Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

Riepilogo

Questo protocollo mostra come ad accisa in modo coerente gli occhi planaria (tazze ottica) senza disturbare i tessuti circostanti. L'utilizzo di un ago da insulina e la siringa, uno o entrambi gli occhi possono essere ablato per facilitare le indagini i meccanismi che regolano la rigenerazione degli occhi, l'evoluzione della rigenerazione visiva, e le basi neurali del comportamento indotto dalla luce.

Abstract

Nello studio di cellule staminali adulte e meccanismi rigenerativi, platelminti planarian sono una graffetta nel sistema modello in vivo. Ciò è dovuto in gran parte alla loro abbondante popolazione di cellule staminali pluripotenti e la capacità di rigenerare tutti i tipi di cellule e tessuti dopo lesioni che sarebbe catastrofico per la maggior parte degli animali. Recentemente, planarie hanno guadagnato popolarità come modello per la rigenerazione degli occhi. La loro capacità di rigenerare l'intero occhio (composto da due tipi di tessuto: cellule pigmento e fotorecettori) consente la dissezione dei meccanismi che regolano la rigenerazione del sistema visivo. ablazione occhio ha diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche (come decapitazione o fori) per l'esame percorsi e meccanismi specifici occhio, il più importante dei quali è che la rigenerazione è in gran parte limitato ai soli tessuti dell'occhio. Lo scopo di questo articolo il video è quello di dimostrare come rimuovere in modo affidabile la coppa ottica planarian senza disturbare il cervello o tessuti circostanti.Movimentazione di vermi e manutenzione di una colonia stabilita viene anche descritto. Questa tecnica utilizza un 31 G, ago da insulina da 5/16 pollici per raccogliere chirurgicamente la coppa ottica di planarians immobilizzati su un piatto freddo. Questo metodo comprende sia singola e doppia ablazione dell'occhio, con gli occhi rigeneranti entro 1-2 settimane, consentendo una vasta gamma di applicazioni. In particolare, questa tecnica di ablazione può essere facilmente combinato con (RNA interference) schermi farmacologici e genetici per una migliore comprensione dei meccanismi rigenerativi e loro evoluzione, cellule staminali occhio e la loro manutenzione e risposte comportamentali phototaxic e la loro base neurologica.

Introduzione

Planarie sono un potente organismo modello per studiare la rigenerazione cellulare mediata staminali adulte. Questi platelminti acqua dolce non parassitarie possiedono la capacità di rigenerare qualsiasi e tutti i tessuti mancanti, tra loro sistema nervoso centrale e del cervello ^1. Studiata fin 1700 ^2, progressi tecnologici nel campo planarian corso degli ultimi 10-15 anni (quali un genoma sequenziato, ibridazione in situ, immunoistochimica, interferenza RNA (RNAi), e trascrittomica) hanno aggiornato questo organismo modello storico . In particolare, planarie hanno recentemente guadagnato la popolarità come un modello emergente per la ricerca degli occhi ^3.

Planarians hanno occhi prototipici con solo due tipi di tessuto, i neuroni fotorecettori e cellule pigmentate; ciò ha permesso la caratterizzazione della sua popolazione dell'occhio cellule staminali e dimostrato che molti degli stessi geni che regolano vertebrato occhio deluppo sono conservati in planarians ^{4, 5.} Le coppe ottiche si trovano dorsalmente e comprende il bianco, dendriti dei neuroni non pigmentate fotorecettori e le cellule del pigmento nero semi-lunari, e gli occhi innervano il cervello attraverso un chiasma ottico. Oltre ad essere un modello per chiarire processi rigenerativi ^6, l'occhio planarian è adatto per studiare l'evoluzione dei meccanismi visivi ^7, risposte comportamentali alla luce (planarians visualizzare fototassi negativo) ^8, e la base neurologiche del comportamento ^9.

Rigenerazione oculare planarians è stato ampiamente studiato in due contesti principali: come parte della rigenerazione testa dopo decapitazione ^{4, 10,} e dopo l'asportazione di soli tessuti oculari ^{11, 12} . La maggior parte degli studi sulla rigenerazione planaria occhi hanno usato il metodo di decapitazione, in quanto è semplice e lineare. Il metodo escissione occhio planarian più comune è stato finora tramite perforazione con un tubo capillare vetro sottile ^{13, 14,} anche se alcuni studi hanno anche eseguito amputazioni appena dietro gli occhi (decapitazione parziale) ^15. Tuttavia, tutti questi metodi comportano la perdita di molti tessuti diversi solo l'occhio (come il cervello, intestino, e nefridi), potenzialmente complicando l'interpretazione dei risultati. Il protocollo ablazione occhio qui presentata limita escissione ai tessuti dell'occhio (escludendo in particolare del cervello), con conseguente dati che sono più specifici per l'occhio. Inoltre, a differenza di vermi decapitati che prendono 7-14 giorni per iniziare l'alimentazione, occhio ablato vermi alimentare entro 24 h di ablazione ^12, consentendo esperimenti RNAi (dove RNAi viene fornita mediante il cibo) da esibiràd contemporaneamente.

Anche se l'ablazione occhio è tecnicamente più difficile da eseguire con successo di decapitazione, gli studi in corso sulla escissione occhio non hanno incluso le istruzioni dettagliate sulle loro procedure. L'obiettivo di questo articolo il video è quello di consentire ai ricercatori di rimuovere costantemente la coppa ottica planaria senza disturbare i tessuti cerebrali sottostanti e la rimozione come pochi altri tessuti come possibile. Questo metodo può essere utilizzato sia per singolo e doppio ablazione dell'occhio ed è applicabile ad una vasta gamma di indagini. Come la maggior parte dosaggi di rigenerazione, l'ablazione occhio è adatto per la combinazione con entrambi (RNAi) schermi farmacologiche e genetiche, così come studi comportamentali. Qui si descrivono i metodi per la gestione di vermi, il mantenimento di una colonia planaria, e la tecnica di ablazione occhio stesso.

Protocollo

1. Cultura e trattamento degli animali

NOTA: Questo protocollo utilizza mediterranea Schmidtea, una specie planaria diploide con un genoma sequenziato ^{16, 17} che viene comunemente utilizzato per la ricerca di rigenerazione. Tuttavia, l'analisi è altrettanto successo con altre specie, quali Girardia tigrina e Girardia dorotocephala (che sono disponibili in commercio).

1. Mantenere vermi "acqua verme" fatta da 0,5 g sali / L di mare in ultrapura (o filtrata deionizzata) acqua. Utilizzare sterili contenitori in polipropilene o vetro per tenere l'acqua verme. Vedere file supplementare 1 per i dettagli sulla produzione di acqua verme.
   NOTA: Non usare mai sapone per pulire i contenitori (o di altri fornitori) come il sapone è tossico per i vermi; invece strofinata con 70% etanolo e lasciare asciugare all'aria.
   1. Indossare guanti durante il lavoro con planaria per proteggerli dalla contaminazione.
      NOTA: I vermi sono molto sensibili alle tossine e sostanze chimiche ambientali, tra cui il sapone, candeggina, shampoo, balsamo e crema per le mani.
2. colonie case in contenitori per alimenti polipropilene, con il coperchio parzialmente aperto lasciati per lo scambio aria a ~ 20 ° C (temperatura ambiente). Negozio vermi sperimentali in entrambe le capsule di Petri (20 vermi per piastra 100 mm) o lastre non trattate tessuto-coltura (1 verme per pozzetto, per piastre da 12 pozzetti). Per ridurre lo stress, tenere entrambe le colonie e gli esperimenti nel buio.
   NOTA: Le colonie devono avere non più di 500-1000 vermi per litro d'acqua a vite senza fine. Per gli esperimenti, lasciare coperchi pienamente in atto, dal momento che il flusso d'aria è stato progettato in questi piatti.
3. Nutrire i vermi non sperimentali volta alla settimana con purea carne biologica o fegato di pollo facendo cadere purea da una pipetta di trasferimento, mettendo gocce di cibo in tutto il contenitore. Lasciare Worms 2 h di consumare cibo inbuio prima di pulire il contenitore (vedi passo 1.4). Prima dell'uso, purea di conservare a -20 ° C per brevi periodi (settimane) o -80 ° C per il lungo termine (mesi); non ricongelare purea per il riutilizzo (come batteri possono fiorire e danneggiare i vermi).
   NOTA: fegato non deve contenere ormoni o antibiotici e preferibilmente non essere congelati in precedenza. Centrifugare purea prima del congelamento (o prima dell'alimentazione) per rimuovere l'aria e impediscono cibo da galleggiante. Il cibo dovrebbe depositarsi sul fondo del contenitore. 1 ml di purea è sufficiente per 500-1.000 vermi.
4. acqua di cambio una volta alla settimana con acqua fresca senza fine per entrambe le colonie e gli esperimenti. contenitori colonia dovrebbero essere puliti con un tovagliolo di carta greggi (per rimuovere i residui di muco che i rifiuti trappola) una volta alla settimana per fame vermi, o due volte alla settimana per vermi alimentazione (2 h dopo l'alimentazione e ancora 2 giorni più tardi). Al fine di mantenere il biofilm, non pulire più dell'80% del contenitore.
5. Spostare vermi tra i contenitori (o setu chirurgiap) utilizzando una pipetta di trasferimento. Per vermi liberi aderito superfici del contenitore, spruzzare acqua sopra / dietro il verme per sganciarlo dalla superficie. Poi aspirare il verme nella pipetta, cercando di mantenere il worm all'interno della porzione di fondo pollici (più sottile) della pipetta.
   1. pipette rinviare la con una piccola quantità di acqua verme prima di succhiare.
   2. Provare a spostare l'acqua intorno alla vite senza fine, piuttosto che il worm stesso, per aiutare a prevenire strappi vermi dal corpo molle toccandoli con la pipetta.
   3. Mantenere piatti sperimentali coperte salvo trasferimento vermi o sostituzione dell'acqua.

2. Preparazione

1. Smettere di alimentare i vermi almeno una settimana prima di esperimenti.
   1. Selezionare worm che non sono stati ricevuto per almeno ≥1 settimana e sono almeno 5-7 mm di lunghezza. Trasferire i vermi ad una piastra di Petri 2/3 con acqua verme, e confermare la lunghezza verme facendo scorrere un righello sotto il piatto. Misura wORM mentre completamente estese e in movimento.
      NOTA: Anche se più piccolo (5-7 mm) vermi funzionano meglio durante l'esecuzione successiva immunofluorescenza e analisi situ, vermi più grandi (8-10 mm) sono più facili da lavorare - soprattutto quando si impara per l'ablazione.
   2. Assicurarsi che i vermi sono tutto, non danneggiato, e non recentemente rigenerante.
      NOTA: Rigenerazione vermi avranno molto più leggero (o no) pigmento nella testa e / o della regione di coda rispetto ai vermi normali.
   3. Se l'esecuzione di RNAi o trattamenti farmacologici di vermi, farlo a questo punto. Se i vermi sono stati alimentati come parte del trattamento (come per RNAi), attendere almeno 7 giorni dopo l'ultima alimentazione prima di passare al punto 2.2.
2. Pulire il microscopio base spaziale lavoro e dissezione con il 70% di etanolo e lasciare asciugare completamente. Posizionare il piatto di vermi selezionati a sinistra del campo di applicazione. A destra del campo di applicazione, inserire un paio di # 5 forcipe, un 31 G 5/16-inch ago da insulina con un 1mL siringa, e un trasferimento pipetta pulita.
   1. Assicurarsi che gli strumenti sono mantenuti tocchi il banco (che potrebbe introdurre contaminanti). Utilizzare un elemento rigido (ad esempio un resto della bacchette) per mantenere la pinza, l'ago, e pipetta pulita. In alternativa, posizionare gli strumenti sulla parte superiore di un marrone (greggio) tovagliolo di carta fresca.
      NOTA: Queste e le successive istruzioni sono scritte in cui riguardano gli individui destri. individui mancini dovrebbero invertire la destra / sinistra le direzioni.
3. Accanto alla spazio di lavoro, mettere una casella di salviette panno liscio, una fonte di acqua fresca a vite senza fine, e alcune pipette di trasferimento extra (protetti dal banco). Posto acqua verme in una bottiglia di lavaggio in plastica per facilità di erogazione. Anche inserire un piatto marcato 12 pozzetti (o 100 a Petri) a destra del campo di applicazione raccoglie gli animali ablazione.
4. Se si utilizza una piastra Peltier su misura per immobilizzare i vermi, posizionare la piastra Peltier nella depressione in tha basamento del microscopio da dissezione e regolare l'uscita del generatore di tensione CC finché la superficie di lavoro della piastra Peltier è sufficientemente fredda (tipicamente ~ 5 V) .Alternatively, fare una piastra fredda riempiendo una capsula Petri mm 100 metà con acqua e congelare per almeno 24 h. Scartare il coperchio e posizionare il fondo del piatto 100 mm base della portata dissezione, quindi posizionare il coperchio di un piatto 60 mm Petri capovolta direttamente sulla superficie del ghiaccio (Figura 1A).
   1. Dopo che l'acqua è congelato nel piatto 100 mm, un "vulcano" di ghiaccio può apparire nel centro della piastra. Se questo accade, usare una lama di rasoio per raschiare il piatto ghiaccio, per eliminare irregolarità dalla superficie.
      NOTA: durante interventi chirurgici il ghiaccio si scioglierà, rendendo ablazioni molto più difficile. Preparare diversi piatti di ghiaccio in anticipo, e sostituire quelli congelati per la fusione quelli durante il dosaggio non appena il coperchio del piatto 60 millimetri inizia flottante.
5. preparare lasuperficie chirurgia. Tagliare un pezzo 5 cm x 10 cm di parafilm plastica (4 cm ² se si utilizza la scatola di Petri piastra fredda) e posizionarlo sul centro del dispositivo di immobilizzazione. Piegare un panno liscio pulire in un quadrato circa 2 cm ² e posizionarlo sopra del film. Tagliare un pezzo di filtro di carta bianca 1,5-2 cm ² e posizionarlo sulla parte superiore del wipe. Vedere Figura 1B-1E.
   1. Tenere il piegata pulire in posizione con un dito guantato, e utilizzare l'acqua senza fine per inumidire leggermente la salvietta per garantire che rimanga piegato. Usare il lato di una pipetta di trasferimento a rotolare la salvietta piatta.
      NOTA: la temperatura fredda aiuta a mantenere i vermi di muoversi. Lavorare "a secco" aiuta anche nella immobilizzazione. Il tessuto wipe agisce per favorire l'acqua attraverso la carta da filtro, mantenendo il verme umido durante l'intervento chirurgico senza consentire vermi asciugare completamente (che è letale).

3. ablazione chirurgica

1. Utilizzare una pipetta di trasferimento di immettere sullato e verme dorsale fino sulla carta da filtro. Accendere la sorgente luminosa e dirigere le goosenecks in modo che la luce si concentra sul verme. Regolare la messa a fuoco dissezione portata e ingrandimento in modo che gli occhi sono chiaramente visibili (l'intero verme non ha bisogno di essere in vista); Ingrandimento 5X è un buon punto di partenza. Orientare il verme ruotando il parafilm modo che la testa sia puntato verso il ricercatore (verso la parte anteriore del microscopio), angolati 30-40 gradi verso destra.
   1. Evitare l'uso di luce intensa per impedire il movimento verme in eccesso. Planarians mostrano fototassi negative e tenterà di eludere luce.
   2. Se la vite è posizionato lato ventrale rivolto verso l'alto (con apertura visibile faringeo), usare il lato opaco della pinza per riposizionare delicatamente il lato dorsale verme alto (con gli occhi visibili). Evitare di avvicinarsi l'animale con la punta affilata della pinza per ridurre al minimo la possibilità di strappare attraverso i tessuti molli quando riposizionamento l'animale.
   3. Regolare il fuoco microscopio in modo che gli occhi sono chiaramente a fuoco. Assicurarsi inoltre che entrambi gli occhi e tessuti testa circostanti sono in vista.
2. Tenere un fresco ago / siringa nella mano destra come se fosse una penna (tra il pollice e l'indice). Brace il pollice sinistra contro la piastra Peltier (o scatole Petri piastra fredda), e utilizzare il pollice sinistro come fulcro su cui poggerà la porzione di fondo della siringa (Figura 2A). Guardare attraverso il microscopio, e assicurarsi che la smussatura dell'ago è visibile.
   NOTA: Gli aghi sono molto taglienti. Siate cauti quando loro manipolazione. Indossare guanti di lattice o di nitrile in grado di offrire una certa protezione.
   1. Utilizzare il pollice sinistro per contribuire a tenere l'ago / siringa costante durante tutta la procedura ed evitare di stringere la mano.
   2. Formare un angolo di circa 40 ° con il pollice sinistro e l'indice di sinistra (con il dito indice sulla superficie chirurgia) per contribuire a tenere la superficie stabile chirurgia.
3. Conla smussatura dell'ago rivolta verso l'alto (come un cucchiaio), posizionare l'ago perpendicolarmente alla dell'occhio (Figura 2B). Utilizzare la punta dell'ago per penetrare delicatamente lo strato sottile di tessuto sovrastante la tazza ottico (bianco, regione non pigmentato) dell'occhio, raccogliendo da destra a sinistra. Molto rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto pigmentato situato all'interno della coppa ottica, facendo attenzione a non forare il fondo o distruggere i confini della coppa ottica.
   1. Se il verme è stato sulla carta da filtro per> 1-2 min in qualsiasi momento durante la procedura, aggiungere una goccia di acqua verme per reidratare il verme.
      NOTA: La disidratazione aumenta la suscettibilità del verme a lesioni ripping.
4. Ripetere passaggio 3.3 finché tutti i tessuti pigmentati neri (cellule pigmento), così come tutti i tessuti bianchi della coppa ottica (dendriti dei fotorecettori), vengono rimossi. Rimuovere tessuti asportati bloccato fino alla fine dell'ago con attenzione strofinando con un tessuto wipe. Se doppio Abla occhiozione è desiderato, ablazione del secondo occhio a questo punto.
   NOTA: Per evitare lesioni, aghi può essere pulito afferrando l'ago con un panno pulito wipe tenuto con il pollice e l'indice, poi con l'altra mano per tirare l'ago attraverso la spazzare via dal pollice e l'indice. In alternativa, l'ago può essere pulito sulla superficie di un tessuto wipe ed esaminato per la pulizia.
5. Al termine, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare il verme ad un piatto etichetta contenente acqua verme fresca. Se l'analisi dei dati gruppo mettere fino a 20 vermi in un singolo 100 millimetri piastra Petri. Se il monitoraggio rigenerazione negli stessi individui nel corso del tempo, mettere 1 verme in ciascun pozzetto di una 12-pozzetti. Una volta che tutti i vermi sono trasferiti, risciacquare vermi rimuovendo tutta l'acqua verme dalle stoviglie / pozzetti e sostituendo con più acqua verme fresca.
   1. Per rimuovere i vermi dal filtro, ritardare l'pipetta con una piccola quantità di acqua vite senza fine e rilasciare l'acqua sulla vite senza fine. Questo dovrebbe alzare tegli verme fuori la carta da filtro, da subito risucchiato nella pipetta per il trasferimento.
6. Incubare esperimenti a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) al riparo dalla luce e seguire il processo rigenerativo.
   NOTA: Worms possono essere memorizzati in un incubatore a temperatura controllata per mantenere una temperatura costante, ma ciò non è strettamente necessario. La maggior parte delle temperatura ambiente variano solo da + 5 ° C, che non alteri la capacità del verme di rigenerare.
7. Se lo si desidera, fissare vermi per immunoistochimica (vedi figure 3-4) e / o ibridizzazione in situ analisi dell'espressione genica. Esistono diversi metodi di fissazione per immunoistochimica planarian ^{18, 19, 20} e ibridazione in situ ^{21, 22, 23} protocolli.
8. Quando gli esperimenti sono concluse, sacrifice vivere vermi mediante eliminazione di acqua verme dal piatto e sostituzione con etanolo al 70%. Incubare vermi per 3-5 minuti, controllando per i vermi per lisare e girare grigiastra.
9. Posizionare i vermi non trattati nel flusso dei rifiuti normali una volta sacrificato. Evitare di introdurre vermi vivi nell'ambiente, in particolare le specie non indigene.

Risultati

Per la prima post chirurgia 1-2 h, animali possono esibire movimento è diminuito rispetto ai vermi intatti (tuttavia essi sposteranno comunque). Se lo si desidera, vermi mangiare entro 24 ore di chirurgia (per esempio, per l'alimentazione RNAi). Quando si segue la rigenerazione degli occhi negli stessi individui nel corso del tempo, assicuratevi di prendere una fotografia di ciascuna vite senza fine sia prima dell'intervento chirurgico (intatto) e al 1 ore dopo l'ablazione (...

Discussione

Questa tecnica di ablazione dell'occhio migliora la metodologia correnti (come fori) escludendo tessuti cerebrali e limitando escissione principalmente ai tessuti oculari. Con la pratica, questa tecnica può essere eseguita dalla maggior parte degli individui, da tecnici esperti in microchirurgia per studenti universitari inesperti ma di coscienza. Si raccomanda che questa tecnica essere praticato molte volte prima di utilizzare ablazioni in esperimenti, inclusi (quando possibile) conferma della rimozione completa d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional