Murino bere modelli nello sviluppo delle farmacoterapie per l'alcolismo: bere nella scelta scura e due-bottiglia

Riepilogo

Disordine di uso di alcol (AUD) è un problema importante di salute nazionale e lo sviluppo di trattamenti più efficaci è necessaria per compensare le esigenze di questa popolazione di pazienti. A tal fine, il seguente protocollo utilizza due modelli beventi del roditore semplici per valutare l'efficacia preclinica di composti di piombo anti-alcol.

Abstract

Disordine di uso di alcol (AUD) è un grosso problema con più di un stimato 76 milioni persone in tutto il mondo soddisfi i criteri diagnostici. I trattamenti correnti sono limitati a tre farmaci approvati dalla FDA che sono in gran parte inefficaci anche quando combinato con psicosociale di intervento, come è evidente dagli alti ricaduta tasso. Come tale, la ricerca di trattamenti più nuovi rappresenta un obiettivo importante di salute pubblica. A tal fine, il seguente protocollo utilizza due modelli beventi del roditore semplici per valutare l'efficacia preclinica di composti di piombo anti-alcol: due-bottiglia scelta (TBC) e bere al buio (DID). Il primo permette di topi da volontaria bere con moderazione mentre quest'ultimo induce topi per volontario consumano una grande quantità di alcol in un breve periodo che imita binge bere. La natura semplice e ad alta velocità effettiva di entrambi di questi paradigmi consentono per lo screening rapido di agenti farmacologici o per l'identificazione di ceppi di topi che presentano determinato volontario comportamento bevente.

Introduzione

Negli ultimi 25 anni, è stato messo uno sforzo significativo verso lo sviluppo di farmaci per il trattamento di disordine di uso di alcol (AUD)¹. Anche se molti progressi sono stati compiuti, AUD ancora rimane un problema importante di sanità pubblica, che colpisce oltre 18 milioni di americani e costano oltre $ 220 miliardi ogni anno^2,3. Attualmente ci sono solo tre i farmaci approvati dalla FDA, disulfiram, naltrexone e acamprosate, i quali hanno dato i risultati contradditori in studi clinici e successo limitato anche quando combinato con intervento psicosociale nelle impostazioni della clinica ^{4 , 5 , 6 , 7}.

Un motivo principale per fallimenti della terapia corrente AUD è legato alla natura eterogenea di AUD⁸. Mentre i fattori genetici e ambientali contribuiscono allo sviluppo di AUD, ereditabilità rappresenta un stimato 50-60% del rischio di insorgenza di⁹. Come per il trattamento della depressione, è ampiamente accettato che i pazienti affetti da AUD avrà bisogno di una varietà di farmaci che sono su misura per soddisfare le esigenze di ogni paziente¹⁰.

Chiaramente, c'è un urgente bisogno di cure più efficaci che sarebbe facilitata se il processo già arduo e che richiede tempo di scoperta della droga era snella³. A tal fine, il seguente protocollo dimostra l'applicabilità preclinico di due modelli del roditore beventi, ampiamente utilizzato per esaminare la base neurobiologica di AUD¹¹. Più in particolare, il metodo introdotto nel presente documento possa valutare l'efficacia di composti candidato a ridurre alcool consumo negli scenari di "binge drinking" utilizzando la scelta di due-bottiglia (TBC) e bere nei paradigmi scuri (DID) e "moderata" rispettivamente. Entrambi i paradigmi esaminano autosomministrazione dell'etanolo non operante, per cui topi ingeriscono etanolo oralmente e a volontà e quindi illustrano alta volto e costruire validità come modello di alcolismo umano¹¹.

In TBC bere, noto anche come libera scelta, bere, bere, preferenza o bere sociale, due bottiglie di soluzione sono continuamente disponibili dalla gabbia. Un flacone contiene acqua, e l'altro contenente una soluzione diluita di etanolo, per cui può essere variata la concentrazione di etanolo (ad es., 5-30% v/v)^11,12. I topi hanno costante accesso a entrambe le bottiglie e pertanto, possono scegliere quanto a bere da ogni flacone.

Questo modello valuta il consumo di etanolo di ogni mouse (g/kg), così come il tasso di preferenza etanolo (volume di etanolo consumato ÷ volume totale liquido consumato). Essa è usata ordinariamente per confrontare i livelli beventi attraverso diversi ceppi di topi, o dopo una manipolazione genetica specifica (ad es., gene KO o atterramento) e risultati nelle concentrazioni di etanolo di sangue (BECs) simile a quello che è trovato in esseri umani quando bere in moderazione^13,14.

Nella procedura DID, 3 h dopo l'inizio del ciclo scuro, la bottiglia gabbia a casa di acqua viene scambiata con una bottiglia di soluzione al 20% (v/v) etanolo per un accesso limitato bere sessione. Le bevute si presentano come un ciclo di 4 giorni consecutivo, durata 2h nei giorni 1-3 e 4 ore il giorno 4. Giorni 1-3 servono come un periodo di assuefazione dell'alcool prima della prova il giorno 4. Di conseguenza, topi attendibilmente consumerà abbastanza etanolo per raggiungere BECs > 100 mg/dL e di conseguenza, esibire gli effetti comportamentali di intossicazione trovato in esseri umani che sono binge bere^13,14,15. Accesso all'acqua è disponibile presso tutte le volte oltre la sessione di bere.

Ci sono diverse varianti di accesso limitato di bere. Ad esempio, nel modello di accesso intermittente, topi ricevano due bottiglie (uno contenente l'acqua e l'altro contenente 20% (v/v) etanolo) solo il lunedì, mercoledì e venerdì con un periodo di recesso h 24 e 48 ore nei giorni feriali e nei fine settimana, rispettivamente¹⁶. Dopo diverse settimane di accesso intermittente, i topi saranno gradualmente e volontariamente escalation bere livelli, raggiungendo alla fine BECS simile a ciò che si osserva nel modello DID. Il DID, tuttavia, sembra essere il modello più comunemente usato per valutare il comportamento bere binge-come. Esistono altri modelli di bere intermittente, ma essi si affidano a limitare l'accesso al cibo o vapore camera indotto aumenti in volontario self-administration, che li rende meno rappresentativi di consumo volontario di alcol umano¹⁶.

Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dalle commissioni di utilizzo del Campus di Scienze di salute University of Southern California e istituzionali Animal Care.

1. montaggio e messa a punto sperimentale

1. Acquisire tutte le seguenti forniture e prodotti chimici prima dell'inizio dello studio: topi, gabbie/metallo gabbia top, biancheria da letto, cibo, acqua, etanolo, pipette, sipper top, shrink wrap, coltello multiuso, fascette, nastro, bruciatore di Bunsen, scala, lampada frontale.
2. Ottenere topi C57BL/6J, sia da una fonte commerciale o una colonia in-House, tenendo presente che i topi possono essere gruppo ospitato fino al momento della prova.
   Nota: Il numero totale dei topi procurato dipende dalla complessità del disegno sperimentale. Piano per ospitare circa 12-15 topi per gruppo e studi pilota non inferiori a 5-7 topi per ogni gruppo. Nei risultati della rappresentativi illustrati di seguito abbiamo utilizzato un semplice set-up di due gruppi per valutare la relazione di causa-effetto utilizzando una singola dose (5 mg/kg) della droga (MOX).
3. Seguire i passaggi qui sotto per assemblare le bottiglie¹⁸.
   1. Riscaldare un taglierino utilizzando un bruciatore di Bunsen.
   2. Con questo coltello, tagliare circa un pollice fuori l'estremità superiore e inferiore di una pipetta sierologica di plastica 18 mL.
      1. Si noti che più piccole pipette di volume (cioè, 10ml) utilizzabile anche per aumentare la precisione della misurazione.
   3. Scaldare la pipetta sotto una pistola di calore.
   4. Inserire il tubo di sipper cuscinetto a sfere nella parte "inferiore" della pipetta (in altre parole, l'apertura più vicina la 18ml dash-linea).
   5. Sigillare il tubo sipper con termoretraibile utilizzando una pistola avvolgere riduzione commercialmente disponibile.
   6. Concludete l'altra apertura con un tappo di silicone.

2. animale assuefazione

1. A partire almeno 1 settimana prima della data di inizio dell'esperimento, trasferire i topi nella stanza dove le procedure sperimentali devono essere effettuate in modo che essi possono acclimatare le condizioni di allevamento (tra cui la temperatura ambiente (21 ± 1 ° C) e 12 h indietro ciclo luce/buio, con luci off alle 12). Assicurarsi di seguire le linee guida istituzionali e notificare i canali appropriati prima di spostare gli animali da una posizione a altra.
   1. Se topi vengono trasferiti da un ciclo luce/buio standard permettono 2 settimane di tempo ulteriori assuefazione.
2. Riempire le bottiglie appena effettuate fino all'orlo con acqua. Assicurarsi che il tappo sia chiuso in modo sicuro e privo di qualsiasi bolle d'aria o perdite dal beccuccio. In caso di perdite di soluzione, ri-fissare il tappo. Rimuovere eventuali bolle d'aria semplicemente toccando sulla bottiglia in modo che l'aria possa uscire il tubo.
3. All'arrivo, singola casa ogni mouse in policarbonato standard/polisolfone gabbie con biancheria da letto e un top di gabbia di rete metallica; rimuovere il coperchio di gabbia come non verrà utilizzato.
   1. Fornire l'accesso a cibo e water bottle(s) ad libitum.
   2. Fissare ogni bottiglia fino alla cima della gabbia avvolgendo una fascetta in plastica intorno a ogni bottiglia per tenerlo in posizione. Tagliare tutta la plastica in eccesso dalla fascetta per garantire che non sporga nella gabbia.
      Nota: Per il bere nella procedura scura (DID), solo una singola bottiglia di acqua è richiesta. Assuefazione al paradigma due bottiglia scelta (TBC), tuttavia, richiede che il set-up gabbia includono due bottiglie d'acqua. Se la tramoggia di griglia del metallo fornito è progettata per contenere solo un singolo flacone di soluzione, piegare delicatamente a pezzi suoi bar per creare spazio per una targhetta supplementare accogliere la seconda bottiglia per TBC.
4. Impostare almeno 3 gabbie di controllo gratuito del mouse. Ciò consentirà il monitoraggio di qualsiasi perdita di liquidi causata da evaporazione o fuoriuscite dalle bottiglie, che è semplicemente un fenomeno naturale che accade come gabbie sono collocate su e fuori del rack di gabbia (Vedi punto 2.6.3, 3.6.1 e 4.6.1 per equazioni).
5. Inizio il giorno 4 di acclimatazione la custodia singola 1 settimana, misurare e registrare i pesi di corpo e cibo quotidiani di ogni mouse, utilizzando una scala, (in grammi) così come l'assunzione di acqua, utilizzando le incisioni a fianco la bottiglia rovesciata per registrare il punto più alto della menisco (in mL).
   1. Mentre è pratica standard scientifico per leggere il punto più basso del menisco concavo, perché le bottiglie restano in posizione invertita durante la misurazione, è necessario registrare il punto più alto del menisco.
6. Valutare i parametri di 2.5 utilizzando le equazioni qui sotto:
   1. Misurare la variazione di peso del corpo (g): peso del giorno corrente (g) - peso del giorno precedente (g).
   2. Misurare l'ingestione di cibo (g): peso di cibo il giorno precedente (g) - peso di cibo il giorno corrente (g).
   3. Misurare l'assunzione di acqua (mL): [volume d'acqua il giorno corrente (mL) - volume d'acqua il giorno precedente (mL)] - Media perdita d'acqua da tutte le gabbie di controllo (mL).
7. Ripetere il passaggio 2.5 consecutivamente, nei giorni 5-7, per consentire la determinazione di una base di riferimento per i tre giorni immediatamente precedenti l'introduzione dell'etanolo. Se una registrazione consecutiva non può essere raccolti, estendere il periodo di acclimatazione per consentire la valutazione delle misurazioni di base.
8. Una volta che l'assunzione di acqua è stabilizzato alla variabilità del ± 10% dalla media degli ultimi 3 giorni, iniziare accesso di etanolo con TBC (accesso illimitato) o DID (accesso limitato).
   Nota: In rari casi, uno o due giorni aggiuntivi possono essere necessari per soggetti raggiungere questa stabilità; non allarmatevi se il tempo supplementare è necessario per i valori da visualizzare ± 10% variabilità dalla media degli ultimi 3 giorni.

3. 24 ore due bottiglia scelta (TBC)

Nota: Un disegno schematico è preparato nella Figura 1.

1. Preparare una soluzione di etanolo di 10% (v/v) ad un volume di 500 mL aggiungendo 52,65 mL di etanolo al grano prova 190 (~ 95% di etanolo) a 447,35 mL di H₂O; Assicurarsi di agitare bene. Dato che l'etanolo evapora rapidamente, è possibile sostituire la soluzione in intervallo di ogni 3-4 giorni.
   Nota: Altre concentrazioni di etanolo possono essere utilizzati anche, ma gli autori raccomandano una concentrazione di 10% per questo modello.
2. Il primo giorno di TBC, (giorno 8 al più presto) 1 di 2 bottiglie d'acqua, in ogni gabbia, di svuotare e riempire fino all'orlo con la soluzione di etanolo preparati al momento. Dato che l'etanolo e acqua sono difficili da distinguere visivamente, chiaramente etichettare le bottiglie con il loro contenuto corrispondente. Basta applicare un pezzo di nastro alla bottiglia di mascheramento e di etichettatura è con un pennarello o scrivendo direttamente sulla bottiglia.
3. Aggiungere altre soluzione per la bottiglia di acqua, se necessario.
4. Mettete le bottiglie indietro sulla gabbia, assicurandosi che tutte le protezioni siano chiusi in modo sicuro e privo di qualsiasi bolle d'aria o perdite dal beccuccio. Se la soluzione è fuoriuscita, ri-fissare il tappo. Rimuovere eventuali bolle d'aria semplicemente toccando sulla bottiglia in modo che l'aria possa uscire la bottiglia.
5. Alternate la posizione delle bottiglie ogni altro giorno come a corretta per la preferenza di posto condizionata relativa influenze nel bere attività (Vedi discussione per saperne di più).
6. Oltre alle misurazioni giornaliere da 2.5 e 2.6, che sono in corso, iniziare a leggere e registrare anche i livelli di assunzione di etanolo. Analizzare il rapporto di assunzione e di preferenza di etanolo al 10% utilizzando le seguenti equazioni:
   1. Misurare il 10% l'assunzione dell'etanolo (mL): [volume di etanolo sul giorno corrente (mL) - volume di etanolo il giorno precedente (mL))]-perdita di etanolo da tutte le gabbie di controllo (mL) media.
   2. Misurare il 10% l'assunzione dell'etanolo (g/kg): [10% etanolo assunzione (mL) x 0,07893 g/mL] / (kg) di peso corporeo.
   3. Misurare la % di preferenza: [assunzione dell'etanolo di 10% (mL) / acqua (mL)] x 100.
7. Non appena l'assunzione dell'etanolo è diventato stabile, è possibile amministrare iniezione di un singolo controllo (salino) intraperitoneale (i.p.) (0,01 mL/g di peso corporeo) per ogni mouse durante la routine quotidiana di misurazione. In questo modo, soggetti abituati all'iniezione stessa.
   1. La stabilità è definita come ± 10% variabilità dalla media degli ultimi 3 giorni (identico a quello sezione 2.8).
      Nota: Può richiedere fino a 1 settimana per i livelli dell'etanolo stabilizzare. Questo è particolarmente vero se topi vengono ri-utilizzati da un esperimento precedente e hanno avuto la precedente esposizione all'etanolo. Il controllo è semplicemente il solvente utilizzato per sciogliere la droga.
8. Una volta che una previsione di etanolo con bassa variabilità viene ristabilita, dividere i topi in dosaggio gruppi utilizzando i valori di assunzione di etanolo, in modo che tutti i gruppi hanno più o meno simili media valori di assunzione di etanolo.
   1. Designare un gruppo come il controllo (continuando a ricevere soluzione salina) e l'altro come lo sperimentale (i.p. iniezione del farmaco studiato a 0,01 mL/g di peso corporeo). Begin quotidiano farmaco dosaggio, sia per una durata acuta o più giorni. Successivamente, il controllo può essere reintrodotto per testare gli effetti di post-droga (opzionali).
      Nota: Perché bere è monitorato attraverso un lungo periodo di 24 h, il tempo di somministrazione di dosaggio non dipendono il ciclo scuro.

4. bere al buio (fatto)

Nota: Un disegno schematico è preparato nella Figura 3.

1. Ogni giorno di accesso programmato etanolo (giorni 1-4) registrare le misurazioni, per volume d'acqua, assunzione di cibo e del peso corporeo ed eseguire il dosaggio del farmaco. Eseguire questa operazione durante un tempo preselezionato durante il ciclo di luce che è scelto in conformità con la farmacocinetica del farmaco in modo che il composto è a / o avvicinando la concentrazione massima del cervello durante il periodo di bere.
   Nota: Ricordare giorni 1-3 sono destinate ad acclimatare semplicemente i topi a bere abbondanti livelli di etanolo in un breve periodo di tempo. Mentre i topi non raggiungono livelli BEC paragonabili all'umano 0,08; in questi giorni di "formazione" garantiscono che il giorno 4, durante la sessione di leggermente più bere, infatti berranno a quel livello.
   1. Dare tutti i topi del controllo (salino) giorni 1-3 e il controllo o droga il giorno 4. Questa procedura DID si verifica nell'arco di 3 settimane per includere un pre-farmaco (settimana 1), droga (settimana 2) e sessione di bere post-droga (settimana 4).
   2. Nota: Si noti che durante la settimana di droga-dosaggio, livelli di assunzione di etanolo giorno 3 vengono utilizzati per assegnare topi o il gruppo di controllo o droga in un modo dove i livelli di assunzione di etanolo di entrambi i gruppi hanno la minor variabilità. Questo è diverso da TBC, che assegna gruppi basati su una media di 3 giorni.
2. Preparare una soluzione di etanolo del 20% (v/v) (20E) ad un volume di 500 mL aggiungendo 105,25 mL di etanolo al grano prova 190 (~ 95% di etanolo) a 394,75 mL di H₂O; Assicurarsi di agitare bene.
3. Riempire le bottiglie di etanolo prima dell'inizio della sessione di bere in modo che appena inizia il DID le bottiglie di acqua può essere sostituite semplicemente con le bottiglie di alcol.
4. Durante l'intera sessione DID (passaggi 4.5-4.8), utilizzare un faro di luce rossa per non disturbare gli animali.
5. All'inizio del DID bere sessione, prevista per cominciare 3 ore nel ciclo scuro, registrare il volume di acqua per ogni mouse. Sostituire ogni bottiglia di acqua con una bottiglia della soluzione 20E, quindi registrare il volume iniziale di etanolo.
6. Leggere e registrare il volume di etanolo finale 2 ore più tardi, alla fine della sessione di bere nei giorni 1-3 e 4 ore più tardi il giorno 4. Analizzare l'assunzione di etanolo 20% utilizzando le seguenti equazioni.
   1. Misurare il 20% l'assunzione dell'etanolo (mL): perdita media etanolo [volume di etanolo, al fine di bere sessione (mL) - volume di etanolo all'inizio della sessione (mL) di bere] - da tutte le gabbie di controllo (mL).
   2. Misurare il 20% l'assunzione dell'etanolo (g/kg): [20% l'assunzione dell'etanolo (mL) x 0,15786 g/mL] / (kg) di peso corporeo.
7. Il giorno 4 solo, immediatamente dopo la registrazione volumi di etanolo e prima di re-introdurre l'accesso all'acqua, raccogliere il sangue per valutare la concentrazione di etanolo del sangue di ogni mouse (opzionale).
   Nota: Qualsiasi metodo di raccolta di sangue non terminale può essere utilizzato, ad esempio di raccolta del sangue del seno retro-orbitale, o la raccolta del sangue della vena safena. Per utili protocolli, vedere riferimenti per pizzi et al. ²¹ e Yardley et al. ²⁰.
   1. Eseguire l'analisi utilizzando vari metodi tra cui LCMS, o macchinari disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali).
8. Sostituire tutte le bottiglie di etanolo con bottiglie d'acqua e volume d'acqua record.

Risultati

Nelle seguenti indagini rappresentative, bere sociale è stata modellata utilizzando il paradigma di due-bottiglia scelta (TBC). Brevemente, topi ha avuto accesso a due bottiglie di soluzione, uno dei quali conteneva acqua e l'altro una soluzione di etanolo di 10% (v/v). Gli oggetti erano successivamente divisa ed uniformemente assegnati a gruppi di droga trattamento, moxidectina (MOX) vs controllo salino, affinché ogni gruppo ci sono stati in media livelli di assunzione di etanolo con l...

Discussione

Le stime in tutto il mondo indicano che oltre 76 milioni di persone soddisfino i criteri per giustificare una diagnosi per disordine di uso di alcol (AUD). Purtroppo, trattamenti farmaceutici attualmente disponibili sono in gran parte inefficaci, e l'ulteriore sviluppo è necessario per compensare le esigenze di questa popolazione clinica²⁰. A tal fine, il seguente protocollo mira ad agevolare questo sforzo di esemplificando due del roditore più semplice bere paradigmi: due-bottiglia-scelta (TBC)...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L  graduated cylinder	VWR	https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co	To prepare ethanol solution.
1 L glass bottle	Pyrex (Fisher Scientific)	https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752	To prepare ethanol solution.
100 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311	To prepare ethanol solution.
Analox			One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine
ball-bearing sipper tubes	Ancare Corp.	http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point	Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100
C57BL/6J Mice	Jackson lab	https://www.jax.org/strain/000664	May also come from internal breeding colony
disposable serological pipets	VWR International (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged	10 mL, 18 mL, or 25 mL
ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC	Decon Labs (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec	---
heat gun	Master Appliances Corp.	http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/
heat shrink tubing	---	---	Diameter: 3/8 inches
industrial knife/blade	---	---	---
metal cage plate	---	---	Should be available through the university/institutional vivarium
mouse RO water	---	---	Should be available through the university/institutional vivarium
portable electronic scale	Ohaus (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus	---
red light headlamp	nyteBright (Amazon)	https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1	---
silicone stoppers	Fisher	---	---
thermometer	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232	---
weigh boat	VWR International (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes	The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative