Fabbricazione di nanocristalli micellare sferica e a forma di verme combinando Electrospray, auto-assemblaggio e controllo di struttura a base di solvente

Riepilogo

Il presente lavoro descrive un metodo per fabbricare nanocristalli micellare, una classe emergente di principale di nanobiomaterials. Questo metodo combina electrospray di top-down, bottom-up auto-assemblaggio e controllo di struttura a base di solvente. Il metodo di fabbricazione è in gran parte continuo, in grado di produrre prodotti di alta qualità e possiede un mezzo poco costoso della struttura di controllo.

Abstract

Micellare nanocristalli (micelle con nanocristalli incapsulato) sono diventati una classe emergente di principale di nanobiomaterials. Descriviamo un metodo di fabbricare nanocristalli micellare basato su combinando electrospray di top-down, bottom-up auto-assemblaggio e controllo di struttura a base di solvente. Questo metodo coinvolge in primo luogo utilizzando electrospray per generare goccioline di liquide ultrafine uniforme, ciascuna delle quali funziona come un micro-reattore in cui auto-assemblaggio reazione si verifica nanocristalli micellare che forma, con le strutture (forma micelle e nanocristalli incapsulamento) controllato dal solvente usato. Questo metodo è in gran parte continuo e produce prodotti micellare nanocristallo di alta qualità con un approccio di controllo struttura poco costoso. Utilizzando un idrosolubili organico solvente tetraidrofurano (THF), a forma di verme micellare nanocristalli possono essere prodotte a causa della fusione di solvente-indotto/facilitato micella. Rispetto ai comuni nanocristalli micellare sferica, a forma di verme micellare nanocristalli è in grado di offrire l'assorbimento cellulare aspecifiche ridotta a icona, migliorando così il targeting biologico. Incapsulando co-nanocristalli multiple in ogni micella, effetti sinergici o multifunzionali possono avvenire. Attuali limiti di questo metodo di fabbricazione, che farà parte del lavoro futuro, principalmente la imperfetta incapsulamento nel prodotto nanocristallo micellare e la natura in modo incompleto continua del processo.

Introduzione

Nanocristalli come punti quantici di semiconduttore (QD) e nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIONs) hanno dimostrato il grande potenziale per biologico rilevamento, imaging, manipolazione e terapia^{1,2, 3,4,5,6}. Incapsulamento di nanocristalli di uno o più in una micella è stato un metodo ampiamente usato di nanocristalli di interfaccia con ambienti biologici^3,6. I nanocristalli micellare così formato (micelle con nanocristalli incapsulato) sono diventati una classe emergente di nanobiomaterials^7,8,9,10. Metodi comunemente usati per fabbricare micelle che incapsulano vari materiali (ad es., nanocristalli, farmaci piccola molecola e tinture) includono film idratazione, dialisi e parecchi altri^7,11.

Il presente lavoro descrive un metodo di fabbricare nanocristalli micellare basato su combinando electrospray di top-down, bottom-up auto-assemblaggio e controllo strutturale solvente-mediato. Rispetto ad altri metodi di fabbricazione dei nanocristalli micellare, il nostro metodo offre diverse caratteristiche benefiche: (1) è un processo di produzione in gran parte continua. Questa caratteristica è dovuta principalmente al fatto che electrospray viene utilizzato nel nostro metodo per formare goccioline di emulsione. Al contrario, alcuni altri metodi utilizzano Vortex o sonicazione per formare goccioline di emulsione, rendendo questi processi batch di metodi in natura¹². (2) si traduce in prodotti con acqua alta disperdibilità, eccellente stabilità colloidale e intatte funzioni fisiche dei nanocristalli incapsulato. Questo processo può spesso dare prodotti con una qualità superiore rispetto ad altri metodi di incapsulamento di micella, in larga misura perché electrospray può formare goccioline di emulsione ultrafini e uniforme. (3) le strutture dei prodotti, tra cui forma micelle e numero dei nanocristalli incapsulato, possono essere controllate da parte del solvente, che è molto più economico rispetto ad altri modi di controllo, ad esempio cambiando i polimeri anfifilici utilizzati e possono produrre non solo la forma comunemente disponibili micella sferica ma forma di vite senza fine-come micella via micella fusione¹³. Così formato a forma di verme micellare nanocristalli sono trovati da offrire notevolmente ridotto l'assorbimento cellulare aspecifica rispetto le controparti sferica¹³. D'altra parte, vale la pena di sottolineare che questo metodo richiede l'installazione di un dispositivo di electrospray, che è un po' più tecnicamente impegnativo (anche se lontano proibitivi) che il bisogno di strumentazione in altri metodi.

Il metodo di fabbricazione comporta la prima generazione ultrafine delle gocce liquide (emulsione olio in acqua spesso) con dimensioni uniformi di electrospray, seguito da evaporazione del solvente organico conseguente auto-assemblaggio per formare micellare nanocristalli (Figura 1 ). Il programma di installazione di electrospray ha una configurazione coassiale usando gli aghi concentrici: la fase di olio, che contiene anfifili copolimeri a blocchi e idrofobo nanocristalli disciolti in solvente organico, viene recapitata all'interno dell'ago (capillare di acciaio 27 G ) con una pompa a siringa; la fase dell'acqua, che contiene un tensioattivo disciolto in acqua, viene recapitata all'esterno dell'ago (connettore di tre vie in acciaio inox 20 G) con una seconda pompa a siringa. L'ugello coassiale è applicata una tensione alta. Ultrafini goccioline con uniforme dimensioni vengono generate a causa di tensione superficiale superando forza elettrodinamica e stress inerziale nel liquido. Ogni gocciolina funziona essenzialmente come un 'micro-reattore', in cui, dopo la rimozione del solvente per evaporazione, l'auto-assemblaggio 'reazione' si verifica spontaneamente a causa di interazioni idrofobiche. Utilizzando solventi organici differenti conduce a diverse strutture di nanocristalli micellare: un cloroformio solvente organico immiscibile in acqua porta alla forma sferica micella, mentre un solvente organico idrosolubili THF con un tempo di reazione conduce a vite senza fine-come forma micelle insieme nanocristallo avanzato incapsulamento.

Protocollo

Attenzione: Grazie all'uso di solventi organici, tutte le operazioni dovrebbero essere eseguite in una cappa chimica. Grazie all'uso di alta tensione elettrica, evitare il contatto con l'apparecchio quando l'alimentatore è acceso. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate come l'utilizzo di dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice, pantaloni lunghi e scarpe chiuse). Consultare tutte le schede di sicurezza pertinenti (MSDS).

1. installazione di materiali

1. Per preparare la soluzione QD, sciogliere 10 mg qd idrofobo (lunghezza d'onda di picco di emissione fluorescente = 605 nm, usato come il modello nanocristalli qui) in 20 mL di solvente organico (cloroformio per la produzione di forma sferica micella o THF per la produzione di forma di vite senza fine-come micella) e vortice per 20 s.
2. Per preparare la soluzione di PS-PEG, sciogliere 100 mg PS-PEG (copolimero a blocchi anfifiliche, con 9,5 kDA PS segmento e 18.0 kDA PEG segmento) in 10 mL di solvente organico (cloroformio per la produzione di forma sferica micella o THF per la produzione di forma micelle di vite senza fine-come). Mix la soluzione nel Vortex per 1 min (cloroformio) o vasca Sonicare per 2 min (THF).
3. Mescolare 1 mL di soluzione QD e 1 mL di soluzione di PS-PEG e vortexare per 1 min. aggiungere il composto alla siringa A. La siringa è in PTFE.
4. Per preparare la soluzione di PVA, sciogliere 400 mg PVA (13-23 kDa, 87-89% idrolizzato) in 10 mL di acqua in un bagno di acqua riscaldata a 60 – 80 ° C per 4 – 5 h. Consenti la soluzione PVA raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
5. Aggiungere 5 mL di soluzione di PVA a siringa B. La siringa è in PTFE.

2. installazione di apparecchiature

1. Inserire il capillare interno nell'assembly capillare esterno e riavvitare delicatamente. Non serrare eccessivamente. La figura 2 Mostra l'impostazione generale del sistema coassiale electrospray. L'interno dell'ago capillare è un capillare di acciaio 27 G (diametro esterno 500 µm; diametro interno 300 µm), e l'esterno dell'ago è un connettore a tre vie in acciaio inox 20G (diametro esterno 1.000 µm; diametro interno 500 µm). La tubazione di PTEE utilizzata ha un diametro interno di 1.8 mm.
2. Caricare la siringa A su una pompa a siringa come mostrato nella Figura 2. Collegare siringa per il capillare in acciaio inox interno dell'ugello coassiale electrospray utilizzando tubi di PTFE.
3. Caricare la siringa B b pompa a siringa come mostrato nella Figura 2. Connettersi siringa B il capillare in acciaio inossidabile esterno dell'ugello coassiale electrospray utilizzando tubi di PTFE.
4. L'ugello coassiale electrospray suggerimento circa 0,8 cm sopra un anello di acciaio con messa a terra (diametro 1,5 cm).
5. Posto una raccolta di vetro piatto circa 10 cm sotto l'ugello coassiale.
6. Con l'alimentazione disattivata, è possibile collegare il filo di massa (filo nero nella Figura 2) per l'anello in acciaio con messa a terra.
7. Con l'alimentazione disattivata, è necessario collegare il terminale positivo (filo rosso nella Figura 2) dell'alimentazione elettrica per l'interno dell'ago dell'ugello coassiale utilizzando un metallo a coccodrillo.

3. produzione di nanocristalli micellare

1. Impostare la velocità della pompa a siringa A 0,6 mL/h.
2. Impostare la velocità della pompa siringa B a 1,5 mL/h.
3. Avviare entrambe le pompe siringa e attendere per le loro rispettive portate stabilizzare. Gocce che formano all'ugello a una velocità costante indicano un tasso di flusso stabile. Ciò si presenta solitamente entro 60 s dopo l'avvio di pompe a siringa.
   Nota: non ci dovrebbe essere nessun bolle nel tubo e dovrebbero formare goccioline all'ugello coassiale electrospray.
4. Accendere l'alimentazione elettrica per applicare una positiva ad alta tensione per l'ugello coassiale electrospray. Regolare la tensione applicata all'interno della gamma di 5 – 9 kV, fino a quando un concavo getto a cono (cioè, un getto convergente, comunemente noto come un 'cono di Taylor') è osservato sulla punta dell'ugello coassiale (come indicato nella rientranza della Figura 3a).
   Attenzione: Accertarsi di non toccare l'ugello elettrospray quando viene applicato ad alta tensione. Attenersi alle precauzioni di sicurezza appropriate.
   Nota: Insufficiente tensione applicata si tradurrà in goccioline che formano sulla punta dell'ugello (come mostrato nella rientranza della Figura 3b), mentre troppo alto di tensione applicata causerà un arco elettrico tra l'ugello e l'anello in acciaio con messa a terra.
5. Dopo aver ottenuto un cono di Taylor stabile (Figura 3a), aggiungere 10 mL acqua deionizzata per un piatto di raccolta pulita e sostituire il piatto di raccolta del vetro nel setup. Il nuovo piatto raccoglierà il prodotto nanocristallo micellare.
6. Eseguire il processo di produzione del nanocristallo micellare per un certo periodo di tempo (per circa 40 min per la produzione di forma sferica micella o circa 90 min per produrre forma micelle di vite senza fine-come). Quindi rimuovere il piatto di raccolta da sotto l'ugello elettrospray.
7. Fermare la pompa a siringa A e B.
8. Spegnere l'alimentazione ad alta tensione.
9. Consentire il solvente organico di evaporare (in una cappa aspirante) nella vaschetta scoperti durante la notte.
   Nota: A giudicare dai risultati della caratterizzazione dei prodotti nanocristallo micellare, evaporazione durante la notte è sufficiente per la rimozione del solvente organico per ottenere prodotti con buona qualità.
10. Infine, è possibile trasferire il prodotto micellare nanocristallo di una provetta da centrifuga da 15 mL per caratterizzazione (ad es., spettroscopia di fluorescenza, dispersione della luce dinamica, microscopia elettronica a trasmissione e analisi termica), applicazione o deposito. Conservare il prodotto finale nanocristallo micellare in frigorifero a 4 ° C.
    Nota: Il prodotto può rimanere stabile in questa condizione di deposito per almeno un mese.

Risultati

La figura 1 Mostra uno schema che riassume il controllo delle strutture (forma e incapsulamento) dei nanocristalli micellare di solvente organico utilizzato nel processo di produzione. Brevemente, diclorometano conduce a micelle sferiche con alcun incapsulamento dei nanocristalli; cloroformio conduce a micelle sferiche con un numero basso di incapsulamento di nanocristalli; THF conduce a micelle sferiche con un numero alto incapsulamento di nanocristalli in u...

Discussione

Il metodo di fabbricazione dei nanocristalli micellare descritto nel presente lavoro combina verticistica electrospray, bottom-up auto-assemblaggio, e solvente struttura del controllo. Un metodo di controllo di qualità efficace e conveniente è quello di utilizzare il cono di Taylor formato all'estremità dell'ugello coassiale. Questo è perché un cono di Taylor adeguatamente formato indica equilibrio (o bilanciamento) tra forza elettrica e la tensione superficiale, che a sua volta indica successo formazione di micro-r...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydrophobic quantum dots	Ocean Nanotech	QSP	Solid hydrophobic CdSe/ZnS quantum dots. Peak fluorescence emission wavelength is 605 nm.
Poly(styrene)-b-poly(ethylene glycol) (PS-PEG)	Sigma-Aldrich	666476-500MG	Molecular weight of PS segment is 9.5 kDa and that of PEG segment is 18.0 kDa.
Poly(vinyl alcohol) (PVA)	Sigma-Aldrich	363170-500G	Molecular weight 13–23 kDa, 87–89% hydrolyzed.
Tetrahydrofuran (THF)	Sinopharma Chemical Reagent	80124418
Chloroform	Sinopharma Chemical Reagent	40007960
Syringe pumps	Bao Ding Shen Chen	SPLab01
Tubing	Shanghei Lai Xing		2 mm outer diameter and 1.8 mm inner diameter PTFE tubing.
Syringes	Yi Ming	5.CC	5 mL disposable syringe made of PTFE.
High voltage power supply	Dong Wen	DW Series	Direct current power supply (0–50 kV range).
Electrospray coaxial nozzle	Hunan Chang Sha Na Yi		Stainless steel assembly. Inner capillary needle was a 27 gauge (outer diameter 500 μm; inner diameter 300 μm). Outer capillary was a 20 gauge (outer diameter 1,000 μm; inner diameter 500 μm).
Vortexer	Xi'an HEB Biotechnology Co., Ltd. China	MX-S	MX-S with wide speed range of 0–2,500 rpm, stepless speed regulation, touch and continuous operations.
Steel ring	Yiwu Wan Tu		Rings with a range of diameters (0.8–1.8 cm) can be constructued. For example, a 1.3 cm diameter ring was constructed by curling an approximately 25 cm (length) of 0.5-mm diamter (24 gauge, AWG) steel wire.
Glass collecting dish	Grainger	1u5084	25-mm height and 120-mm diameter glass dish.
15 mL centrifuge tube	Jiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd.	X-407	Centrifuge tube is made of transparent polypropylene (PP).