High-throughput analisi del comportamento motorio nell'analisi di Isola della drosofila

Riepilogo

Il metodo di isola è un relativamente nuovo, conveniente che può essere utilizzato per valutare il comportamento motorio di base di Drosophila melanogaster. Questo manoscritto descrive algoritmi per l'elaborazione dei dati automatica e quantificazione obiettiva dei dati di analisi isola, rendendo questo saggio una lettura sensibile, ad alta produttività per grandi schermi di genetici o farmacologici.

Abstract

Progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione contribuiscono all'identificazione di geni-malattia (candidato) per disturbi del movimento e altre malattie neurologiche a una velocità crescente. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa i meccanismi molecolari che sono alla base di questi disordini. Casella degli strumenti genetico, molecolare e comportamento di Drosophila melanogaster rende questo organismo di modello particolarmente utile per la caratterizzazione di nuovi geni-malattia e meccanismi in un modo ad alta velocità. Tuttavia, schermi ad alta velocità richiedono dosaggi efficienti ed affidabili che, idealmente, sono convenienti e consentire per la quantificazione automatizzata dei tratti rilevanti per questi disturbi. Il dosaggio di isola è un conveniente e facilmente il set-up metodo per valutare il comportamento motorio della drosofila . In questo saggio, mosche sono gettati in una piattaforma da un'altezza fissa. Questo induce una risposta motoria innata che consente le mosche fuggire dalla piattaforma in pochi secondi. Allo stato attuale, analisi quantitative di girato isola saggi sono fatto manualmente, che è un'impresa laboriosa, in particolare quando si eseguono grandi schermi.

Questo manoscritto descrive gli algoritmi"Drosophila isola Assay" e "Isola test Analysis" per high throughput, trattamento automatizzato di dati e la quantificazione dei dati di analisi di isola. Nell'impostazione di una semplice webcam collegata a un computer portatile raccoglie una serie di immagini della piattaforma mentre il test è eseguito. L'algoritmo di"Drosophila isola Assay" sviluppato per il software open-source Fiji elabora queste serie di immagine e quantifica, per ogni condizione sperimentale, il numero di mosche sulla piattaforma nel corso del tempo. Lo script di "Isola test Analysis", compatibile con il software gratuito R, è stato sviluppato per elaborare automaticamente i dati ottenuti e per calcolare se trattamenti/genotipi sono statisticamente differenti. Questo notevolmente migliora l'efficienza del test isola e rende una lettura potente per base locomozione e comportamento in volo. Così può essere applicato a grandi schermi indagando volare capacità dell'apparato locomotore, Drosophila modelli di disturbi del movimento e l'efficacia dei farmaci.

Introduzione

Negli ultimi anni, i progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione hanno notevolmente contribuito all'identificazione di geni alla base di disturbi del movimento degenerativa del cervello (per esempio, l'atassia cerebellare e morbo di Parkinson), di un neurone periferico origine (ad esempio, la sclerosi laterale amiotrofica e la paraplegia spastica ereditaria) e di origine muscolare (ad es., distrofia muscolare di Duchenne e la distrofia miotonica)^1,2,3,4 . Nonostante questo, piccolo è conosciuto circa i meccanismi molecolari che sono alla base della maggior parte di questi disturbi. Una migliore comprensione di questi meccanismi è essenziale per lo sviluppo di terapie.

Come nell'uomo, il movimento negli organismi di modello, come volo e locomozione in Drosophila, è controllato dalla centrale del cervello, sistema nervoso periferico e muscoli. Inoltre, il tempo di generazione veloce e toolbox genetica della drosofila rendono questo organismo di modello particolarmente adatto per lo screening di alto-rendimento di geni coinvolti nei disordini di movimento e per droga test^5,6 . A causa del notevole numero di condizioni che devono essere testati in tali schermi, affidabili, convenienti e relative analisi semplice, come pure strumenti per quantificare i risultati di uscita in modo automatico, sono altamente desiderabili.

Schmidt et al. (2012) ⁷ descritto un test di basso costo chiamato il "saggio di isola" per valutare il comportamento motorio della drosofila . Il dosaggio di isola è stato utilizzato con successo in proiezioni su larga scala per identificare geni con funzioni specifiche glia⁷, nella valutazione dei modelli di Drosophila di disabilità intellettiva⁸e per la valutazione generale di volare il comportamento del motore⁹. Il disegno di principio del dosaggio isola consiste di una piattaforma elevata sul quale vengono generate diverse mosche. Questo induce un innato comportamento motore che consente sani mosche fuggire dalla piattaforma in pochi secondi. Il test misura il numero di mosche restanti sulla piattaforma sopra tempo^7,8,9. Tutte queste caratteristiche indicano che il dosaggio di isola può essere uno strumento di screening potente per geni coinvolti nei disordini di movimento.

Attualmente, l'analisi quantitativa dei dati di analisi filmata isola avviene manualmente^7,8,9. Per migliorare l'efficienza del test, un metodo di basso costo è stato sviluppato per quantificare semi-automaticamente la fuga di mosche dalla piattaforma. Il programma di installazione utilizza una semplice webcam collegata a un computer portatile per raccogliere tempo immagine serie della piattaforma, con fotogrammi acquisiti ogni 0,1 s. telai vengono poi elaborati con la macro"Drosophila isola Assay" che quantifica il numero di mosche sulla piattaforma sopra tempo. La macro"Drosophila isola Assay" è diviso in tre sub-macro indipendente: (I) il "Crea stack e proiezione," Sub-macro identifica gli esperimenti differenti dell'isola memorizzati in diverse sottocartelle e crea uno stack e una proiezione di ciascuno serie temporali. (II) la Sub-macro "Piattaforma di definire" consecutivamente aprirà tutti i file "Projection_image_name.tif" presenti nelle singole sottocartelle sperimentale, al punto che all'utente è richiesto di definire manualmente la piattaforma dell'isola come la regione di interesse (ROI). (III) "analisi" quantifica automaticamente il numero di mosche restanti sulla piattaforma durante la serie temporale. Il sub-macro possono essere eseguite consecutivamente (in una sola volta) o in modo indipendente. Per l'analisi di dati statistici, uno script è stato sviluppato per elaborare automaticamente i dati ottenuti e applicare un test statistico per determinare se trattamenti/genotipi comportarsi significativamente differente da altro (Figura 1). Infine, è dimostrato che questa configurazione può essere utilizzata per valutare e quantificare la capacità dell'apparato locomotore aberrante di un modello di Drosophila per l'atassia-telangiectasia (AT).

Protocollo

1. costruzione della finestra di analisi isola

1. preparare un vassoio fatto di un materiale robusto, come poli metil metacrilato (PMMA), per contenere uno strato d'acqua (cioè una vasca). Assicurarsi che il materiale non sia bianco.
   Nota: Dimensioni di 40 x 35 x 2,5 cm ³ sono raccomandati ( Figura 1A).
2. Preparare una scatola (42 x 38 x 25 cm ³) fatta di un materiale robusto, trasparente, come il PMMA, da collocarsi intorno alla vasca per impedire la dispersione nello spazio laboratorio le mosche. Posizionare un foro (20 x 30 cm ²) sulla parte laterale che è abbastanza grande per lo sperimentatore facilmente gestire le fiale con mosche e rilasciarli sull'isola ( Figura 1A).
3. Preparare una piattaforma elevata 10 x 15 x 2,5 cm ³ in dimensione, fatta di un materiale impermeabile (PMMA o plastica) che è a tenuta stagno.
   Nota: Questa piattaforma è necessaria per avere una superficie bianca uniforme per garantire buon contrasto per analisi di immagine. La dimensione non è necessariamente corretto, ma dovrebbe essere abbastanza grande per assicurarsi che tutte le mosche inizialmente atterrare sulla piattaforma e ottenere la possibilità di camminare su di esso ( Figura 1A).
4. Difficoltà la piattaforma incollandolo al bagno oppure inserire i pesi o altri oggetti pesanti all'interno della scatola di piattaforma per impedire i cambiamenti posizionali della piattaforma durante la sessione sperimentale/riprese.

2. Requisiti software e installazione

1. l'installazione del software di registrazione di immagini.
   1. Per registrare la serie di immagini isola (Vedi Materiali tavolo) e installare il software su un computer, scaricare il software di registrazione di immagini.
      Nota: Il software di imaging-registrazione descritto in questo protocollo è supportato solo da Windows. Un'alternativa per gli altri utenti è stato aggiunto alla Tabella materiali.
2. " Drosophila isola Assay " installazione macro.
   1. Scarica il " Drosophila isola Assay " macro e il Fiji compatibile versione ¹⁰ (1.4 o superiore) sul seguente sito Web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
   2. Sposta il cursore per il " dosaggio isola " directory e fare clic su " vista. "
   3. Fare clic su " Scarica tutti. " il contenuto della cartella verrà scaricato come file. zip; decomprimere il file scaricato.
   4. Copia il " della drosofila isola Assay.ijm " il file in " Fiji.app/plugins/directory. "
      Nota: All'avvio di Fiji, il " Drosophila isola Assay " macro verrà visualizzata nella parte inferiore del menu a discesa plugins.
3. " Isola analisi analisi " installazione di script e download.
   1. Scarica R ¹¹ dal seguente sito Web: https://cran.rstudio.com. Installarlo su un computer.
   Studio di
   2. R scaricare dal seguente sito Web: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Installarlo su un computer.
      Nota: La " analisi test isola " script può essere eseguito solo con R. Studio di R, con l'interfaccia utente più semplice, si presenta come fase alternativa per gli utenti inesperti con R.
   3. Scaricare il " isola analisi analisi " di script dal " Drosophila isola Assay " directory presso il seguente sito Web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      Nota: dopo aver eseguito passo 2.2, il " isola analisi analisi " script possono anche essere trovati nella cartella decompressa chiamata " isola test. "

3. Preparazione delle mosche per essere analizzati con il test di isola

1. raccogliere in scena mosche per ogni condizione sperimentale in freddo o anidride carbonica (CO ₂) anestesia, come descritto in precedenza ¹³ (su un periodo di 1 - 2 giorni).
   1. Preparare un minimo di 3 fiale del campione a condizione sperimentale, ognuna contenente circa 15 in scena vola. Utilizzare solo Vola con ali intatte e che sono di simile età e sesso.
      Nota: Per gli esperimenti descritti qui, campione 5 fiale contenenti 15 mosche maschi dei genotipi w ^-; Actina-Gal4 / + (controllo) e w ^-; Actina-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) sono stati raccolti il giorno di sfarfallamento, affinato per 4 giorni e sono stati utilizzati per eseguire l'analisi di isola. RNAi, ceppi di controllo e il driver di actina-gal4 sono stati ottenuti da uno spot pubblicitario (Vedi Materiali tavolo) di origine.
2. Lasciare che le mosche recuperare per evitare effetti dagli anestetici (almeno 1 giorno quando usando CO ₂) prima del test le mosche raccolte nell'analisi della isola all'età di interesse.

4. messa a punto sperimentale

Nota: vedere Figura 1B.

1. Aggiungere acqua fredda con una piccola quantità di sapone per il bagno vassoio e posizionare la piattaforma al centro.
   Nota: Il sapone riduce la tensione superficiale dell'acqua; affogheranno mosche che toccano l'acqua. Questo impedisce gli importi aumentanti di mosche volanti nella casella durante la progressione della sessione sperimentale.
2. Posizionare la scatola trasparente sopra il vassoio e illuminare la piattaforma dall'alto con una lampada.
   Nota: Illuminazione della piattaforma è principalmente richiesto per assicurare adeguato contrasto dei video. Una normale luce LED 12 V è adatta per questo.
3. Posizionare la webcam direttamente sopra la piattaforma (all'esterno della casella) e collegarlo a un computer.
4. Creare nuove cartelle sul computer per memorizzare i dati sperimentali differenti prima gli esperimenti.
   1. Seguire la struttura dell'esempio illustrato nella Figura 2A per creare le cartelle. Ad esempio, se il disegno sperimentale richiede test due genotipi con cinque ripetizioni ciascuna, in primo luogo creare una cartella principale contenente la data dell'esperimento. All'interno della cartella principale, creare due sottocartelle (uno per genotipo). All'interno delle cartelle di genotipo, creare cinque nuove sottocartelle, uno per replicare.
      Nota: Per ulteriori analisi, è essenziale che la serie di immagini corrispondenti ai singoli esperimenti vengono salvata in cartelle con nomi univoci.

5. Configurazione impostazioni video nella " Capture Device " sezione dell'interfaccia

1. Apri il software di registrazione di immagini e, sotto la " cattura ", fare clic su " Time-lapse immagini … " e seleziona la webcam appropriata come il " Capture Device. "
2. posto una mosca morta sull'isola; regolare le impostazioni video cliccando sul " impostazioni Video " casella. Scorrere le barre degli strumenti, regolazione luminosità, contrasto e colore in modo tale che la mosca morta appare nera su sfondo bianco ( Figura 2B). Una volta completate le regolazioni, fare clic su " Ok. "

6. Registrazione e Video salvataggio impostazioni Setup nel " Time-lapse " sezione dell'interfaccia

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Regolare le impostazioni nel " Time-Lapse Movie installazione " per salvare l'esperimento come un file AVI. Fare clic su " Sfoglia …, " selezionare la directory dove verranno archiviati i film, definire il nome del video e premere " Salva. "
Nota: il file video non viene utilizzato per la quantificazione dei dati; tuttavia, potrebbe essere utile avere un'idea complessiva circa l'esperimento.

Regolare le impostazioni nel " Time-Lapse Movie Setup " sezione.

1. Nella casella di compressione, selezionare " codice Intel IYUV " per la compressione video e scegliere " prendere un fotogramma ogni 0.1 secondi, " con la " tasso di riproduzione (immagini per secondo): " alle 10.
2. Salvare le serie temporali di esperimento come BMP fotogrammi facendo clic sul " avanzate … " selezionare " creare un'immagine BMP per ciascuna catturato frame. " fare clic su " Sfoglia. " selezionare la directory stessa nella " acquisizione di filmati AVI durante " finestra (come scelta nel passaggio 6.1), fare clic su " aperta, " e premere " Ok. "
   Nota: si noti che, durante l'esperimento, i fotogrammi vengono archiviati come file BMP (necessari per l'analisi dei dati). Il programma nomi i fotogrammi come " A " seguita dal numero corrispondente alla sequenza di cattura fotogramma (ad es., " A_number.bmp ") ( Figura 2). Sempre salvare le immagini appartenendo a diversi esperimenti in una nuova cartella per garantire che serie di immagini registrate in precedenza non verrà sovrascritto. Essere consapevoli del fatto che le immagini non vengono salvate automaticamente nella stessa cartella del file video a meno che questa cartella sia selezionata in " Sfoglia … " cliccando il " avanzate " casella.

7. Isola di analisi e raccolta dati

1. premere il pulsante start nell'interfaccia del software di registrazione di immagini per avviare la registrazione time-lapse immagine.
2. Toccare sperimentale flaconcino contenente mosche (passaggio 3) 2 - 3 volte a garantire che le mosche sono in fondo del flaconcino. Rimuovere il tappo del flaconcino rapidamente e, con un movimento vigoroso, toccare il flaconcino sulla piattaforma in modo che tutte le mosche cadono sulla piattaforma allo stesso tempo ( Figura 1).
3. Dopo circa 30 s, premere il " Stop " pulsante per interrompere la registrazione.
   Nota: Se tutte le mosche spariscono dalla piattaforma, la registrazione può essere interrotta prima.
4. Rimuovere le mosche che rimangono per 30 s sulla piattaforma a mano dopo aver fermato la registrazione immagine.
5. Prima di procedere alla registrazione l'esperimento successivo, cambiare la directory di destinazione per i file BMP e film (Vedi sezione 6).

8. Elaborazione dei dati: In esecuzione il " Drosophila isola Assay " Macro

Nota: vedere Figura 1.

1. Eseguire la " creare stack e proiezione " Sub-macro che per la produzione di pile e proiezioni della serie raccolti immagine.
   1. Fiji di start, fare clic su " plugin " nella barra degli strumenti e abbiamo scelto " Drosophila isola Assay " nel menu a tendina; verrà visualizzata una nuova finestra.
   2. Invio il " prima immagine serie temporali identificatore " impostazione nell'interfaccia grafica macro.
      Nota: Le cornici immagine registrata vengono salvate come " A-number.bmp " secondo l'ordine in cui le immagini vengono ottenute. Nella " primo fotogramma identificatore " interfaccia di macro, riempimento in ambiente con il numero assegnato al primo fotogramma dal programma e con l'estensione del file. Riempire " primo fotogramma identificatore " con "-0001.bmp, " dal momento che il primo fotogramma viene chiamato " A-0001.bmp " ( Figura 2). Nel caso in cui altri formati di immagine (ad esempio TIFF o jpeg) vengono generati dal software della webcam, specificare l'estensione di file corretto della prima immagine in " prima immagine serie temporali identificatore. "
   3. selezionare solo il " creare stack e proiezione " Sub-macro, fare clic su " Ok, " e selezionare la directory principale che contiene tutte le sottocartelle con gli esperimenti di analisi di singole isole.
      Nota: I file BMP in ogni individuo sperimentare cartella che contengono il " primo fotogramma identificatore " saranno trattati successivamente. Per impostazione predefinita, due nuovi file verranno visualizzati nella sottocartella ogni singolo esperimento, denominato " Stack_image_name.tif " e " Projection_image_name.tif " ( Figura 1). Dopo questo passaggio viene eseguito, i file con estensione BMP possono essere eliminati. File con estensione TIF stack e proiezione contengono tutti i dati e sono sufficienti per ulteriori analisi.
2. Eseguire il " definire piattaforma " Sub-macro II per selezionare l'esatta posizione della piattaforma.
   1. Aprire l'interfaccia grafica della " Drosophila isola Assay, " selezionare solo il " definire piattaforma " casella di controllo e premere " Ok. "
   2. nella " scegliere una Directory " finestra, selezionare la directory principale dove sottocartelle sperimentale sono memorizzate e premere " selezionare. "
      Nota: il " definire piattaforma " Sub-macro cerca automaticamente per " Projection_image_name.tif " file in tutte le sottocartelle memorizzate nella directory principale. La " Projection_image_name.tif " immagine memorizzata nella prima cartella, insieme con due finestre — " definire la piattaforma " e " manager ROI " — aprirà.
   3. Seleziona il " poligono selezioni " strumento sulla barra degli strumenti per disegnare una selezione che corrisponde alla piattaforma di isola.
      Nota: È molto importante escludere il confine della piattaforma dalla selezione. Vedere Figura 2D.
   4. Dopo aver selezionato la piattaforma nella prima immagine, fare clic su " Aggiungi " alla " ROI Manager " finestra; la l'area selezionata vengono visualizzati nella finestra di gestione di ROI come un insieme di valori ( Figura 2D). Premere " Ok " alla " definire la piattaforma " finestra. La macro si procederà alla proiezione successiva.
   5. Clicca sui numeri ( Figura 2D) memorizzato nel " manager di ROI " finestra; la precedente selezione verrà quindi visualizzato automaticamente nella proiezione immagine attuale.
      Nota: poiché l'isola piattaforma rischia di avere la stessa dimensione e posizione quando gli esperimenti vengono eseguiti in una riga (a condizione che la posizione della webcam e isola rimangono invariati), è utile memorizzare il ROI definendo la piattaforma nella " ROI manager. " da in questo modo, l'utente farà risparmiare tempo; nelle prossime proiezioni, è solo necessario cliccare sulla selezione temporaneamente memorizzata in gestione ROI.
   6. Se la posizione dell'isola è leggermente spostato rispetto al precedente esperimento, regolare la posizione della selezione sinistro sull'icona al centro della selezione e trascinando l'area selezionata nella posizione desiderata.
   7. Se la selezione non corrisponde con la piattaforma, fare clic all'esterno della selezione e delineare una nuova selezione della piattaforma utilizzando il " selezione poligono " strumento. Memorizzare la nuova selezione in gestione ROI facendo clic " aggiungere; " una nuova selezione apparirà nel " manager di ROI " finestra che può essere usato continuamente.
   8. Quando viene regolata la selezione, fare clic su " Ok " alla " definire la piattaforma " finestra e ripetere la procedura fino a definire tutte le piattaforme.
      Nota: Si noti che un'immagine binaria della piattaforma corrispondente alla zona ROI delineata in bianco su sfondo nero, denominata " Platform_image_name.tif, " è comparso per ogni immagine elaborata nella stessa sottocartella sperimentale come lo stack e proiezione immagini generate nel passaggio 8.1.3 ( Figura 1).
3. Definire la dimensione minima vola.
   Nota: Questa impostazione definisce la minima dimensione Vola in pixel. Particelle che sono più piccole di dimensione minima specificata saranno esclusi dall'analisi per evitare falsi positivi a causa del rumore.
   1. Aprire una serie di immagini creata dal " creare stack e proiezione " I. sub-macro
   2. Convertire lo stack di immagine a 8 bit facendo clic su immagine > > tipo > > 8-bit.
   3. Andare al menu, premere il tasto immagine > > regolare > > soglia, assicurarsi che il " sfondo scuro " è selezionata la casella e premere " applicare; " una seconda finestra chiamato " soglia " apparirà. Fare clic su " scuro background " e premere " Ok. "
      Nota: verrà creato uno stack di immagine binaria in cui sono definite le mosche nella piattaforma in bianco e nero. Quando questo non è il caso, applicare il " Inverti " funzione facendo clic su modifica > > invertire > > eseguire.
   4. Impostare la scala per rilevare il numero di pixel facendo clic su Analyze > > Imposta scala. Applicare le seguenti impostazioni: distanza in pixel = 1, noto distanza = 1, proporzioni pixel = 1 e l'unità di lunghezza = pixel. Premere " Ok. "
   5. selezionare il " bacchetta " strumento di (traccia) nella barra degli strumenti e fare clic su una Mosca (puntino nero) presente sulla piattaforma. Premere ctrl + m (utenti Windows) o cmd + m (utenti Mac); un nuovo " risultati " finestra indicherà l'area dello spot selezionati in pixel. Farlo consecutivamente per diverse mosche e determinare la dimensione minima vola.
      Nota: Quando si esegue la macro, impostare il " volare dimensione minima " impostazione per la più piccola dimensione di volare osservata meno un margine del 10%. ( Figura 2E).
4. Eseguire la " analisi " Sub-macro III per quantificare mosche fuga dalla piattaforma.
   1. Andare alla barra degli strumenti, selezionare " plugin, " e ha scelto la " Drosophila isola Assay. "
   2. regolare la " volare dimensione minima " impostazione in base al valore definito nel passaggio 8.3.
      Nota: Utilizzare il valore definito nel solo se passo 8.3 l'impostazione standard di " volare dimensione minima " provoca l'esclusione delle mosche che erano presenti sulla piattaforma o se la macro rileva il segnale di fondo come mosche.
   3. Nel " numero di mosche per flaconcino " impostazione, riempire il numero massimo di mosche presenti nelle fiale durante l'esperimento completo. Ad esempio, se un esperimento ha flaconcini contenenti 15 mosche, altri contenenti 20 mosche e altri contenenti 23 mosche, il " numero di mosche per flaconcino " deve essere indicato come 23.
   4. Seleziona il " Analyze " casella di controllo e premere " Ok; " una nuova " scegliere una Directory " verrà visualizzata la finestra. Selezionare la directory principale (con tutte le sottocartelle e i file all'interno) e premere " selezionare. "
      Nota: la macro analizzerà tutte le immagini memorizzate nelle sottocartelle, purché essi contengono il " stack_image_name, " " Projection_image_name, " e " Platform_image_name " file. La macro verrà elaborare immagine dopo immagine. L'output di macro è costituito da una serie di immagini di risultato binario denominato “ result_stack_subfolder_name.tif ” e un file di testo risultato chiamato " result_subfolder_name.txt, " che compaiono in ogni cartella dati. il risultante file di testo (. txt) contiene misurazioni quantitative corrispondente all'immagine dello stack e si compone di 9 colonne. Il contenuto di queste colonne è riassunta nella tabella 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " corrisponde al tempo-serie di immagini di un esperimento, dove le mosche rilevati durante l'esperimento sono rappresentate da puntini neri su sfondo bianco ( Figura 1E).
   5. Ispezionare attentamente la pila dei risultati per garantire che non si sono verificati artefatti e che la macro ha lavorato accuratamente ( Figura 2F).
      Nota: Esempi di manufatti possono essere elementi dell'immagine che sono non vola, ma che vengono rilevati come tali dall'algoritmo di segmentazione di immagine (falsi positivi). Questo può, ad esempio, essere a causa del rilevamento del segnale di fondo a causa di una selezione imprecisa del ROI.

9. Analisi di dati mediante " isola analisi analisi "

1. struttura i dati come indicato in Figura 2A per consentire analisi con il " isola analisi analisi " script. Generare una directory principale con le sottocartelle, dove ogni sottocartella corrisponde a una condizione sperimentale per essere analizzati.
2. Nelle sottocartelle, generare le cartelle contenenti le repliche sperimentali indipendenti ( Figura 2A) e i file results. txt prodotti dalla " dosaggio isola Drosophila " macro.
   Nota: La " isola analisi analisi " macro elaborerà tutte le condizioni sperimentali si trova nella directory principale in una sola volta.
3. Studio avviare R o R. Fare clic sul File > > aprire il File … nella barra degli strumenti e selezionare la " isola analisi analisi " script.
   1. Installate il ggplot2 e matrixStats pacchetti quando si esegue il " isola analisi analisi " script per la prima volta. Digitare quanto segue nella finestra della console:
      > install.packages("ggplot2"), immettere
      > install.packages("matrixStats"), immettere.
4. Specificare il percorso dell'output dati e analisi file nello script. Inserire le seguenti righe di script:
   1. riga 16: inserire il percorso della directory principale che contiene gli esperimenti per essere analizzate e comparate (in Figura 2A, questo è il percorso verso la " isola dosaggio " cartella).
   2. Riga 19: inserire il percorso della cartella dove sono archiviati i file di output di analisi.
      Nota: La directory indicata nella riga 16 può contenere solo le cartelle da analizzare. Lo script inoltre non funzionerà correttamente se i percorsi inseriti nella riga 16 e fila 19 sono lo stesso.
5. Eseguire lo script facendo clic sul codice > > eseguire regione > > Esegui tutto dalla barra.
   Nota: Si noti che tre file con estensione CSV risultanti e un file. txt risultante ( Figura 1E) appaiono nella directory definita nella riga 19. Questi sono: (I) la " data_all_conditions.csv " file contiene i dati trasformati corrispondenti per ogni condizione sperimentale e repliche sperimentali, organizzati come descritto nella tabella 2. (II) i " Statistiche summary.csv " file riassume la media, la deviazione standard (SD) e l'errore standard della media (SEM) delle percentuali delle mosche sulla piattaforma per ogni condizione sperimentale. (III) i " AUC.csv " file contiene l'area sotto la curva per ogni replica sperimentale. (IV) dipende il numero delle condizioni presenti nella cartella principale, lo script verrà Esporta un " Welch_t-test_results.txt " file (2 condizioni) o un " AUC_anova_results.txt " file (più di 2 condizioni), dove i risultati del t-test o ANOVA confrontando l'area sotto la curva tra condizioni sperimentali è indicata. Si noti che, quattro diversi tipi di file di immagine TIFF ( Figura 1E) nel percorso definito nella riga 19. Questi sono chiamati: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (dove Name_Of_Data_Folder rappresenta il nome della cartella dato dall'utente), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " e " AUC_anova.tiff. " informazioni dettagliate informazioni sul contenuto di questi grafici possono essere trovati nei risultati della rappresentante di questo manoscritto e nella Figura 3.

Risultati

Nel protocollo descritto, Drosophila isola analisi dati sono acquisiti e trattati in tre passaggi. In primo luogo, la risposta di fuga del volo di Drosophila generata sulla piattaforma di isola è registrata con una webcam e memorizzata come immagini singole BMP (sezioni 1-7 del protocollo). In secondo luogo, la macro"Drosophila isola Assay" (passaggio 8) elabora i fotogrammi, generando un file di testo "result" (tabella 1), in cui si riassume il numero di oggetti rilevati in ogni fotogramma e una serie di immagini "Result_stack.tiff", che Mostra oggetti rilevati all'interno dell'area della piattaforma in ogni fotogramma. In terzo luogo, lo script di "Isola test Analysis" (protocollo sezione 9) elabora i dati macro memorizzati nei file "results. txt" dei singoli esperimenti. Diversi passaggi sono incorporate nello script per filtrare e combinare i dati per l'analisi statistica. Il primo fotogramma in cui vengono generate le mosche sulla piattaforma viene rilevato e considerato come punto di tempo 1. Fotogrammi precedenti vengono eliminati dal dataset. 100 fotogrammi successivi tempo punto 1 (corrispondente a 10 s) vengono selezionati per l'analisi. Esperimenti in cui il numero iniziale di mosche rilevato sulla piattaforma è più piccolo di 5 vengono automaticamente esclusi dall'analisi, eliminando risultati inaffidabili dagli esperimenti sottodimensionati. Sono esclusi anche gli esperimenti in cui il numero iniziale di mosche rilevato sulla piattaforma supera l'impostazione "Numero di mosche per flaconcino" più una tolleranza di 3. Questo elimina il DataSet in cui rumore particelle sono stati erroneamente rilevate come mosche. Lo script quindi calcola la percentuale di mosche rilevato per ciascun punto di tempo rispetto al più alto numero di mosche rilevato della serie. Errori nei DataSet causato dalle mosche camminare dentro e fuori il ROI (rilevato come una diminuzione seguita da un aumento della percentuale delle mosche sulla piattaforma nel corso del tempo) vengono corretti automaticamente da nei loro confronti come costantemente presenti sulla piattaforma nelle fasi precedenti . Tutti i DataSet replicati per una specifica condizione sperimentale che erano presenti nella directory principale sono combinati ed esportati nel file "data_all_conditions.csv". Le colonne rappresentano le variabili descritte nella tabella 2. Lo script esporterà anche un grafico per ogni condizione sperimentale, denominato secondo la cartella che contiene i dati. Questo grafico mostra la percentuale di mosche restanti sulla piattaforma nel corso del tempo (risposta di fuga di volo) per la sperimentale replica presenti nella rispettiva cartella (Figura 3A-B). La media, SD e SEM per ogni condizione sperimentale sono calcolati e riassunti nel file "Statistiche summary.csv". Un grafico a linee chiamato "Escape_response_all_conditions.tiff" Mostra la risposta di fuga media di volo per fino a 12 sperimentale condizioni presenti nella cartella principale di (Figura 3). Infine, l'area sotto la curva per tutte le condizioni sperimentali presenti nella cartella principale è calcolato e riassunti nel file "AUC.csv". A seconda del numero delle condizioni presenti nella cartella principale, lo script o eseguirà un spaiati Welch t-test a due code (2 condizioni) o un'ANOVA con correzione di Tukey per le prove multiple (più di 2 condizioni) determinare se la sperimentale le condizioni differiscono da significativamente da altro. Questi risultati sono riassunti in "Welch_t-test_results.txt" o "AUC_anova_results.txt." Quando si esegue l'ANOVA, lo script esporterà anche un file di "AUC_anova.tiff" che consente di visualizzare la differenza tra l'AUC media e gli intervalli di confidenza del 95% delle condizioni sperimentali che vengono confrontati. I valori dell'assoluto area sotto la curva dei replicati sperimentale per tutte le condizioni sperimentali vengono visualizzati come punti dati individuali con mediane in "AUC.tiff" (Figura 3D).

Atassia Telangiectasia (AT) è un disordine di movimento recessivo autosomal caratterizzato da precoce insorgenza di atassia cerebellare dovuto le mutazioni nel gene Atassia Telangiectasia mutato (ATM)¹⁴. Mutanti dell'ortologo di Drosophila di ATM, tefu, visualizzare i difetti in mobilità e longevità¹⁵. Per valutare la macro"Drosophila isola Assay", un modello di Drosophila di AT è stato testato nell'analisi della isola, e l'output dei dati della macro è stato confrontato con conteggi manuale dei dati. I risultati mostrano che onnipresente tefu atterramento (w^-; Actin-Gal4/GD11950) riduce significativamente la capacità di queste mosche di lasciare la piattaforma rispetto ai controlli precedenti genetici (w^-; Actin-Gal4/+) (Figura 4). Dopo 1 s, il 50% delle mosche controllo era fuggito la piattaforma, in contrasto con il < 1% di tefu- RNAi vola. Cosa importante, i dati ottenuti con la macro fedelmente riprodotti i dati ottenuti da manuale contando, indicando che la macro è uno strumento affidabile che può essere utilizzato per la quantificazione dei dati di analisi di isola e la valutazione dei difetti di movimento ( Figura 4 A-B).

Figura 1: diagramma di flusso che illustra i requisiti, procedura sperimentale e l'analisi del dosaggio isola. Attrezzature di analisi (A) isola. (B) messa a punto sperimentale per il dosaggio di isola. (C) Isola di dosaggio. (D) l'elaborazione dei dati di analisi di isola con la macro"Drosophila isola Assay". La macro"Drosophila isola Assay" è composto da 3 sub-macro: 1) fare stack e proiezione, 2) definire piattaforma e 3) analisi. (E) elaborazione e valutazione statistica dei dati utilizzando lo script di "Isola test Analysis". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: esempi di diverse regolazioni necessarie durante il protocollo. (A) la necessaria struttura di directory nella quale isola esperimenti di analisi devono essere conservati per analisi ed elaborazione dati. (B) quando si regolano le impostazioni video, mosche devono apparire nero su sfondo bianco. (C) file di output Image framecome salvato tramite il software di registrazione di immagini descritto in questo manoscritto. Muta (D), il giallo indica la selezione della piattaforma. La selezione della piattaforma memorizzati nel "ROI Manager" è evidenziata in blu. (E) mosche sono rappresentati come punti bianchi durante la regolazione di "impostazione dimensione minima di volare". La finestra dei risultati indica l'area delle mosche in pixel. (F) esempio di un fotogramma singolo immagine registrata (a sinistra) e il corrispondente nello stack dell'immagine risultante, ottenuti con la macro"Drosophila isola Assay" (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: risultato immagini ottenute dopo l'elaborazione di dati con "Isola analisi analisi" script. (A) linea grafico che mostra la risposta di fuga di volo per ogni controllo sperimentale replicare. (B) linea del grafico che mostra la risposta di fuga di volo per ogni replica sperimentale di tefu RNAi. Risposta di fuga (C) media di volo per condizioni sperimentali indicate; le barre di errore rappresentano le trame di Dot SEM. (D) che rappresenta l'area sotto la distribuzione della curva per il controllo e condizioni mutante. Repliche sperimentali per entrambe tefu RNAi e controllo le condizioni vengono visualizzati come punti dati individuali (in nero) con mediane (linea rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Onnipresente tefu atterramento mosche mostrano una significativamente diminuita capacità di lasciare la piattaforma. i dati rappresentano la percentuale di mosche sulla piattaforma nel corso del tempo (s) per il controllo (w^-; Actin-Gal4/+) e tefu RNAi (w^-; Actin-Gal4/GD11950) Vola. (numero delle ripetizioni = 5; le barre di errore rappresentano la SEM). (A) dati grezzi ottenuti con la macro"Drosophila isola Assay". (B) Dot trame che rappresenta l'area sotto la distribuzione della curva per controllo e tefu RNAi condizioni ottenute con la macro"Drosophila isola Assay" (Welch spaiati test t, * * p < 0,01). (C) dati grezzi ottenuti manualmente contando il numero di mosche presenti sull'isola al secondo. (D) Dot trame che rappresenta l'area sotto la distribuzione della curva per il controllo e Tefu RNAi condizioni ottenute dal conteggio manuale (Welch spaiati test t, * * p < 0,01). Le barre di errore rappresentano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome della colonna	Descrizione
Fetta	Nome del frame.
Count	Il numero di oggetti rilevati nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI).
Superficie totale	Area totale di oggetti rilevati nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI) in pixel.
Dimensione media	Area totale di oggetti rilevati nel telaio diviso per il numero di oggetti entro i limiti della piattaforma (ROI).
% Area	La percentuale di area occupata dagli oggetti rispetto all'area totale della piattaforma (ROI).
Perim.	Perimetro totale degli oggetti rilevati nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI) in pixel.
Volare dimensioni min.	Il minimo volare impostazione formato definito dall'utente nell'interfaccia grafica della macro"Drosophila isola Assay" (in pixel).
Zona ROI	L'area della piattaforma (ROI) definita dall'utente durante l'esecuzione della Sub-macro definire piattaforma (in pixel).
Numero di mosche	Il numero di mosche utilizzato per ogni esperimento definito dall'utente nell'interfaccia grafica della macro"Drosophila isola Assay".

Tabella 1: Parametri misurati dalla macro"Drosophila isola Assay". i parametri descritti in questa tabella verranno visualizzata nel file "results. txt" al momento di eseguire la macro"Drosophila isola Assay".

Nome della colonna	Descrizione
Fetta	Numero di frame.
Count	Il numero di mosche rilevato nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI).
X.Area	Superficie totale delle mosche rilevato nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI) in pixel.
Volare dimensioni min.	Il minimo volare impostazione di voce di formato definito dall'utente nell'interfaccia grafica della macro"Drosophila isola Assay" (in pixel).
Zona ROI	L'area della piattaforma (ROI, in pixel) definita dall'utente quando si esegue la Sub-macro "definire la piattaforma".
Numero di mosche	Il numero di mosche utilizzato per ogni esperimento definito dall'utente nell'interfaccia grafica della macro"Drosophila isola Assay".
Ambiguous	% Vola presenti sulla piattaforma nel rispettivo fetta/frame rispetto al più alto numero di mosche rilevato sulla piattaforma durante l'esperimento.
Timepoint	Punto di tempo 1 rappresenta il primo fotogramma devono essere analizzate e corrisponde al telaio dove le mosche prima appaiono sulla piattaforma. Ci sono un totale di 100 fotogrammi al replicare analizzati (corrispondente a 10 s, quando si utilizza le impostazioni descritte.
Esperimento	Numero di ripetizioni per condizione.
Condizione	Indica il nome della condizione sperimentale (secondo il nome definito dall'utente della cartella contenente i dati).

Tabella 2: Descrizione delle variabili ottenute dopo l'elaborazione i dati con "Isola analisi analisi" script. I parametri descritti in questa tabella vengono visualizzati nel file "data_all_conditions.csv" al trattamento dei dati con lo script di "Isola test Analysis".

Discussione

Questo protocollo descrive la macro"Drosophila isola Assay" che valuta quantitativamente il comportamento motorio Drosophila durante il dosaggio di isola. La macro conta con precisione le mosche sulla piattaforma nel corso del tempo, rendendo il dosaggio di isola altamente sensibile e adatto per la valutazione quantitativa di alto-rendimento dei difetti dell'apparato locomotore. La metodologia consente il confronto di qualsiasi condizione, con mosche cresciuti sotto differenti condizioni ambientali e/o genetiche, compreso esposizione al farmaco. Questa indicazione è dunque particolarmente utile come strumento di scoperta durante l'esecuzione di grandi schermi genetici o farmaceutici, quando studiare modelli di Drosophila dei disturbi del movimento e altre malattie neurologiche, o esaminando la locomozione o volo comportamento.

Il protocollo di dosaggio isola presentato in questo manoscritto fornisce vantaggi rispetto ai metodi esistenti/alternativa. Ad esempio, il video-monitoraggio locomozione è richiede molto più tempo e meno adatto per testare campioni di grandi dimensioni. Il dosaggio di isola è uno strumento di screening ad alta resa e, in questo senso, è paragonabile al dosaggio rapido interattiva geotassi negativa (anello)¹⁶. La differenza tra i due è che i saggi di isola consente il rilevamento di una più vasta gamma di problemi dell'apparato locomotore; l'incapacità di mosche di lasciare la piattaforma può essere causato da difetti in volo, salto, o camminare comportamento causato da ala (muscolo/neuronali) e/o gamba (muscolo/neuronali) difetti. D'altra parte, l'analisi dell'anello valuta difetti nel comportamento di arrampicata/a piedi causate da difetti della gamba (muscolo/neuronali). Nel caso in cui gli utenti sono interessati a più letture del comportamento, il dosaggio di isola è anche perfettamente combinabile con altri dosaggi, ad esempio, il saggio di anello. Inoltre, laser necessario per optogenetica possono essere facilmente installati nella finestra di analisi isola, e l'installazione è così semplice che può essere facilmente spostato in una camera dove la temperatura e la luce può essere controllate.

Per garantire il successo e la riproducibilità del dosaggio isola descritto qui, una serie di raccomandazioni devono essere seguite. Aliquotare e trasferimento le mosche alla prova sperimentale fiale presso almeno un giorno prima dell'esperimento per evitare gli effetti dell'anestesia di CO₂ o freddo. Non sovraffollamento le fiale sperimentale (uso 10-15 mosche per flaconcino; si consiglia di inserire sempre lo stesso numero di mosche per flaconcino). Tenere le mosche sul cibo fresco in ogni momento. Se non ancora familiarità con lo svolgimento di test, pratica gettando vola sulla piattaforma per massimizzare il rendimento. Anche la pratica rapidamente ritraendo la mano subito dopo, poiché interferisce con l'analisi dei dati (analisi dell'immagine e Vola conteggio inizio solo dopo che la mano è fuori dal quadro). Mantenere le condizioni ambientali e sperimentali identiche in esperimenti che devono essere confrontati (ad es., controlli contro mutanti o un genotipo testato alle età differenti). Sempre eseguire gli esperimenti allo stesso tempo del giorno e mantenere i flaconcini in condizioni di umidità e temperatura controllata. Per potere statistico, test tecnici almeno tre repliche per replica biologico.

Per garantire il buon funzionamento della macro descritto qui, impostazioni webcam e l'immagine devono essere regolate per ottenere il massimo contrasto: mosche che appaiono come oggetti neri su una piattaforma di bianco. Quando il numero di mosche non è conteggiato correttamente dalla macro, regolare le impostazioni di contrasto, controllare se il ROI è selezionato correttamente e assicurarsi che la dimensione delle mosche sulla piattaforma è superiore al valore minimo specificato volare impostazione dimensione (Vedi punto 8.3 del presente protocollo). Le impostazioni devono solo essere definito una sola volta. Sono applicabili a tutti gli esperimenti, come la distanza tra le webcam e la piattaforma non è cambiata. I Circularity_min e le impostazioni max definiscono la circolarità delle particelle (particelle = contati mosche) che si terrà in considerazione per l'analisi (mosche = oggetti contati). 1 rappresenta un cerchio perfetto e 0 rappresenta una linea¹⁷. Dal momento che le mosche sempre presentano un certo grado di circolarità (una Mosca non può apparire come una linea retta), il "Circularity_max" è impostata a 1 e l'impostazione "Circularity_min" è impostata a 0.4. È improbabile che l'utente deve modificare queste impostazioni.

La macro fa occasionalmente conteggio errori quando una Mosca si trova vicino al bordo della piattaforma. Ciò può verificarsi se le mosche non possono volare ma a piedi dentro e fuori il ROI definito dall'utente. Nella maggior parte dei casi, riselezionare il ROI (inserendolo per quanto possibile alla piattaforma) puoi risolvere facilmente questo problema. Tuttavia, lo script di "Isola analisi analisi" è in grado di rilevare e conteggi dati corretti improprio causato da mosche camminare dentro e fuori il ROI relativamente bene. Anche se la risoluzione della webcam presentato qui è abbastanza alta per discriminare mosche nelle immediate vicinanze abbastanza bene, abbiamo implementato algoritmi aggiuntivi nella procedura di elaborazione di immagine macro"Drosophila isola Assay", come la spartiacque ed erodere la funzione¹⁷. Questi facilitano la corretta delineazione di mosche che sono in stretta vicinanza sulla piattaforma. Inoltre, la macro è in grado di distinguere tra mosche che saltò dalla piattaforma o volarono lontano da esso. Tuttavia, generalmente si è osservato che sani giovane ceppi volare volano via immediatamente quando è sceso sulla piattaforma, mentre più grandi mosche e mosche con deficit motorio restano più a lunghi sulla piattaforma e verranno alla fine saltare o cadere dalla piattaforma. Nonostante queste limitazioni, il dosaggio e analisi forniscono una misura molto accurata del comportamento motorio.

Per garantire la performance di successo dello script "Isola test Analysis", l'utente deve assicurarsi di immettere i percorsi corretti per i file di input e outpui delle righe di script indicato nel protocollo e di fornire i dati nel formato di cartella corretta (come indicato nella Figura 2). Se l'utente rileva che i criteri utilizzati per filtrare i dati sperimentali inaffidabili troppo stringenti (riga 68: il primo valore nella colonna "Count" è minore o uguale a 5; row 71: il primo valore nella colonna "Count" è superiore al numero totale di mosche generata sulla platfo RM + 3), spegnere queste impostazioni filtro aggiungendo un # davanti il testo nelle righe 68 e 71 nello script "Isola test Analysis". In questo caso, tutti i set di dati verrà essere inclusi nell'analisi. In alternativa, è possibile modificare le impostazioni di filtro modificando i valori nelle righe 68 e 71 secondo i bisogni di utente. Possibili artefatti nei valori totali nella "results. txt" generato dalla macro"Drosophila isola Assay" possono anche essere regolati manualmente, e può eseguire nuovamente lo script sui dati impostati. Quando l'utente è interessato a l'elaborazione di più di 10 fps o più di 10 s di dati, il numero di fotogrammi elaborati dallo script "Isola analisi analisi" dovrebbeessere regolata. L'analisi statistica può essere sostituito anche da alternative definite dall'utente.

Una cartella denominata "Esempi isola Assay," contenente esempi con tempo-serie di immagini ottenute mediante il saggio dell'isola, può essere trovata presso il seguente sito Web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Scarica il folder "Esempi isola Assay" e seguire i passaggi descritti nel presente protocollo per diventare rapidamente familiarizzato con la struttura di archiviazione di file, l'elaborazione delle immagini con la macro "Dosaggio di Drosophila Island" e il "isola analisi analisi" script.

Il dosaggio di isola, in combinazione con la macro sviluppata e script di analisi, può essere utilizzato per valutare e quantificare il comportamento del movimento aberrante di un modello di Drosophila dell'Atassia-Telangiectasia. Poiché il test può essere applicato in modo efficiente a varie età, è adatta ad analizzare la natura potenzialmente progressiva dei fenotipi.

In sintesi, il dosaggio di isola, in combinazione con la macro"Drosophila isola Assay" e lo script di "Isola test Analysis", è un dosaggio conveniente, affidabile e altamente efficiente per oggettivamente analizzare e quantificare i difetti dell'apparato locomotore di Drosofila modelli di disordini di movimento in un modo ad alta velocità.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.
Fiji	-	-	Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
R studio	-	-	Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
R	-	-	Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com