Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

Riepilogo

Sono stati sviluppati e descritti diversi protocolli per l'isolamento di diversi tipi di cellule cardiache da un cuore del topo. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione, riducendo i costi sperimentali.

Abstract

Il ratto è un importante modello di animali utilizzato nella ricerca cardiovascolare e le cellule cardiache del ratto vengono usate in maniera routinaria per l'analisi in vitro dei meccanismi molecolari della progressione della malattia cardiovascolare come l'ipertrofia cardiaca, la fibrosi e l'aterosclerosi. Sebbene siano stati fatti diversi tentativi con successo variabile per sviluppare linee cellulari immortalizzate dal sistema cardiovascolare per comprendere questi meccanismi cellulari, le cellule primarie offrono un ambiente più naturale e vicino all'ambiente in vivo per tali studi. Pertanto, diversi laboratori che lavorano su un particolare tipo di cellule hanno sviluppato protocolli per isolare singoli tipi di cellule cardiache di ratto di interesse. Manca un protocollo che consente l'isolamento di più di un tipo di cella. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione e consente diR per l'analisi cellulare. Ciò consente l'uso più efficiente delle risorse disponibili, che possono risparmiare tempo e ridurre i costi di ricerca.

Introduzione

I modelli di roditori sono da tempo usati come strumenti per ampliare la nostra comprensione della fisiologia cardiovascolare in salute e malattie. ¹ Anche se questi modelli animali ci permettono di comprendere la fisiopatologia di una malattia a livello di organo e di analizzare la farmacocinetica e la farmacodinamica di vari agenti farmacologici utilizzati per il trattamento delle malattie cardiovascolari, la comprensione dei meccanismi molecolari dello sviluppo delle malattie cardiovascolari e il contributo di un particolare Tipo di cellule richiede l'uso di modelli di coltura cellulare in vitro . A tal fine sono state sviluppate diverse linee cellulari immortalate del sistema cardiovascolare; ^{2 , 3} tuttavia, le cellule primarie appena isolate sono fisiologicamente e funzionalmente più pertinenti ai tessuti e agli organismi viventi.

Il cuore è un organo versatile che contiene tutti i principali tipi di cellule del sistema cardiovascolareYstem, e il cuore del ratto è ancora un modello comunemente utilizzato per la comprensione della fisiologia cardiovascolare. Negli ultimi decenni sono stati descritti diversi metodi per l'isolamento di singoli tipi di cellule dal tessuto cardiaco; ^{4 , 5 , 6 , 7} tuttavia, questi metodi si concentrano solo sull'isolamento di un determinato tipo di cellule che determina la perdita di altri tipi di cellule che non possono più essere utilizzati per l'analisi cellulare. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento simultaneo e di alta qualità dei principali tipi cellulari di tessuto cardiaco, cioè cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti. Tutti questi tipi di cellule possono essere utilizzati in diverse configurazioni sperimentali ^{8 , 9 , 10} e per l'analisi delle interazioni di cellule cellule dallo stesso animale.

Protocollo

L'indagine è conforme alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dall'Istituto Nazionale di Salute degli Stati Uniti (NIH Publication No. 85-23 1985) ed è stata approvata dal comitato etico locale dell'Università di Giessen. In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Wistar adulti di peso da 200 a 250 g.

1. Autoclave

1. Almeno un giorno prima della procedura deve essere eseguito, autoclave tutti gli strumenti chirurgici, i pipette e le pipette Pasteur da utilizzare in fase di isolamento a 121 ° C per 30 minuti.

2. Preparazione di supporti e soluzioni

NOTA: Le soluzioni ai punti 2.1-2.4 possono essere preparate fino a una settimana prima dell'isolamento e conservate a 4 ° C, ma preparare le soluzioni ai punti 2.5-2.8 il giorno dell'isolamento. Le ricette complete dei tamponi e dei supporti sono riportati nella Tabella 1 . Calda tutti i supporti e le soluzioni a 37 ° C in unPrima di iniziare la preparazione.

1. Preparare il mezzo Powell sciogliendo le sostanze chimiche elencate nella tabella 1 in 4,5 L di H ₂ O a temperatura ambiente (RT). Regolare il pH a 7.4 con 2.0 N NaOH e portare il volume a 5.0 L. Filtro sterile la soluzione e conservarlo a 4 ° C.
2. Preparare la media della creatina, della L-carnitina e del taurina (CCT) sciogliendo il mezzo di polvere M199 in 4,5 L di H ₂ O. Aggiungere la polvere di HEPES secondo la Tabella al supporto e mescolare per 15 minuti. Aggiungere la creatina, carnitina, taurina e Ara-C secondo la tabella 1 . Mescolare bene, regolare il pH con pH a 7.4 con 2,0 N NaOH e portare il volume a 5,0 L di filtro sterile e conservare a 4 ° C.
3. Preparare il mezzo di coltura cellulare per i fibroblasti aggiungendo il siero di vitello fetale del 10% (FCS) e il 2% di penicillina / streptomicina (Pen / Strep) al mezzo M199. Il DMEM è altrettanto adatto come M199 e può essere utilizzato anche per la coltura di cellule fibroblastiche.
4. Preparare il coltura di cellule MV2E per le cellule endoteliali aggiungendo tutti i contenuti del mix di integratore al mezzo MV2 basale secondo le istruzioni del produttore. Prendere una aliquota da 5 ml e scaldarla a 37 ° C in un bagno d'acqua.
5. Preparare il tampone di isolamento delle cellule endoteliali mediante la dissoluzione di 0,05 g di albumina bovina serba (BSA) in 50 ml di soluzione salina equilibrata Hanks (HBSS) e aggiungendo 0,5 ml di soluzione di acido etilenediammina-tetraacetico (EDTA) di 200 mM. Sterilizzare questo filtro e conservarlo a 4 ° C.
6. Preparare il buffer di lavaggio delle cellule endoteliali aggiungendo 0,1 ml di 200 mM a 9,9 ml di PBS e conservarlo a 4 ° C.
7. Preparare la soluzione di collagenasi sciogliendo 27 mg di collagenasi in 5 ml di mezzo di Powell e aggiungendo 12,5 μL di 100 mM CaCl2. Riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua.
8. Preparare le soluzioni di restauro di Ca ²⁺ incrementali 1, 2 e 3 per i cardiomiociti aggiungendo 12,5 μL, 25 μL e 120 μL di 100 mM CaCl2Ione a 6 mL, 6 mL e 12 mL di Powell.
9. Prepare i piatti di coltura cellulare per i cardiomiociti un giorno prima dell'isolamento aggiungendo 1 ml di substrato di pre-rivestimento contenente laminina a ogni piatto di coltura a cellule da 35 mm. Incubarli nell'incubatore di coltura cellulare a 37 ° C per una notte.

3. Preparazione di perline magnetiche

1. Mettere 0,5 mL del tampone di isolamento delle cellule endoteliali in un tubo di campione da 1,5 mL su ghiaccio.
2. Aggiungere 5 μL (2 x 10 ⁶ ) di branelli magnetici IgG del mouse pan e mescolare bene.
3. Mettere il tubo nel rack magnetico per 1 minuto. Le perle si aderiscono alla parete del tubo verso il magnete. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta da 1 ml.
4. Ripetere il lavaggio due volte di più e infine ri-sospendere le perle in 50 μL di tampone di isolamento delle cellule endoteliali e conservare a 4 ° C fino all'uso.

4. Preparazione del Langendorff Perfusion System

1. Pulire tIl sistema Langendorff per perfusione con 2 L di acqua distillata.
2. Circolare 50 ml di mezzo Powell attraverso il sistema per 5 min e scartare il mezzo.
3. Aggiungere 80 ml di Powell medio fresco. Continuamente perfezionare con "carbogen" bolle con una pipetta di vetro Pasteur dal cilindro del gas. Lasciate riciclare il mezzo attraverso il sistema. Il sistema è pronto per perfezionare il cuore ( Figura 1A ).

5. Dissezione del ratto

1. Posizionare il ratto in un desiccatore da 5 L sotto una cappa di fumo e aggiungere 1,5 ml di isoflurano di 4-5% attraverso l'aria e chiudere il coperchio.
   NOTA: Posizionare l'animale su una piastra forata alta all'interno dell'essiccatore per evitare il contatto diretto dell'animale con l'isoflurano liquido.
2. Attendere che il ratto perde il suo riflesso del coperchio (di solito ~ 5 minuti) e quindi toglie il topo dall'essiccatore. Eutanizzare il ratto con la dislocazione cervicale.
3. Tagliare la pelle addominale e l'orizzonte muscolare sottostanteAlleata in mezzo usando un paio di forbici affilate. Successivamente, tagliare il muscolo verticalmente allo sterno del ratto e aprire il torace. Togliere il cuore insieme ai polmoni e posizionare immediatamente gli organi in soluzione fredda di NaCl dello 0,9%.
4. Rimuovere i polmoni con l'aiuto di un paio di forbici e scartarli. Pulire il cuore di qualsiasi tessuto connettivo e tagliare l'aorta caudalmente al ramo del tronco brachiocefale.

6. Perfusione del cuore e digestione con collagenasi

1. Montare il cuore attraverso l'aorta nel sistema di perfusione Langendorff (sezione 4) usando due coppie di pinze sottili e curve. Per assicurare che il miocardio sia perfuso in modo retrogrado, posizionare l'estremità della cannula del sistema di perfusione tra il primo ramo aortico e la valvola aortica. Fissare l'aorta utilizzando un morsetto di coccodrillo.
2. Fissare il cuore con una sutura chirurgica e rimuovere il morsetto del coccodrillo ( figura 1B ).
3. Aprire la valvola della cannula per permettere al mezzo di perfusione (35 ml) di passare attraverso la goccia a goccia (60 gocce / min, 5 ml / min) per lavare qualsiasi sangue residuo. Scartare ogni flusso in questa fase.
   NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria in qualsiasi fase della perfusione, in quanto ciò comporterà una digestione incompleta e un guasto della procedura di isolamento delle cellule.
4. Posizionare il cuore appeso nell'imbuto di raccolta (camera del cuore, figura 1B ) e avviare la pompa peristaltica che ricircolerà il mezzo di perfusione dall'imbuto di raccolta al serbatoio ( figura 1A ).
5. Aggiungere la soluzione collagenasi (dal punto 2.8) al mezzo di perfusione. Perfuse il cuore con la soluzione di collagenasi ricircolante per 30 min.
   NOTA: questo passaggio è molto importante per ottimizzare la resa cellulare. Il tempo di perfusione dipende dall'attività della collagenasi, che può variare a seconda del lotto. Prova i 3-4 lotti di collagenasi per trovare quello con optiMale attività; Allora grandi quantità di lotto più adatto possono essere acquistate che sono sufficienti per almeno un anno per i risultati riproducibili.
6. Al termine del tempo di digestione, fermare la perfusione, rimuovere il cuore dal sistema Langendorff usando un paio di forbici e metterlo in un piatto di vetro Petri.
7. Tagliate e scartate entrambe le atrie e rimuovete i residui di tessuti grassi. Scorri con cautela il pericardio con l'aiuto di due coppie di pinze per evitare la contaminazione delle cellule epiteliali.
   NOTA: il pericardio può essere ulteriormente digerito con collagenasi per ottenere le cellule epiteliali cardiache puro, se necessario. Un protocollo dettagliato non è fornito nel presente studio poiché questo è al di là del campo di applicazione del presente protocollo.
8. Tagliare il cuore in mezzo con un paio di forbici e metterlo nell'elettrofilo. Mescolare il cuore 2-3 volte e ri-sospendere il tessuto macinato in 12 mL del tampone di digestione dalla perfusione Langendorff.
   NOTA: non tritare l'hEart eccessivamente, in quanto ciò comporterà una maggiore percentuale di cardiomiociti morti.
9. Trasferire il tessuto macinato in 15 ml di mezzo di dissociazione contenente collagenasi e lasciarlo digerire in un bagno d'acqua per un periodo di 5-10 min con mescolanza occasionale mediante ri-sospensione usando una pipetta di plastica monouso da 5 ml.
10. Al termine del periodo di digestione, filtrare la sospensione cellulare attraverso un setaccio da 100 μm. Scartare i detriti tissutali e il materiale non immerso.
11. Al termine della perfusione Langendorff, sciacquare immediatamente il sistema di perfusione con un minimo di 1 L di acqua distillata. Perfusione del sistema ricircolando 100 mL di 0,1 N NaOH per 30 minuti e infine sciacquare il sistema con 2-3 L di acqua distillata. Asciugare il sistema sciacquando l'aria e coprire l'apertura con para-film.

7. Isolamento delle cellule cardiache

1. Isolamento e cultura dei cardiomiociti
   1. Centrifugare la sospensione cellulare a 25 xg per 1 min (senza brAcidi) a pelletare i cardiomiociti. I cardiomiociti possono anche essere lasciati saldare per 10 minuti a RT senza centrifugazione.
   2. Rimuovere attentamente il surnatante contenente cellule endoteliali e fibroblasti con l'aiuto di una pipetta di plastica usa e getta in un nuovo tubo da 50 ml.
   3. Resuspendere il pellet cardiomyocyte in Ca ²⁺ 6 mL soluzione 1 (fase 2.9). Lasciare 1 min per le cellule per regolare il basso livello di concentrazione Ca ²⁺ e centrifugare la sospensione cellulare a 25 xg per 1 min (senza freni).
   4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 6 ml di soluzione Ca ²⁺ 2 (punto 2.9). Lasciare le cellule 1 min per regolare la concentrazione intermedia di Ca ²⁺ e infine aggiungere alle cellule 12 mL di soluzione Ca ²⁺ 3 (fase 2.9). Mescolare con l'aiuto di una pipetta di plastica usa e getta.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare a 25 xg per 1 min.
   6. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 20 ml di pre- il mezzo CCT riscaldato. Aggiungere 1 ml della sospensione cellulare a ciascuno dei 20 piatti sterili di coltura da 35 mm pre-rivestiti con laminina (fase 2.9) e lasciare che le cellule si agganciano per 2 ore in un incubatore di coltura a cellule privo di CO ₂ .
      NOTA: I cardiomiociti possono anche essere coltivati ​​in ambiente CO ₂ ; Tuttavia, in questo caso dovrebbero essere utilizzati supporti con sistema di tampone bicarbonato.
   7. Dopo 2 ore, sostituire il mezzo con nuovi 2 mL di terreno CCT per rimuovere le cellule morte.
      NOTA: Le cellule sono pronte per qualsiasi sperimentazione pianificata e possono essere coltivate per un massimo di 3 giorni in un tipico incubatore di colture cellulari (senza CO ₂ ) senza perdita significativa di cellule viventi. I cardiomiociti a forma di forma sana tipici sono mostrati nella Figura 2A .
2. Isolamento di cellule endoteliali e fibroblasti
   1. Centrifugare il surnatante contenente cellule endoteliali e fibroblasti (dal punto 7.1.2) a 250 xg per 10 min.
   2. Scartare la steccaRantare e risospendere il pellet di cellule in 1,5 mi di tampone di isolamento delle cellule endoteliali in un tubo di campione da 2 mL.
   3. Aggiungere 3 μg (1: 500) di anticorpo anti-ratto CD31 al mouse alla sospensione cellulare e incubarli a 4 ° C per 30 minuti con rotazione end-to-end.
      NOTA: Si raccomanda una titolazione dell'anticorpo per una diluizione ottimale. Questa fase deve essere eseguita a 4 ° C, mentre a RT una rapida internalizzazione dell'anticorpo da cellule endoteliali comporterà un basso rendimento.
   4. Aggiungere le branche IgG anti-mouse IgG preparate in precedenza (sezione 3) alla sospensione cellulare e incubare per 20 minuti a 4 ° C con rotazione end-to-end.
      NOTA: In alternativa, l'anticorpo anti-ratto CD31 del mouse può essere pre-fissato alle perline magnetiche e quindi aggiunto alla sospensione cellulare. Tuttavia, ciò aumenterà il tempo di incubazione delle perle con la sospensione cellulare e può determinare un aumento della non-specifica legame delle cellule non endoteliali e quindi una maggiore contaminazione di altri tipi di cellule.
   5. UNT la fine del tempo di incubazione degli anticorpi, posizionare il tubo contenente la sospensione cellulare in un rack magnetico e lasciare 2 min per sistemare le perline magnetiche attaccate alle cellule endoteliali al lato del tubo.
   6. Rimuovere attentamente il resto della sospensione cellulare (contenente principalmente i fibroblasti) utilizzando una pipetta da 1 ml e aggiungerla a un piatto di coltura da 10 cm contenente 10 ml di terreno di coltura di cellule fibroblastici (fase 2.3). Metterlo in un tipico incubatore di colture cellulari contenente il 5% di CO ₂ . La procedura continua nella fase 7.3.
   7. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio al tubo con perline magnetiche contenenti le cellule endoteliali.
   8. Bloccare il tubo, rimuoverlo dalla cremagliera magnetica e riposizionare con cura i branelli scuotendo delicatamente su e giù 4 - 5 volte. Riposizionare il tubo nel rack magnetico, lasciare che le perle si deposiscano sulla parete del tubo per 1 minuto e rimuovano con cura il tampone di lavaggio.
   9. Ripetere i passaggi di lavaggio 5 - 7 volte per eliminare qualsiasi n contaminanteCellule endoteliali.
   10. Resuspendere le cellule endoteliali attaccate alle perle in 1 ml di MV2 media di cellule endoteliali, aggiungere ad un singolo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare in un incubatore di colture di cellule CO ₂ .
   11. Lasciare che le cellule si attaccino durante la notte e cambiare il mezzo il giorno successivo e poi ogni 2-3 giorni finché le cellule diventano semi-confluenti (solitamente 5 - 7 giorni).
       NOTA: Le cellule endoteliali tipiche non confluenti dopo 3 - 4 giorni e le cellule endoteliali confluenti dopo 7-10 giorni di isolamento sono riportate rispettivamente nelle figure 3A e 3B . Le cellule possono quindi essere trypsinizzate (sezione 7.4) e seminate in un pallone di coltura cellulare T25.
3. Lavaggio e coltura dei fibroblasti (proseguire dalla fase 7.2.6)
   1. Dopo 1 ora di incubazione, aspirare il mezzo e lavare i fibroblasti attaccati al piatto di coltura cellulare aggiungendo un volume appropriato di PBS pre-riscaldato. Aspirare il PBS e ripetere la sTappare 2-3 volte ed aggiungere infine il mezzo di coltura di cellule fibroblastiche fresche pre-riscaldate.
   2. Lavare le cellule collegate nuovamente il giorno successivo con PBS pre-riscaldato (come nel passaggio precedente) e aggiungere il mezzo fresco pre-riscaldato. Cambiare il supporto ogni 2-3 giorni. Un tipico fenotipo di fibroblasti del giorno 2 dell'isolamento è mostrato in Figura 4A .
      NOTA: I fibroblasti diventano semi-confluenti solitamente entro 5-7 giorni e sono quindi pronti per essere trypsinizzati (sezione 7.4) e utilizzati per esperimenti pianificati. Con questa procedura, di solito otteniamo 95-99% di fibroblasti puro. Un fenotipo tipico dei fibroblasti del giorno 7 dell'isolamento è mostrato in Figura 4B .
4. Trypsinizzazione delle cellule endoteliali e dei fibroblasti
   1. Aspirare il mezzo dal piatto di coltura cellulare e aggiungere abbastanza PBS pre-riscaldato per coprire le cellule.
   2. Aspirare PBS e aggiungere abbastanza la soluzione tripsina (0,05% e 0,02% rispettivamente) per coprire le cellule e collocare inE 37 ° C incubatore per 5 min.
   3. Risospendere le cellule pipettando le cellule su e giù con l'aiuto di una pipetta da 1 ml e fermare l'azione della tripsina aggiungendo il 10% FCS.
   4. Pellet la sospensione cellulare mediante centrifugazione a 250 xg per 10 minuti a RT.
   5. Resuspendere le cellule in un appropriato volume di mezzo di coltura cellulare pre-riscaldato.

8. Caratterizzazione delle cellule endoteliali

NOTA: La purezza delle cellule endoteliali è determinata dall'assorbimento di Dil-Ac-LDL e dall'immunostaining del fattore von Willebrand (vWF). Le cellule sono visualizzate mediante fluorescenza o microscopia confocale ( figure 3C-3E ).

1. Assorbimento di Dil-Ac-LDL dalle cellule endoteliali
   1. Trypsinizzare le cellule endoteliali (fase 7.4) e coltivarle durante la notte su vetrini di vetro in una piastra a 12 pozzetti (circa 10 x 10 ⁴ cellule / cm ² ).
   2. Aspirare il mezzo e sciacquare le cellule con 1 ml di pre-wArmato HBSS.
   3. Aspirare l'HBSS e aggiungere 1 ml di terreno di coltura endoteliale contenente 10 μg / ml di Dil-Ac-LDL e lasciare le cellule in incubatore a 37 ° C per 4 ore.
   4. Aspirare il mezzo e risciacquare le cellule con PBS pre-riscaldato tre volte e fissarle con 1 ml di 4% di paraformaldeide (PFA, sciolta in PBS). Incubare con PFA a 37 ° C per 20 minuti.
      NOTA: il PFA è corrosivo; Utilizzare sempre guanti resistenti all'acqua durante la manipolazione della soluzione PFA.
   5. Aspirare il PFA, sciacquare le celle sul coperchio in una piastra a 12 pozzetti con 1 ml di PBS tre volte e incubarli con soluzione di colorazione nucleare TO-PRO (10 μM) per 1 h a RT.
      NOTA: se il filtro appropriato è disponibile per il microscopio, può essere utilizzato anche 4 ', 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI; 1 μg / mL). In questo caso il tempo di incubazione deve essere ridotto a 10 min.
   6. Sciacquare le cellule sul coperchio in una piastra a 12 pozzetti con 1 ml di PBS, aspirare il PBS e ripetere il passo tre volte.
   7. Prendi la cSovrapporre la piastra a 12 pozzetti e montarla su una lastra di vetro con una goccia di supporto. Le cellule sono pronte per essere visualizzate sotto un microscopio fluorescente / confocale. Usare un filtro di eccitazione di 530-560 nm per Dil-Ac-LDL, 640 nm per TO-PRO e 340-380 nm per DAPI.
2. Von Willebrand (vWF)
   1. Coltivare le cellule endoteliali come descritto nel punto 8.1.1.
   2. Aspirare il mezzo e sciacquare le cellule con 1 ml di HBSS pre-riscaldato; Successivamente, fissare con il 4% di PFA come descritto nel punto 8.1.4.
   3. Aspirare il PFA, sciacquare le celle sul coperchio in piastra a 12 pozzetti con 1 ml di PBS due volte e permeabilizzare le cellule con 1 ml di 0,1% Triton X-100 (in PBS) per 20 minuti a RT.
   4. Aspirare la soluzione permeabilizzante e incubare le cellule con soluzione di blocco (5% BSA / 5% FCS in PBS) per 1 h.
   5. Incubare le cellule con anticorpo anti-vWF coniglio (1: 100) a 4 ° C per una notte in una camera umidificata. Aggiungere una copertina senza thE anticorpo primario come controllo negativo.
   6. Sciacquare le celle sul coperchio in una piastra a 12 pozzetti con 1 ml di PBS tre volte e incubare le cellule con anticorpo Alexa Fluor-488 anti-coniglio (1: 500) e la soluzione di colorazione nucleare TO-PRO (10 μM) per 1 h A RT.
   7. Sciacquare le celle sul coperchio in una piastra a 12 pozzetti con 1 ml di PBS, aspirare il PBS e ripetere il passo tre volte.
   8. Prendete la copertura dalla piastra da 12 pozzetti e montatela su una lastra di vetro con una goccia di supporto di montaggio. Le cellule sono pronte per essere visualizzate sotto un microscopio fluorescente / confocale. Usare un filtro di eccitazione di 490 nm per vWF e 640 nm per la colorazione nucleare.

Risultati

La procedura di isolamento comporta una resa del 70-80% di cardiomiociti vivi, a forma di stelo e striato ( figure 2A e 2C ) che possono essere utilizzati per esperimenti pianificati. Nel nostro laboratorio i cardiomiociti vengono utilizzati abitualmente per l'analisi della segnalazione Ca ²⁺ . La Figura 5A mostra oscillazioni intracellulari di calcio [Ca ²⁺ ] _i in risposta all'isch...

Discussione

In questo articolo viene descritto un protocollo riproducibile per l'isolamento e la coltura di miociti cardiaci, cellule endoteliali e fibroblasti. Questo protocollo descrive l'isolamento simultaneo e di alta qualità dei principali tipi di cellule del tessuto cardiaco, vale a dire cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti, a differenza di un solo tipo di cellula. Un passo critico nella procedura di isolamento è la corretta digestione del tessuto cardiaco. Se la digestione è incompleta, può a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-vWF	Santa Cruz Biotech.	SC-14014
Calcium chloride	Merck	102378
Carnitin	Sigma-Aldrich	C0283
Collagenase type II	Worthington	LS004176
Creatin	Sigma-Aldrich	C0780
D-Glucose	Merck	108342
Dil-Ac-LDL	Thermo Scientific	L3484
EDTA Solution (0.2 M)	Biochrome AG	L2113
Embeding solution	Citiflour	AF1-25
Endothelial cell medium MV2	PromoCell	C-22022
Foetal calf serum (FCS)	Biochrome AG	S0615
Gentamicin	Serva Chemicals	47991
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
Isoflurane	Abbott	TU 061219
Laminin	Roche/Sigma	11243217001
M199 medium	Thermo Scientific	11150059
M199 medium (Powder)	Biochrome AG	T061
Magnesium sulphate	Sigma-Aldrich	63138
Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12)	Thermo Scientific	MA1-81051
NaCl solution (0.9%), Sterile	B. Braun	30820080
Pan mouse IgG beads (Dynabeads)	Thermo Scientific	11041
Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution	Santa Cruz Biotech.	sc-281692
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15070-063
Phosphate buffer saline (PBS) 1x	PAN-Biotech	P04-36500
Plastic consumables	Greiner Bio-One
Potassium Chloride	Merck	4933
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	7873
Sodium Chloride	Merck	6404
Sodium Hydroxide Solution (2 N)	Merck	109136
Sterile filtration system	Thermo Scientific	5660020
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
TO-PRO	Thermo Scientific	T3605
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma-Aldrich	T4174
Water, Sterile	B. Braun