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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo per esprimere e purificare S100A12 (calgranulina C). Descriviamo un protocollo per misurare la sua attività antimicrobica contro il patogeno umano H. pylori .

Abstract

Le proteine ​​di Calgranulina sono importanti mediatori dell'immunità innata e sono membri della classe S100 della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio. Alcune proteine ​​S100 hanno la capacità di legare i metalli di transizione con elevata affinità e di bloccarli in modo efficace dagli invasori di patogeni microbici in un processo chiamato "immunitario nutrizionale". S100A12 (EN-RAGE) lega sia lo zinco che il rame ed è altamente abbondante nelle cellule immunitarie innate come macrofagi e neutrofili. Riconosciamo un metodo raffinato per l'espressione, l'arricchimento e la purificazione di S100A12 nella sua attiva configurazione metallica. L'utilizzo di questa proteina in analisi della crescita batterica e della vitalità rivela che S100A12 ha un'attività antimicrobica contro il patogeno batterico , Helicobacter pylori . L'attività antimicrobica è basata sull'attività di legame di zinco di S100A12, cheelato lo zinco nutritivo, affamando così H. pylori che richiede zinco per la crescita e proliferation.

Introduzione

Le proteine ​​S100 sono una classe della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio con una varietà di funzioni 1 . Essi vengono espressi in maniera specifica per tessuti e cellule e regolano un ampio spettro di funzioni cellulari 2 , 3 . Uniche alle proteine ​​legate al calcio, le proteine ​​S100 presentano sia funzioni intracellulari che extracellulari 4 , 5 . All'interno della cellula, il legame Ca 2+ induce un cambiamento conformazionale che espone una superficie idrofobica che specifica targeting partner legati alla proteina 6 . Questo meccanismo intracellulare regola processi importanti come la proliferazione cellulare, la differenziazione e il metabolismo energetico. Nell'ambiente extracellulare, le proteine ​​S100 presentano due funzioni 7 . In uno, agiscono come proteine ​​del modello molecolare associate a danni (DAMP) e iniziano un pro-inflammRisposta immunitaria atorica attraverso l'interazione con i recettori di riconoscimento del pattern 8 , 9 . Inoltre, diversi membri dei metalli di transizione sequenziali delle proteine ​​S100, una funzione che serve a morire di fame gli agenti patogeni microbiali in un processo chiamato immunità nutrizionale 10 , 11 .

S100A12 (noto anche come calgranulina C e EN-RAGE) è altamente espresso in macrofagi e neutrofili ed è stato identificato come potenziale biomarker per le malattie infiammatorie 12 , 13 . Oltre a legare il calcio nei suoi siti EF-Hand, S100A12 presenta due siti di rilascio di metallo di transizione ad alta affinità situati alle estremità opposte dell'interfaccia dimerica 14 , 15 . Ogni sito di legame è costituito da tre residui di istidina e un residuo di acido aspartico e può chelare zinco o rameSup class = "xref"> 16 , 17 . Recentemente, abbiamo riportato che la fame di zinco dipendente da S100A12 è importante per la regolazione della crescita di Helicobacter pylori e l'attività dei fattori di virulenza pro-infiammatoria 18 .

H. pylori infetta lo stomaco di circa la metà della popolazione umana del mondo; Rendendo probabilmente uno dei patogeni batterici più riusciti 19 . L'infezione con H. pylori può portare a risultati significativi della malattia gastrica, tra cui gastrite, ulcera peptica e duodenale, linfoma associato a linfoma associata alla mucosa (MALT) e adenocarcinoma gastrico invasivo (tumore dello stomaco). Il cancro allo stomaco è la causa principale della morte associata a cancro non cardiaca nel mondo e il più grande fattore di rischio associato per il cancro allo stomaco è l'infezione da H. pylori .

H. pylori persiste nella nicchia gastrica nonostante un robuSt rispondendo alla risposta immunitaria al patogeno sottolineando la necessità di una migliore comprensione dei meccanismi immunitari di controllo di questa infezione batterica 20 , 21 , 22 , 23 . L' infiammazione associata a H. pylori è caratterizzata da una profonda infiltrazione di cellule polimorfonucleari, o neutrofili, che depositano un repertorio di proteine ​​antimicrobiche, tra cui S100A12, nel sito dell'infezione 18 , 24 , 25 . Nel tentativo di comprendere il complesso dialogo tra host e agenti patogeni, abbiamo cercato di perfezionare la tecnica per purificare S100A12 e utilizzarlo per studiare l'effetto antimicrobico che esercita su questo patogeno medico rilevante. Il protocollo sottostante descrive una tecnica migliorata per la purificazione del S100A12 nel suo stato biologicamente attivo; Capace di legare metalli nutrienti ad alta affiniChe li ha allontanati dai microrganismi invasori. Inoltre, i metodi sottostanti evidenziano l'utilità di questa proteina come reagente critico per studiare il meccanismo in base alle quali le innate molecole antimicrobiche restringono la crescita di patogeni batterici.

Le proteine ​​della famiglia S100A hanno guadagnato l'apprezzamento come un importante gruppo di molecole innate del sistema immunitario che partecipano al segnalamento immunitario e alla difesa dell'ospite 27 . Il più ben studiato di questi è la calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . La calprotectina è una proteina associata a neutrofili che forma un eterodimero delle sottounità S100A8 e S100A9 che lega i metalli di transizione all'interfaccia dimerica 31 . La calprotectina ha dimostrato di possedere due siti di legame metallico: il sito 1 può legare Zn 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ e il sito 2 può Lega Zn 2+ 31 , 32 . Numerose relazioni hanno dimostrato che la calprotectina ha attività antimicrobiche contro diversi agenti patogeni tra cui Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e che gli effetti inibitori sono dovuti all'attività di chelazione metallica della calprotectina 25,28 , 29 .

Il lavoro precedente ha dimostrato che la calprotectina esercita numerose attività su H. pylori, tra cui alterare la struttura lipidica A nella membrana esterna, reprimendo il sistema di secrezione cag -Type IV (che è un fattore importante della virulenza di proinfiammazione all'interno di H. pylori ), inducendo la formazione del biofilm e reprimendo La crescita e la vitalità di H. pylori in modo dose-dipendenteClass = "xref"> 25 , 33 . Inoltre, i test genetici e biochimici hanno rivelato l'attività antibatterica della calprotectina contro H. pylori è stata in gran parte derivata dalla sua capacità di legare lo zinco nutrizionale 25 . H. pylori richiede lo zinco, come è stato determinato dalla ricerca precedente che ha utilizzato un mezzo chimicamente definito per accertare i requisiti micronutrienti per questo patogeno per crescere e proliferare 34 . Inoltre, la calprotectina era altamente abbondante nei tessuti H. pylori- infettati e associata a infiltrati neutrofili, indicando che l'ospite può impiegare calprotectina come strategia antimicrobica durante l'infezione e successiva infiammazione 25 , 35 .

Recenti evidenze da tecniche di screening proteomiche impareggiabili suggeriscono che in condizioni in cui le specie reattive di ossigeno sono abbondanti, calprotecLa stagna subisce modificazioni post-traslazionali che alterano il sito di legame ad esa-istidina, inibendo così l'attività legante del metallo della proteina 36 . Come tale, abbiamo ipotizzato che altre proteine ​​della famiglia S100A tra l'ampio repertorio di queste molecole potrebbero potenzialmente agire come chelatori metallici ausiliari. Abbiamo selezionato S100A12 per ulteriori studi perché non è stato identificato nello schermo di cui sopra per la modifica post-traslatoria, ha la capacità di legare lo zinco ed è altamente abbondante nei tessuti umani derivanti da individui infetti da H. pylori .

Il nostro lavoro indica che S100A12 può inibire la crescita e la vitalità di H. pylori in maniera dose-dipendente nel ceppo G27 di H. pylori e che l'attività antimicrobica di questa proteina può essere invertita con l'aggiunta di zinco in eccesso di nutrienti. Questo lavoro completa il nostro precedente lavoro che indica l'attività antimicrobica S100A12 contro PMSS1 e 7.13 ceppi di H. pylori , dimostrando la sua vasta attività antibatterica contro numerosi isolati clinici e ceppi adattati al laboratorio di H. pylori 18 . Insieme, questi risultati confermano l'importanza di S100A12 come meccanismo di controllo della crescita batterica e della proliferazione attraverso l'immunità nutrizionale. Studi futuri di questa importante interazione batterica possono includere lo sfruttamento dell'attività di S100A12 per ridurre il carico batterico nei tessuti dell'host, o determinare il contributo di questa proteina alla segnalazione immunitaria nel contesto dell'infezione da H. pylori .

Protocollo

1. Espressione di S100A12

  1. Trasformare le competenti BL21 DE3 con un plasmide pGEMEX-S100a12 utilizzando un protocollo di scossa termica standard 18 . Aggiungere 1 a 5 μL di plasmide a 50 μL di batteri in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio. Incubare per 20 min.
  2. Scoppio di calore le cellule a 42 ° C per 30 s.
  3. Incubare le celle sul ghiaccio per 2 min.
  4. Aggiungere 500 μL di supporti SOC alle cellule. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri / min su un agitatore orbitale per 1 h.
  5. Piastra 150 μL della reazione di trasformazione sul supporto LB-agar (integrato con 100 μg / mL ampicillina). Incubare per 12-16 h a 37 ° C.
  6. Scegli una colonia. Inoculare 2 mL di LB (integrato con 100 μg / mL ampicillina).
  7. Incubare per 4-6 h a 37 ° C su un agitatore orbitale (300 rpm). L'OD 600 dovrebbe leggere tra 1-3 unità di assorbanza.
  8. Aggiungere 500 μl di coltura d'avviamento a 50 ml di autoinduzione ZYM-5052Cazione media 26 integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Per una migliore aerazione e massima espressione, utilizzare un pallone Erlenmeyer confuso da 250 mL. Agitare (300 giri / min) per 24 h, a 37 ° C.
  9. Trasferire la sospensione batterica in un tubo di centrifuga. Pellet le cellule per centrifugazione (4.000 xg, 10 min) a 4 ° C.
  10. Decantare il supporto, il campione di registro e memorizzare la pasta cellulare a -80 ° C. Il campione è stabile per anni.

2. Purificazione di S100A12 utilizzando la cromatografia a bassa pressione

  1. Riposizionare le cellule in 30 mL di 20 mM Tris, pH 8,0.
  2. Sonicare la sospensione sul ghiaccio per lire le cellule. Usare ~ 20 W uscita, 5 s su e 5 s fuori ciclo per 5 min.
  3. Trasferire la soluzione ai tubi centrifughi ad alta velocità. Chiarire il lisato cellulare per centrifugazione, 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C.
  4. Decantare il surnatante e trasferire in un bicchiere da 100 ml di polipropilene pulito. Raffreddare la soluzione posando il bicchiere sul ghiaccio. Aggiungete un agitatoreR e aggiungere lentamente 11,20 g di solfato di ammonio. Lasciare agire la soluzione su ghiaccio per altri 1 h. Questo creerà una soluzione al 60% di solfato di ammonio e precipita la maggior parte delle proteine ​​endogene di E. coli . S100A12 resterà solubile.
  5. Centrifugare la soluzione a 4 ° C, 20.000 xg per 20 minuti per far pelliccare la proteina precipitata.
  6. Decantare il surnatante e trasferire in tubo di dialisi (MWCO 3.500 kDa). Dializzare contro 1 L di 20 mM Tris, pH 8,0 a 4 ° C. Cambiare due volte il buffer di dialisi. Permettono 4 ore tra le modifiche.
  7. Cianografia cromatica anionica
    1. Eseguire la cromatografia su un sistema a bassa pressione. La portata tipica è di 1 mL / min.
    2. Equilibrare una colonna di Sepharose da 5 ml con 10 mi di 20 mM Tris, pH 8,0.
    3. Caricare la ~ 40 mL di soluzione S100A12 utilizzando la pompa di campionamento (raccogliere il flusso attraverso).
    4. Lavare la colonna con 10 ml di 20 mM Tris, pH 8.
    5. Sviluppare la colonna con una gradiente 0-30% (BuFfer B è 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) su 19 volumi di colonna (CV, 95 mL). Raccogliere 5 ml di frazioni.
    6. Prendere un' aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare utilizzando MES SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Eseguire il gel con tensione costante (20 V / cm) per 30 min.
    7. Frazioni di pool contenenti S100A12. S100A12 funziona a ~ 10 kDa proteina su un gel di denaturazione.
    8. Frazioni concentrate a 5 mL utilizzando un dispositivo di ultrasuono (MWCO 10 kDa). Centrifugare a 3.000 xg per ~ 8 min. Prendi la frazione superiore.
  8. Cromatografia di esclusione di dimensioni
    1. Equilibrare la colonna S75 con 1 CV (120 mL) di 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl.
    2. Iniettare <5 mL di frazioni concentrate S100A12 (dalla cromatografia di scambio ionico).
    3. Sviluppare la colonna con una portata di 1 mL / m su 120 mL. Raccogliere 5 ml di frazioni.
    4. Prendere un' aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare usando SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Convalida l'identità di proteine ​​utilizzandoWestern blot o spettrometria di massa (massa molecolare calcolata di subunità monomerica 10.575.0 Da, misurata 10575.4 Da).
  9. Frazioni di pool
    1. Misurare l'assorbanza della proteina A 280 utilizzando uno spettrofotometro. Utilizzare il buffer SEC come un vuoto. Il coefficiente di estinzione calcolato per l'omodimero S100A12 è di 5960 M -1 cm -1 .
      NOTA: Le rese tipiche sono 35-45 mg di S100A12 per 50 ml di coltura.
    2. Aliquot S100A12 in 1,5 mL di microcentrifuga (1 mg / tubo), congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C.

3. Analisi di attività antimicrobiche

  1. Streak H. pylori ceppo G27 su piatti triplici di agar di soia integrati con 5% di sangue di pecora (piastre agarico di sangue). Crescere 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica.
  2. Inoculare H. pylori nel brodo Brucella integrato con 1x colesterolo. Cultura oltreScuotendo la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica.
  3. Diluire H. pylori 1:10 in brodo Brucella al 50%, 50% tampone di calprotectina più 1x colesterolo e coltura in mezzo solo o integrato con 100 μM cloruro di zinco più 0, 100 o 1.000 μg / mL di S100A12 purificato. La cultura si scuota durante la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con il 5% di anidride carbonica.
  4. Il giorno successivo, eseguire le diluizioni e la piastra seriali sulle piastre di agar sangue. Lasciare colonie batteriche a crescere per 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. Enumerare le unità formanti colonia per calcolare la crescita batterica in presenza o in assenza di S100A12 e / o di zinco esogeno.

Risultati

S100A12 espressione e purificazione

Una depurazione a tre fasi ha prodotto ~ 40 mg di S100A12 ricombinante da 50 ml di coltura batterica. Il primo passo era una precipitazione di solfato di ammonio di proteine ​​endogene di E. coli . Questa fase è stata seguita da una cromatografia di anion-exchange ( figura 1A ). La proteina è tracciata da una SDS-PAGE macchiata con Coomassie Bril...

Discussione

Viene presentato un protocollo efficiente sia per l'espressione che per la purificazione dell'uomo S100A12. Il sistema di espressione E. coli è lo strumento più comune per la produzione di proteine ​​ricombinanti, in particolare quando sono necessari quantitativi di mg per studi biochimici e biofisici. Un valorizzazione chiave della procedura qui descritta è l'uso di mezzi autoinduttivi 26 che aumentano la resa della proteina purificata di un fattore di quasi trenta ri...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento per i Premi Veterans Affairs Award di sviluppo professionale 1IK2BX001701, il premio CTSA UL1TR000445 dal Centro Nazionale per l'Avanzamento delle Scienze Traslazionali, il National Science Foundation Award Numbers 1547757 e 1400969 e NIH concede GM05551. Il suo contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente una visione ufficiale del Centro Nazionale per l'Avanzamento delle Scienze Traslazionali o degli Istituti Nazionali di Salute.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cellsNew England BiolabsC25271
Autoinduction medium components
Yeast ExtractResearch Products InternationalY20020-250.0
NaClResearch Products InternationalS23020-500.0
TryptoneResearch Products InternationalT60060-250.0
FeCl3Sigma-AldrichF2877
MgSO4Research Products InternationalM65240-100.0
Na2HPO4Research Products InternationalS23100-500.0
KH2PO4Research Products InternationalP41200-500.0
NH4ClResearch Products InternationalA20424-500.0
Na2SO4Research Products InternationalS25150-500.0
GlycerolResearch Products InternationalG22020-1.0
D-glucoseResearch Products InternationalG32040-500.0
lactoseSigma-AldrichL2643
Selection agent
ampicillinResearch Products InternationalA40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography SystemGE29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast FlowGE17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HRGE17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometerThermo Fisher ScientificND-LITE
Tris BaseResearch Products InternationalT60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar platesLab Supply CompanyBBL221261
Brucella brothSigma-AldrichB3051
Cholesterol (250x)Thermo Fisher Scientific12531018
NaClSigma-Aldrich793566
CaCl2Sigma-AldrichC4901
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Tris BaseSigma-AldrichT1503
Zinc ChlorideSigma-Aldrich229997

Riferimenti

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