video e Chalid Ghadban per la sua eccellente assistenza tecnica. Urszula Grabiec è stato sostenuto dalle Roux Programm FKZ 29/18.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
6-WellFalcon35-3046
AgarFluka5040
AutoclavSystecDX-45
CFDA Thermo FisherV12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium Invitrogen32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin IVector LabsFL-1101
GlucoseMerk1083371000
GlutaminInvitrogen25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)Invitrogen24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+)Invitrogen14170-138
InsulinSigma AldrichI5500
L-ascorbic acidSigma AldrichA5960
L-GlutaminInvitrogen25030-024
LN229Cell-Lines-Service300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)B.Braun1050052
Millicell Culture InsertsMilliporePICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acidSigma AldrichM3262
Normal Horse SeumInvitrogen26050-088
Penicillin StreptomycinInvitrogen15140-122
Petri dishes (all sizes)Greiner627160/664160/628160
PFARoth0335.1toxic
Propidium iodid (PI)Sigma Aldrich81845-25MGtoxic
U138ATCCHTB-14
VibratomeLeicaLeica VT 1200

Riferimenti

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