Protocollo per HER2 pescare con un fissativo tessuto-cross-linking, privo di formalina per combinare i vantaggi di crioconservazione e fissazione in formalina

Riepilogo

Ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) è spesso necessaria in combinazione con l'istopatologia e diagnostica molecolare per la selezione della terapia in medicina personalizzata. Un fissativo di romanzo-cross-linking, privo di formalina tessuto che permette alta qualità morfologiche, molecolare e analisi dei pesci dallo stesso campione tramite l'aggiunta di un passaggio di post-fissazione prima di pesce è presentato.

Abstract

Valutazione morfologica dei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE) è stato il gold standard per la diagnostica del cancro per decenni a causa della sua ottima conservazione della morfologia. Medicina personalizzata fornisce sempre più individualmente adattate e mirate terapie per malattie individuali caratterizzati abilitati da tecnologie combinate di analisi morfologiche e molecolare e diagnostica. Prestazioni di analisi morfologiche e molecolari dallo stesso campione di FFPE sono impegnativo a causa dell'impatto negativo di formalina a causa di modificazione chimica e cross-linking di acidi nucleici e proteine. Un fissativo tessuto-cross-linking, privo di formalina è stato recentemente sviluppato per soddisfare entrambi i requisiti, vale a dire, per preservare la morfologia come FFPE e biomolecole come crio-conservazione. Poiché il pesce è spesso necessaria in combinazione con l'istopatologia e diagnostica molecolare, abbiamo testato l'applicabilità dei protocolli di pesce sui tessuti trattati con questo nuovo fissativo. Abbiamo trovato quella post-fissazione formalina di sezioni istologiche dei non-cross-linking, privo di formalina e seno per (NCFPE) a paraffina cancro del tessuto generato risultati equivalenti a quelli con tessuto FFPE nel recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) Analisi dei pesci. Questo protocollo descrive come un saggio FISH originariamente sviluppato e validato per tessuto FFPE può essere utilizzato per tessuti NCFPE da una semplice fase di post-fissazione delle sezioni istologiche.

Introduzione

Medicina personalizzata si basa sempre più su test multi-parametro di analisi morfologica e molecolare del tessuto. Fissazione in formalina di tessuti come il gold standard fornisce eccellenti qualità morfologiche^1,2. Tuttavia, modificazione chimica formalina-indotta e cross-linking delle proteine e acidi nucleici^3,4,5 negativamente interferisce con l'analisi molecolare⁶. Queste modificazioni molecolari limitare la qualità di acidi nucleici e proteine e potrebbero gene sequenza manufatti⁷ o ridotta sensibilità della reazione a catena della polimerasi (PCR)-base di saggi⁸. Anche se gli sforzi principali sono state prese per ottimizzare i test molecolari per tessuto FFPE, cryo-conservazione di tessuti è in generale superiore alla fissazione in formalina, rendendo necessario dividere i campioni di tessuto per le procedure di conservazione diversi. Per evitare la necessità di cryo-conservazione per analisi molecolari, un non-cross-linking, privo di formalina fissativo, tessuto PAXgene è stato sviluppato. Questo sistema disponibile in commercio è costituito da una fissazione e una soluzione di stabilizzazione contenente diversi alcoli, acido acetico e un composto organico solubile. Buona conservazione degli acidi nucleici, proteine (defosforilata) e morfologia è stata indicata in parecchi studi^{6,9,10,11,12,13}.

Una particolare applicazione nella diagnostica del cancro è pesce rilevare un'ampia gamma di alterazioni cromosomiche, come ad esempio traslocazioni, delezioni submicroscopiche e amplificazioni ¹⁴. Ad esempio, il venti per cento dei tumori del cancro al seno invasivo mostrano amplificazione del recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) gene^15,16,17, che è associata con la prognosi difficile^{18 ,19}. Determinazione dello status di sovraespressione e amplificazione di HER2 nel cancro al seno dai pesci è necessario per selezionare i pazienti per la terapia anti-HER2-diretto ed è uno strumento diagnostico elencato dalla Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)¹⁷. Al fine di consentire una vasta applicazione di test diagnostici di accompagnamento a base di pesce nella cura della salute, le analisi sono state sviluppate e approvate per tessuti FFPE.

In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che i tessuti NCFPE non possono essere utilizzati per analisi di pesce che sono state approvate per tessuto FFPE. Tuttavia, test di tempo serie di post differenti procedure di fissazione dei tessuti NCFPE con formaldeide 4% tamponato ha mostrato che pubblica i tempi di fissazione di 18 h o più delle sezioni del tessuto NCFPE raggiunti risultati equivalenti a quelli con FFPE tessuti¹⁴.

In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato e dimostrare che l'impatto del tessuto-cross-linking, privo di formalina fissazione e 24h 4% tamponata la post-fissazione formaldeide su sezioni usato per qualità del pesce di HER2 e RNA dallo stesso campione di tessuto primario.

Figura 1: diagramma che mostra i passaggi per ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) e analisi di RNA di formalina riparata paraffina (FFPE) e non-cross-linking, privo di formalina fisso paraffina incastonato tessuti (NCFPE). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Università medica di Graz (riferimento numero 20-066), Austria. Campioni di tessuto sono stati ottenuti da due casi di tumori al seno invasivi primario chirurgicamente resecata dopo i pazienti avevano dato il consenso informato scritto.

1. fissazione del tessuto

Nota: Tessuto fissazione è eseguita sia con soluzione standard di formalina tamponata al (Raffaele), definito come soluzione di formalina al 10% contenente una frazione in massa di 3,7% (corrispondente a una frazione di volume pari al 4%) formaldeide tamponato a pH 6.8 a pH 7.2 secondo CEN/TS 16827-1:2015 o il sistema di fissaggio del tessuto-cross-linking, privo di formalina (noto anche come la soluzione di fissaggio alternativo qui sotto) che consiste di un fissativo e una soluzione di stabilizzatore a temperatura ambiente (TA).

1. Tagliate il petto di campioni di tessuto del cancro con un bisturi sterile in due metà ogni 4 mm di spessore per garantire quantità sufficiente del tessuto. Utilizzare una dimensione massima di 4 x 15 x 15 mm per il fissaggio del tessuto NCFPE o Raffaele.
2. Posizionare ogni metà dell'esemplare del tumore in una cassetta di tessuti standard e immergerlo in Raffaele o la soluzione di fissaggio alternativo per 24 h con un volume per ogni rapporto di volume (v/v) di una parte del tessuto (tessuto di 4 mL/1 g (idealmente 10ml/1g)) e 4 parti di fissativo.
3. Trasferire i campioni in alternativa fissato nella soluzione stabilizzatore per 2-72 h apertura del contenitore, girando la cassetta istologica di 180° e sommergendola.
4. Posizionare le cassette di tessuto con i campioni di Raffaele-fisso in 250 mL di etanolo al 70% per 30 min a RT per rimuovere residui Raffaele.
   Nota: Questo passaggio è importante per evitare la contaminazione di Raffaele di-cross-linking di campioni trattati con fissativo nel processore tessuti automatizzato, che distruggerebbe le proprietà benefiche di fissativi-cross-linking per conservazione di biomolecole.
   Attenzione: Raffaele è una soluzione pericolosa, provoca irritazione cutanea, lesioni oculari gravi, può causare una reazione allergica cutanea, è sospettato di provocare alterazioni genetiche, può causare cancro, irritazione delle vie respiratorie, sonnolenza e causa danni agli organi. Il fissativo alternativo è tossico per inalazione, a contatto con la pelle e ingestione, irritante per gli occhi e la pelle, pericolo di effetti irreversibili molto gravi per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Inalazione e contatto fisico dovrebbe essere evitati per entrambe le soluzioni fissazione. Indossare indumenti di protezione, guanti e protezione degli occhi e del viso. Lavorare in una cappa aspirante.
5. Procedere alla lavorazione del tessuto, l'incorporamento e tessuto sezionamento (sezioni 2 e 3).

2. tessuto lavorazione e incorporamento

1. Eseguire graduale disidratazione di cassette per tessuti con i campioni di tessuto fisso in 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min), ed etanolo al 99% (2 x 60 min), seguita da xilene (2 x 60 min). Quindi si infiltra in con paraffina in un processatore automatico (4 x 45 min).
2. Mediante pinze, inserire i campioni disidratati e paraffina-infiltrato (in alternativa e Raffaele-fisso) in stampi in metallo.
3. Incorporare i campioni in paraffina fusa di 5-10 mL (punto di solidificazione 56-58 ° C) utilizzando un'inclusione in paraffina strumento.
4. Posizionare gli stampi su una piastra di raffreddamento a-5 ° C per 30 min.
5. Recuperare i blocchi di tessuto paraffina-incastonato dagli stampi.
6. Memorizzare i blocchi risultanti (in alternativa-fisso, paraffina-incastonati (NCFPE) e Raffaele-fisso paraffina (FFPE)) al buio a 4 ° C fino all'utilizzo.

3. preparazione di sezionamento e diapositiva tessuti per pesce

Nota: FFPE sezioni direttamente vengono utilizzate per i pesci, mentre scivoli con sezioni NCFPE post-corretti in Raffaele per 24 h prima della procedura di pesce.

1. Inserire una lama monouso il microtomo e regolare il microtomo a 10 µm.
2. Prendere il primo blocco dalla piastra di raffreddamento e inserirla nello strumento.
3. Tagliare il blocco fino a quando si ottiene una superficie uniforme. Pulire il microtomo utilizzando un pennello e regolarlo a 3 µm. scartare le prime 2-3 sezioni.
4. Tagliare 3 µm sezioni dei blocchi NCFPE e FFPE e metterli in una vasca di acqua fredda (acqua ultrapura).
   Nota: Per ottenere fotografie migliori senza nuclei sovrapposti, qui, immagini di 2 µm sezioni invece di 3-5 µm, come consigliato nelle istruzioni del produttore sono indicate.
5. Raccogliere ogni sezione galleggiante con un pennello fine e un ago su un vetrino da microscopio rivestito per adesione delle sezioni del tessuto.
6. Immergersi questa diapositiva in un ambiente caldo (40 ° C) bagno di acqua e lasciare che la sezione allungare completamente.
7. Mettete la sezione sul vetrino tirando con cautela lo scivolo fuori dall'acqua ed evitare le rughe.
8. Lasciate che tutte le sezioni asciugare a temperatura ambiente per 1 h.
9. Riscaldare le diapositive a 70 ° C per 30 min in un incubatore per sciogliere la paraffina.
10. Mettere le diapositive orizzontalmente in un vetro vaso di colorazione.
11. Reidratare il graduale a RT in vaschette per la colorazione di sezioni riempite con 250 mL ciascuno dei seguenti liquidi: 100% xilene 2 x 15 min, etanolo 96% 2 x 15 min, 90% etanolo 2 min, 2 min, 2 min, 50% etanolo etanolo al 70% di etanolo di 80% min 2 e distillata acqua 2 x 10 min.
    Attenzione: Eseguire la procedura di sparaffinatura e reidratazione in una cappa, non inalare solventi tossici volatilizzati.
    Nota: A seconda delle sezioni e del tessuto, può essere necessario testare tempi diversi di incubazione in anticipo.

4. post-fissazione degli esemplari NCFPE

1. Eseguire post-fissazione di diapositive NCFPE inserendole in una vaschetta di colorazione nuova riempita con Raffaele per 24 h a RT. posto il vaso in una cappa durante la fase di post-fissazione di 24 h.
2. Rimuovere Raffaele in eccesso mediante lavaggio con fosfato tampone salino (3 x 10 min) e distillata (2 x 10 min).

5. in situ l'ibridazione di fluorescenza (pesce)

Nota: Qui pesci è effettuata utilizzando la sonda di doppio colore di HER2/CEN17 disponibile in commercio Kit secondo le istruzioni del produttore. Non consentire le sezioni di tessuto a secco durante l'ibridazione e fasi di lavaggio. Non consentono la sonda di DNA e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA controcolorazione soluzioni per essere esposta alla luce per un periodo più lungo. Eseguire questi passaggi nel buio utilizzando contenitori tenuta di luce. Secondo l'età e la fase di fissazione del materiale campione, è possibile aumentare o diminuire la denaturazione e temperature per ottenere risultati migliori di ibridazione di lavaggio.

1. Posizionare una vaschetta di colorazione contenente 250 mL di soluzione di pre-trattamento termico acido citrico in un bagno d'acqua di 98 ° C.
2. Posizionare il FFPE reidratato e post-fisso NCFPE scivola nel barattolo e incubare per 15 min.

Non usare più di sei diapositive per vaso di colorazione.

Lavare i vetrini in acqua distillata per 3 min a RT in una vaschetta di colorazione nuova.

Per proteolisi, porre i vetrini in un sistema di ibridazione a temperatura controllata a 37 ° C.

1. Applicare immediatamente, la soluzione di pepsina the-ready-to-use (2mg/ml) goccia a goccia (~ 30 µ l per goccia) per le sezioni di tessuto fino a quando non è completamente coperto. Incubare per 9 min a 37 ° C nel sistema di ibridazione.
   Nota: È consigliabile un tempo di incubazione di 5-15 min. Il momento ottimale per proteolisi deve essere accertato in anticipo.
2. Porre i vetrini in un barattolo contenente il tampone di lavaggio SSC e incubare per 5 min.
3. Sciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 min a TA.
4. Eseguire la disidratazione delle sezioni negli alcoli graduati seguenti: 50%, 70%, 90% e 100% per un minimo di 1 aria a secco le sezioni.
5. Per l'ibridazione, dispensare 10 µ l di sonda HER2/CEN17 sulle sezioni di tessuto essiccato, coprire ciascun campione con un vetrino coprioggetto e sigillare con cemento di gomma.
   Nota: 10 µ l di sonda è consigliato per area di tessuto di 22 x 22 mm. Un leggero calore della sonda semplifica il processo di pipettaggio. Evitare le bolle e lunga esposizione della sonda alla luce.
6. Co-denaturare la sonda e il campione del DNA nel sistema di ibridazione a 75 ° C per 10 min.
7. Impostare il sistema di ibridazione a 37 ° C e si ibridano durante la notte.
8. Rimuovere con cautela il cemento di gomma con il forcipe di Alberino-ibridazione e rilevazione.
9. Incubare i vetrini in una colorazione barattolo contenente 37 ° C pre-riscaldati 1x lavaggio tampone A per 5 min, Rimuovi i coprioggetti.
10. Lavare i vetrini utilizzando pre-riscaldati 1 x lavaggio tampone A due volte per 5 min a 37 ° C.
11. Disidratare i vetrini in etanolo al 70%, 90% e 100%, 1 min ciascuno.
12. Asciugare i campioni in aria e proteggerlo dalla luce.
13. Per la colorazione, applicare 30 µ l DAPI-soluzione per l'area ibridizzata evitando bolle. Coprire le sezioni con un vetrino coprioggetti.
14. Incubare per 15 minuti al riparo dalla luce.
15. Rimuovere con cautela il DAPI-soluzione in eccesso premendo delicatamente il vetrino tra filtri di carta.
16. Conservare i vetrini a 2-8 ° C al buio per 2 settimane fino al valutazione mediante microscopia confocale.

6. confocale imaging e scansione di diapositive di pesce

1. Eseguire imaging confocale e la scansione delle diapositive su uno scanner digitale confocale equipaggiato con un 40x / 1.2 obiettivo di NA, quad-band filtri (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) e un 5.5Mpx, 16bit, raffreddato fotocamera semiconductor (CMOS) scientifico ossido di metallo complementare.
2. Acquisire le immagini con filtri per il verde (eccitazione: 503 nm, emissione: 528 nm) e arancione (eccitazione: 547 nm, emissione: 572 nm) canali.

7. interpretazione

Nota: La sonda di HER2/CEN17 è una miscela di un rosso fluorocromo-etichettati CEN17 sonda specifico per regione centromerica del cromosoma 17 alfa satellitare (D17Z1) e un verde fluorocromo-etichettati HER2 sonda specifica per il gene HER2 (sonda posizione 17q12). Gli esemplari del tumore con un HER2:CEN17 rapporto ≤ 2.0 al nucleo sono segnati come normale, mentre quelli con un rapporto di HER2:CEN17  2,0 sono segnati come amplificato¹⁷.

1. Eseguire analisi di qualità delle immagini con l'open source CaseViewer 2.1²⁰.
   1. Valutare almeno 20 celle che si trovano in due diverse regioni del componente invasiva del carcinoma come definito da un patologo. Includere i nuclei ben distribuiti chiaramente distinguibili nell'area di conteggio. Escludere dal conteggio regioni di tessuto al confine e aree retratti o spremuti.

8. qualità RNA

1. Estrazione del RNA
   1. Assicurarsi che tutti gli strumenti siano RNAsi liberamente. Utilizzare una soluzione di rimozione di RNAsi.
   2. 10 a 20 sezioni tagliate (5 µm di spessore) di campioni NCFPE o FFPE utilizzando un microtomo seguendo il protocollo fino al punto 3.8.
   3. Estrarre RNA da NCFPE campioni utilizzando l'isolamento di RNA kit (vedere la tabella dei materiali). Estrarre RNA da campioni FFPE utilizzando un kit di isolamento del RNA FFPE.
      Nota: Estrazione di RNA da fissativi-cross-linking richiede un metodo di isolamento adattato per il metodo di fissazione. Non utilizzare qualsiasi altri RNA metodo di isolamento (ad es. Trizol, RNeasy FFPE, ecc per esemplare di NCFPE).
   4. Determinare la concentrazione di RNA e la purezza utilizzando uno spettrofotometro. Il rapporto tra l'assorbanza a 260 nm e 280 nm (A260/280) dovrebbe essere ~ 2.0.
   5. Memorizzare il RNA isolato a-70 ° C fino a ulteriore analisi.
2. Eseguire una gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) in tempo reale la trascrizione d'inversione PCR utilizzando primers per generare ampliconi di diverse lunghezze^8,9.
   1. Utilizzare un kit di trascrizione inversa di cDNA secondo le istruzioni del produttore per la sintesi di cDNA. Utilizzare 500 ng RNA di ciascun campione. Negozio di cDNA a-20 ° C fino al successivo utilizzo.
   2. Preparare il mix master PCR secondo le istruzioni del produttore.
   3. Dispensare il mix master di PCR in triplici copie in una piastra di reazione a 384 pozzetti. Aggiungere 4 µ l di 01:16 diluito cDNA (modello di PCR). Eseguire la PCR secondo le istruzioni del produttore.
      Nota: Per GAPDH umana, sono stati utilizzati i seguenti primer: GAPDH avanti: a 5 minuti-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ´; GAPDH inverso: 71 5 ´-ACCAGGCGCCCAATACG-3 ´ bp, bp 5 ´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3 153 ´, 200 bp 5 ´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3 ´, 277 bp 5 ´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3 ´, bp 5 ´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3 323 ´ e 530 bp 5 ´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3 ´.
   4. Analizzare i risultati utilizzando un software applicabile alla macchina PCR. Prodotti non specifici devono essere esclusa in base al fusione curva analisi²¹.

Risultati

Determinazione di HER2 di pesce:

L'intensità del segnale di HER2-pesce da FFPE e NCFPE sono simili (Figura 2). Entrambi i casi nella maggior parte delle cellule mostrano un chiaro eccesso di segnale verde (a titolo indicativo del luogo del gene HER2 amplificato) rispetto il segnale rosso (CEN17 gene di riferimento). Pertanto, il caso dimostra un gene HER2 amplificato, che significa che questo paziente dovrebbe rispondere al trastuzumab, una terapia anti-HER2 mirati. L'esemplare FFPE servito come controllo positivo. I segnali osservati in cellule non-neoplastici (sia in FFPE e NCFPE) servono come riferimento interno e controllo negativo per l'amplificazione del gene HER2. Per ogni serie di analisi, almeno una sezione con amplificazione del gene noto lo stato dovrebbe essere utilizzata come controllo positivo per la reazione di ibridazione.

Qualità di RNA:

Campioni FFPE corrispondente e NCFPE da due diversi casi mostrano differenze di qualità di RNA impiegando trascrizione d'inversione PCR in tempo reale. Risultati ottenuti dimostrano l'efficienza di amplificazione diversi per amplicone diverse lunghezze (cioè, 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) del mRNA GAPDH. Tutti i valori di Ct (ciclo soglia) ottenuti da campioni FFPE erano superiori a quelli da NCFPE. Questa differenza dimostra la amplificability PCR inferiore di mRNA isolato dai tessuti FFPE, suggerendo una modificazione chimica più pronunciata. Inoltre, i più alti valori di Ct per lungo rispetto a breve ampliconi sono un indicatore per la frammentazione di mRNA. In confronto, le piste di valore di Ct delle lunghezze differenti amplicone Mostra più pronunciata frammentazione di mRNA in FFPE di tessuti NCFPE (Figura 3).

Figura 2: risultati rappresentativi di HER2 FISH per formalina corrispondente fissata paraffina incorporato (FFPE) e non reticolante, privo di formalina fisso paraffina embedded sezioni di tessuto (NCFPE). Corrispondenti campioni da stessi tessuti FFPE (A) e NCFPE (B) sono mostrati. Contrariamente alle cellule di normale interfase (C), dove sono attesi due verdi (HER2) e rosso (CEN17) due segnali, cellule con luogo del gene HER2 amplificato rappresentano copie multiple di segnali verdi (HER2) (D). Stato di amplificazione di HER2 era identico in entrambi FFPE e le sezioni NCFPE post-fisse (A, B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: risultati di un'analisi di PCR in tempo reale trascrizione inversa utilizzato per il controllo di qualità di RNA. Asse y: Valori di Ct (ciclo soglia) del gene GAPDH sono indicati per amplicone differenti lunghezze (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) sull'asse x. mRNA è stato isolato da FFPE e NCFPE di due campioni di tessuto del cancro seno diversi trattati in parallelo e trascritto a cDNA per PCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I risultati dimostrano due risultati principali. In primo luogo, un passo di post-fissazione Raffaele semplice 24h di sezioni tagliate dai tessuti NCFPE è sufficiente per ottenere risultati equivalenti a quelli con FFPE in analisi dei pesci usando le analisi di pesce approvate per tessuti FFPE (veda inoltre riferimento¹⁴). Questo protocollo ha il vantaggio di usando le analisi pesce originariamente sviluppato e approvato per FFPE senza la necessità di riconvalida completa (ad es., ottimizzando le condizioni di pre-ibridazione per tessuto non-cross-linked). Il protocollo di pesce può essere utilizzato esattamente come descritto nelle istruzioni del produttore.

Modifiche minori dalle istruzioni del produttore descritte in questo risultato di protocollo (ad esempio tessuto sezione diametro e incubazione periodi presso i passaggi di sparaffinatura) da precedenti adattamenti, che è esplicitamente raccomandato dal produttore Grazie all'utilizzo di diversi tipi di tessuto e metodi di fissazione.

Il passaggio di post-fissazione è fondamentale perché richiede un tempo di reazione chimico di 18-24 h, che estende il tempo di analisi di un giorno, ma permette il flusso di lavoro quotidiano stesso come sviluppato per tessuti FFPE (Figura 1). Raffaele è segnalato per penetrare il tessuto ad un tasso medio di 1 millimetro al ore²² a 5 mm a 2 h a seconda del tipo di tessuto^23,24. L'osservazione che solo lunghi periodi post-fissazione di più di 18 h potrebbero modificare le proprietà di NCFPE di sezioni FFPE, indica che non la penetrazione del fissativo ma il tempo di reazione chimico è fondamentale per raggiungere i risultati desiderati^{1 ,14}.

In secondo luogo, il tessuto restante del NCFPE che non viene utilizzato per la post-fissazione utilizzabile per ulteriori analisi molecolari come le biomolecole sono ben conservate. Questo è stato dimostrato da trascrizione d'inversione Real-Time PCR (Figura 3). Il test è più sensibile e specifico rispetto al valore RIN elettroferogramma-derivato (numero di integrità di RNA) in materia di qualità di RNA (cioè, modificazione chimica e frammentazione) per mRNA isolato da tessuti paraffina-incastonati⁸. Controllo di qualità è stato limitato in questo studio a PCR in tempo reale poiché gruppi indipendenti hanno dimostrato che oltre a RNA, la qualità di DNA e proteine isolate dal NCFPE è migliore di quella da FFPE tessuti ^{8,9, 13}.

Il protocollo presentato segue, ove applicabile (ad es., ricetta di Raffaele, condizioni di fissazione, controllo di qualità di RNA, convalida), i requisiti delle specifiche tecniche CEN per le procedure pre-analitiche per diagnostica in vitro (IVD), che sono stati recentemente rilasciati dal Comitato europeo di normalizzazione (CEN) (ad es. CEN/TS 16827-1:2015 per isolamento del RNA dai tessuti FFPE che si riferisce allo standard ISO 15189).

Il metodo è limitato a questo fissativo specifico. Anche se la buona conservazione delle biomolecole e morfologia utilizzando il fissativo-cross-linking, formalina-free è stata presentata in diversi studi, è usato principalmente nella ricerca, ma non in applicazioni mediche di routine. Uno dei motivi è che sostituendo il gold standard Raffaele fissazione da parte di un altro fissativo richiederebbe una varietà di studi di validazione come non tutti i protocolli ottimizzati per materiale FFPE possono essere utilizzati per materiali fissate con fissativi-cross-linking. Altri metodi di fissazione del tessuto non sono stati testati per questo protocollo di pesce.

Il semplice passaggio di post-fissazione descritto in questo manoscritto presenta il vantaggio di usando le analisi IVD approvato sia per tessuti FFPE e NCFPE.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany	www.sav-lp.de	FN-200L-4-1	Tissue fixative
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada	www.simport.com	M-498	Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765112	For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	813150	Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
Merck Millipore, Munich, Germany	www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html	MC1009834000	Dehydration of tissue samples
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany	https://at.vwr.com	10293EP	Dehydration of tissue samples
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria	www.herba-chemosan.at	2549662 32	Paraffin used in a tissue processing device
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria	www.LeicaBiosystems.com	39602004	Paraffin embedding medium
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria	www.sanova.at	5229	Paraffin embedding instrument for tissues for histology
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria	www.histocom.info	M 910010	This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark	www.chem.agilent.com	K802021-2	Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	73504	For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765134	For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany	www.zytovision.com	Z-2015-200	For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
3DHISTEC, Budapest, Hungary	www.3dhistech.com		Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4368814	The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4367659	PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE	www.thermofisher.com	Ser. Nr. F239	Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System	www.thermofisher.com	4485701	PCR machine,
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A	www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order	e.g. (ThermoBrite) 07J91-020	Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.