Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l&#39;analisi del<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -reonilcarbamoyladenosine TcdA Funzione

Riepilogo

Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l'analisi di tRNA (UUU) in complesso con l'enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.

Abstract

Esistono metodi per l'espressione e la purificazione di tRNA (UUU) in Escherichia coli e l'analisi mediante test di ritardo di gel del legame di tRNA (UUU) a TcdA, una N ⁶ -reonilcarbamoyladenosina (t ⁶ A) deidratasi che ciclizza il treonilcarbamoil La catena laterale attaccata ad A37 nel loop di gambo anticodon (ASL) di tRNA a ciclica t ⁶ A (ct ⁶ A). La transcrizione del gene sintetico che codifica il tRNA (UUU) è indotta in E. coli con 1 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e le cellule contenenti tRNA vengono raccolte 24 h postinduzione. La frazione RNA viene purificata usando il metodo di estrazione di fenolo acido. Il tRNA puro viene ottenuto mediante una cromatografia di filtrazione a gel che effettua la separazione efficiente delle molecole di tRNA di piccole dimensioni dai più grandi acidi nucleici intatti o frammentati. Per analizzare il legame TcdA a tRNA (UUU), TcdA viene mescolato con tRNA (UUU) e separato su un gel agarosico nativo a 4 ° C.Il tRNA libero (UUU) migra più velocemente, mentre i complessi TcdA-tRNA (UUU) subiscono un ritardo di mobilità che può essere osservato durante la colorazione del gel. Abbiamo dimostrato che TcdA è un enzima tRNA (UUU) -binding. Questo test di ritardo di gel può essere utilizzato per studiare mutanti TcdA e gli effetti degli additivi e di altre proteine ​​sul legame.

Introduzione

Il saggio di ritardo di gel ¹ (noto anche come test di spostamento di mobilità elettroforetica, EMSA) è un metodo elettroforetico progettato per studiare e caratterizzare le interazioni proteiche-acido nucleico. Permette di analizzare le proteine-DNA e le interazioni proteine-RNA e in particolare le interazioni tra tRNA e proteine ​​leganti tRNA, utilizzando componenti purificati o miscele complesse di proteine ​​( ad es. , Lisati cellulari) o acidi nucleici ( ad esempio tRNA piscine). Abbiamo applicato saggi di retardazione del gel allo studio dell'interazione tra tRNA purificato (UUU) e TcdA, una N ⁶ -reonilcarbamoyladenosina (t ⁶ A) deidratasi, che ciclizza la catena laterale di treonilcarbamoil attaccata ad A37 nel ciclo anticodonale (ASL) Di tRNA a ciclica t ⁶ (ct ⁶ A) ^{2 , 3} . TcdA è anche conosciuto come CsdL ^{3 ,}F "> 4. Il gene tcdA / csdL forma un cluster con i geni ⁵ e ⁵ che codificano la cisteina desulfurasi e l'acquirente dello zolfo del sistema cisina sulfinasi desulfinato (CSD) ed è richiesto per sostenere la funzione TcdA in vivo ³ .

La ragione dietro i test di retardazione del gel è che, mentre le molecole di acido nucleico libere migrano rapidamente alla parte anteriore di acrilammide o gel agarosio in virtù della loro grande carica negativa, la mobilità elettroforetica dei complessi proteici degli stessi acidi nucleici è drasticamente ridotta. La riduzione della mobilità è visualizzata come un "spostamento" nei complessi proteici dell'acido nucleico, che risolvono come bande discrete. Il complesso proteico acido nucleico caricato e maggiormente mostrato mostra un maggiore spostamento o riduzione della mobilità su un gel.

Poiché la neutralizzazione del carico del complesso è un fenomeno universalePer i complessi di acido nucleico proteico, il saggio di retardazione del gel può essere applicato ad una vasta gamma di complessi e tipi di acido nucleico. Il metodo è semplice, poco costoso e può essere condotto in laboratori con attrezzature minime. Richiede solo piccole quantità di proteine ​​e tRNA. Questo è un vantaggio rispetto alle tecniche biofisiche alternative, che di solito consumano grandi quantità di campioni.

Il saggio di retardazione del gel è stato ampiamente usato per lo studio dei fattori di trascrizione. Il saggio è stato utilizzato per analizzare la cinetica legante, la forza e la specificità dei fattori di trascrizione per molte sequenze di DNA diverse. Fu proprio in questo campo che l'EMSA fu per la prima volta sviluppata ^{6 , 7} . I test di ritardo di gel con RNA ^{8 , 9 , 10 , 11} e molecole di tRNA sono stati utilizzati anche nella ricerca di ribosomiE di analizzare, come facciamo qui, gli enzimi che modificano i nucleosidi del tRNA post-trascrizionale.

Molti parametri diversi influenzano il risultato di un test di ritardo di gel come la temperatura, la qualità della proteina e il campione tRNA e la forza del legame. La pianificazione e l'esecuzione attenta dell'esperimento è fondamentale per l'interpretazione dei risultati delle specie libere di acido nucleico e proteine. Qui abbiamo usato il tRNA (UUU) codificante gene sintetico clonato in un vettore di espressione il cui promotore manca del sito di legame dei ribosomi Shine-Dalgarno, portando alla sintesi di grandi quantità del tRNA ² . Questo protocollo dettagliato è inteso a fornire una guida chiara per eseguire esperimenti di ritardo del tRNA gel evitando errori comuni.

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Protocollo

Attenzione: Prima dell'uso consultare tutte le schede tecniche di sicurezza relative ai materiali (MSDS). Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche e corrosive. Utilizzare pratiche appropriate quando si esegue l'estrazione di tRNA utilizzando fenolo, incluso l'uso di un cappuccio e delle attrezzature di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse, ecc .). Questo protocollo utilizza una macchia acida nucleica non tossica. L'uso di macchie alternative può richiedere ulteriori precauzioni e smaltimento specializzato del colorante se tossico e / o cancerogeno ( es . Bromuro di etidio).

1. Preparazione del gel agarosico

1. Pesare 2 g di agarosio e aggiungerlo ad una bottiglia di vetro per preparare un gel agarosico al 2% in peso.
2. Aggiungere 100 ml di tampone di tris-borato-etilendiammetraacetico (EDTA) (TBE) alla bottiglia contenente agarosio. Sciogliere per riscaldamento in un forno a microonde. A intervalli di 30 secondi, ruotare il contenuto da mescolareBene e ripetere questa fase fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Lasciare raffreddare la soluzione agarosa a circa 50-60 ° C.
3. Nastri i bordi aperti di un vassoio di gel per creare uno stampo, posizionare un pettine appropriato per creare i pozzetti e lanciare l'agarosio fuso in esso. Evitare la formazione di bolle e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente.
4. Una volta solidificato, posizionare il vassoio gel in un'unità di elettroforesi e riempirlo con tampone TBE fino a quando il gel è completamente coperto.

2. Preparazione del tRNA

1. Express tRNA (UUU) in E. coli
   1. In mattinata, utilizzare un flacone di E. coli BL21 congelato (DE3) trasformato con il vettore di espressione pET23d-EcUUU ² (porti il ​​gene che codifica E. coli tRNA (UUU)) per strisciare un Luria Broth (LB) Piastra integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Invertire la piastra e posizionarla in un incubatore a 37 ° C fino a quando le colonie non appaiono (tardi afternoon).
   2. Inoculare una ben coltivata singola colonia in 5 mL di LB e 100 μg / mL di ampicillina e si sviluppa per una notte a 220 giri / min a 37 ° C.
   3. La mattina successiva, le cellule (6,500 xg per 10 minuti a 4 ° C), sostituire il mezzo con 5 ml di LB fresco e 100 μg / mL di ampicillina e risospendere. Utilizzare questa sospensione per inoculare 200 mL LB più 100 μg / mL ampicillina. Crescere per 5 ore a 220 giri / min a 37 ° C.
   4. Quando la densità ottica della coltura a 590 nm (OD ₅₉₀ ) ha raggiunto 0,6 - 0,8, aggiungere 1 mM IPTG alla coltura per innescare l'espressione del gene tRNA (UUU). Incubare a 37 ° C per 3 ore.
   5. Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 6.500 xg per 10 minuti a 4 ° C.
2. Lisi e estrazione
   1. Resuspendere il pellet cellulare in 5 ml di tampone di lisi (0,3 M acetato di sodio, 10 mM EDTA). Da questo punto in poi, utilizzavano buffers autoclavati e mantenete tutti i campioni contenenti tRNA a 4 ° C per evitare tRNA degradazione.
   2. Aggiungere 1 volume di fenolo acido (pH 4,3) al pellet di cellule risospese nel cofano. Mescolare per 1 min per inversione per lire le cellule e centrifugare a 10.000 xg (10 min, 4 ° C).
   3. Raccogliere la fase acquosa superiore contenente il tRNA solubile (UUU) (e minori concentrazioni degli altri pool di tRNA) usando una pipetta facendo attenzione a non aspirare la fase organica (inferiore). Scartare lo strato inferiore e il pellet, costituito dalla fase organica e dai detriti cellulari, in un contenitore adeguato.
   4. Precipitare il tRNA mescolando accuratamente la fase solubile (acquosa) con etanolo da 2,5 vol. Al 100% v / v per inversione per 1 h a 4 ° C. Centrifugare la miscela a 15.000 xg (30 min, 4 ° C).
   5. Decanta il supernatante con attenzione e riposiziona il pellet ricco di tRNA in tampone di filtrazione gel da 4 mL (20 mM fosfato di sodio o fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Eseguire 5 μL del pool tRNA risospeso in un agarosio di 2% in peso.
      NOTA:Il tRNA di buona qualità appare come una singola banda (dimensione molecolare tra 50-100 bp).
3. Purificazione di tRNA (UUU)
   1. Seguendo la pratica cromatografica standard ¹² , caricare il tRNA (UUU) resuspendito su una colonna di filtrazione gel ad alta risoluzione (dimensioni: 16 x 600 mm, volume letto: 120 mL, intervallo di risoluzione: 1.000-70.000 Da) precedentemente equilibrato nel tampone di filtrazione gel (fase mobile). Impostare la portata a 1 mL / min per eluire i campioni.
      NOTA: Il picco di tRNA (UUU) eluisce approssimativamente a 75,5 ml. In genere, si può ottenere una resa di 0,5-1,0 mg / l tRNA di coltura.
   2. Analizzare i campioni nei volumi rappresentativi di eluizione mediante elettroforesi di 5-10 μL di ciascun campione su un agarosio 2% in peso di agarosio.

3. Preparazione del campione

1. Esprimere e purificare TcdA secondo López-Estepa et al . ² .
   NOTA: Fino a 250 μMTcdA può essere utilizzato per lo studio.
2. Pipettare la corrispondente quantità di TcdA come indicato nella tabella 1 in tubi centrifugati di 1,5 ml etichettati correttamente. Aggiungere 1,6 mM di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) (concentrazione finale) e mescolare delicatamente usando una pipetta. Chiudere il coperchio e incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min.
3. Aggiungere 10 μM di trifosfato di adenosina (ATP) e 50 mM di MgCl2 (concentrazioni finali). Mescolare con una pipetta e incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Aggiungere il tRNA purificato (UUU) (sezione 2.3) secondo la tabella 1 , mescolare con una pipetta e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
5. Aggiungere salina tampone fosfato (PBS) fino a 100 μL di volume finale. Mescolare correttamente e aggiungere glicerolo ad una concentrazione finale del 10% v / v.
6. Vortice il campione e brevemente scomponi il contenuto del tubo (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).

4. Sviluppo del gel e di elettroforesi

1. Posizionare l'unità di elettroforesi in un vassoio pieno di ghiaccio tritato per mantenere la camera a 4 ° C durante l'esecuzione dell'elettroforesi.
2. Attentamente, pipettare 5 μL di ogni campione nel pozzetto corrispondente. Aggiungere un indicatore appropriato del DNA.
3. Inserire gli elettrodi negli appositi alloggiamenti dell'alimentatore. Accendere l'alimentatore e impostare la tensione su 100 V e far funzionare il gel per 90 minuti.

5. La colorazione del gel per osservare l'interazione tRNA-Protein

1. Preparare la soluzione di colorazione mescolando 50 ml di TBE con 1x di una macchia adeguata del DNA. Evitare di esporre la soluzione di colorazione alla luce solare coprendo il contenitore di colorazione con foglio di alluminio.
   NOTA: le macchie di DNA vengono normalmente memorizzate come scorte concentrate di 10.000 o 20.000x.
2. Dopo 90 minuti di elettroforesi, rimuovere accuratamente il gel dal vassoio e metterlo in un contenitore con una soluzione di colorazione. Posizionarlo su un bilanciere a bassa velocità di rotazione a temperatura ambienteUre per 30 min.
3. Rimuovere il gel agarosio dal contenitore di colorazione, toccarlo con cura su un pezzo di tessuto di cellulosa o carta filtrante per rimuovere il liquido in eccesso e collocarlo direttamente su un transilluminatore. Accendere la luce UV per visualizzare le bande contenenti tRNA. Prendi una fotografia del gel.
4. Colorazione delle proteine ​​(opzionale).
   1. Eliminare in modo sicuro la soluzione di colorazione del DNA (secondo procedure di sicurezza) e sostituirla con 50 ml di soluzione Coomassie Brilliant Blue (CBB). Posizionare il vassoio su un bilanciere a temperatura ambiente e macchiare durante la notte (> 12 h). Eliminare la soluzione di colorazione CBB e sostituirla con 50 mL di PBS per rimuovere la tintura in eccesso. Destain per 1 ora su un rocker.
5. Visualizzare i complessi tRNA contenenti proteine ​​sotto un transilluminatore di luce e fotografare il gel da confrontare con l'immagine del gel tRNA UV.

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Risultati

Grandi quantità di tRNA (UUU) possono essere ottenute esprimendo il gene tRNA in E. coli sotto il controllo di un forte promotore T7 inducibile. L'espresso tRNA (UUU) si accumula nel citoplasma e si arricchisce sulla piscina di tRNA naturali abbondanti. Un procedimento di purificazione a due fasi costituito da una fase di cattura / estrazione e una fase di filtrazione / lucidatura gel è stata utilizzata per ottenere il tRNA di grado EMSA. La fase di cattura / estrazione ut...

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Discussione

Il saggio di retardazione del gel agarosico di proteina-tRNA descritto qui può essere modificato in diversi modi. In primo luogo, la percentuale di agarosio nel gel può essere ridotta per consentire la separazione e la visualizzazione di complessi proteina-tRNA significativamente più grandi di quelli analizzati qui (120 kDa). In secondo luogo, se la proteina bersaglio è termolabile, occorre prendere ulteriori precauzioni per garantire che la temperatura sia mantenuta al di sotto della massima temperatura accettabile...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli BL21(DE3)	Novagen	70235	DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.
pET23d	Novagen	69748-3	pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.
LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated	Melford	GL1703	Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.
Ampicillin	Sigma-Aldrich	10419313
Incubator Shaker (Thermostated)	NBS	Excella E24	Any shaker incubator with temperature control can be used.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99%	Acros Organics	BP1755
Sodium acetate, anhydrous, >99%	Melford	B4017
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99%	Acros Organics	AC327205000	Harmful if inhaled.
Centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5430
Centrifuge (refrigerated) rotor	Eppendorf	5430/5430P
Centrifuge	Sorvall	RC5C
Centrifuge rotor	Sorvall	SLA-3000
Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2	Sigma-Aldrich	P4682	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive
Ethanol absolute for analysis, 100% v/v	Merck Millipore	100983
Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99%	Sigma-Aldrich	71643
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4	Merck	48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75	GE Healthcare	28989333
Agarose	Melford	MB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]	Melford	T1513
Boric Acid	Melford	B0503
Microwave	Haier	HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]	Sigma-Aldrich	C4706	Corrosive to metals and skin.
ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99%	Sigma-Aldrich	A2383
Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98%	Sigma-Aldrich	M8266
Sodium chloride (NaCl), >99%	Fisher Bioreagents	BP358
Potassium chloride (KCl), >99%	Melford	P0515
NZYDNA Ladder VI	NZYtech	MB8901
Power supply	Consort	EV261
Electrophoresis unit	Real Laboratory	RELSMINI10
Real Safe nucleic acid staining	Real Laboratory	RBMSAFE	20,000X stock
UV Transilluminator (G:Box/EF)	Syngene	2216498
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich	B0770
Rocker (Gyro-Rocker)	Stuart	SSL3
Mixer Vortex	Fisher brand	13214789