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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) sono popolazioni eterogenee delle cellule che differiscono nella loro membrana cellulare marcatori, modelli di migrazione e distribuzione e nella loro presentazione dell'antigene e la capacità di attivazione delle cellule T. Poiché la maggior parte delle vaccinazioni di modelli sperimentali di tumore richiedono milioni di DC, sono ampiamente isolate dal midollo osseo o milza. Tuttavia, questi DC differiscono significativamente da sangue e tumore DC nelle loro risposte di immunocomplessi (IC) e presumibilmente di altri recettori lectinici Syk-accoppiato. D'importanza, data la sensibilità della DC a molecole associate al pericolo, la presenza di endotossine o anticorpi che passi crosslink recettori di attivazione in una dell'isolamento potrebbe provocare l'innesco della DC e incidere, di conseguenza i parametri, o almeno il dosaggio, richiesto per attivarli. Di conseguenza, qui descriviamo un protocollo dettagliato per isolare MoDC da sangue e tumori, evitando loro attivazione prematura. Inoltre, è fornito un protocollo per l'attivazione di MoDC con tumore IC e loro analisi successive.

Introduzione

Fin dalla loro scoperta, le cellule dendritiche (DC) sono stati un fuoco di approfondite ricerche a causa della loro capacità unica di inclinare di differenziazione delle cellule T1. Nel corso degli ultimi decenni, uno sforzo di ricerca ha cercato di definire i vari sottoinsiemi di DC e la loro funzione durante la progressione del tumore e immunità 2. DCs sono composte da popolazioni eterogenee delle cellule che differiscono gli uni dagli altri in loro recettori di riconoscimento di pattern, distribuzione tissutale, e migratori e antigene presentazione funzionalità3,4,5. Rispetto alla altre sottopopolazioni di DC, DC monocito-derivate (MoDC) sono molto più abbondanti nei tumori e può essere facilmente generato da circolanti o tumore-infiltrazione monociti6,7. Pertanto, molti studi clinici che cercano di trarre vantaggio della loro prevalenza relativa si basano sulla manipolazione in vivo ed ex vivo di MoDC autologo per provocare l'immunità delle cellule T 8,9.

Allo stesso modo, DC-based vaccinazione dei modelli sperimentali del tumore richiede 2-3 iniezioni seriale, 5-7 giorni di distanza, di 1-2 x 106 DC attivate ha pulsato con gli antigeni tumorali. Quindi, per ottenere questo grande numero di DC, maggior parte degli studi del mouse sono usati principalmente MoDC coltivate dai precursori del midollo osseo (BM) in GM-CSF per 7-9 giorni (IL-4 non è necessaria nella cornice del mouse)10,11. Tuttavia, dato che knockout di GM-CSF topi hanno nel complesso normale DC vano 12,13e dato le popolazioni miste ottenute da quella cultura,14 la rilevanza fisiologica di questi DC è stata messa in discussione.

In alternativa, la DC può essere ordinariamente isolato da cellule della milza. Tuttavia, la DC comprendono solo circa 0.3-0.8% delle cellule di totale della milza (con conseguente circa 7 x 105 DC/milza) e di queste cellule, solo CD103+ DC e MoDC possono migrare indietro in organi linfoidi. Poiché MoDC contengono circa 10-15% splenica DC popolazioni15,16, maggior parte dei protocolli di isolamento resa di circa 1 x 105 MoDC per milza. Espansione di MoDC può essere realizzato iniettando cellule trasfettate B16 che secernono GM-CSF, con un aumento di 100 volte in splenica MoDC17. Tuttavia, l'uso di MoDC per lo sviluppo di vaccini DC è limitato dal momento che questa procedura non può essere fatto in esseri umani ed l'ottenuti MoDC sono già altamente attivato.

Oltre a ottenere un numero adeguato di DC, un'altra sfida per lo sviluppo di vaccini DC efficaci contro le cellule tumorali autologhe comporta la mancanza di sufficienti segnali di pericolo nella regolazione del tumore per attivare completamente la DC. Induzione di segnali co-stimolatori avviene solitamente attraverso l'attivazione di recettori di riconoscimento di pattern (PRR), o lectine di tipo c segnalazione vie18,19,20,21. Un ulteriore approccio per l'attivazione di DC sfrutta la loro capacità di assumere gli antigeni attraverso l'interazione con recettori di superficie fcy (FcγR). Infatti, una serie di importanti manoscritti hanno indicato che l'iniezione di MoDC dai precursori BM attivato con tumore-IgG IC può prevenire la crescita tumorale nelle impostazioni di profilattiche e può portare all'eliminazione di tumori stabiliti22,23 .

In due recenti articoli, Carmi et al ha scoperto che a differenza di BMDC e milza DC, MoDC dal sangue e tumori non può rispondere a IgG IC senza ulteriori stimoli. Questo è stato trovato per essere dovuto la presenza di alti livelli intracellulari di fosfatasi tirosina che regolano FcγR24,25di segnalazione. Definendo un punto di controllo critico in DC, questo lavoro fornito uno spaccato importante i requisiti per la vaccinazione di successo basato su DC. L'esigenza di ulteriori stimoli attivare FcγR segnalazione e presumibilmente segnalazione da altri recettori lectinici utilizzando una cascata di fosforilazione simile, così sottolinea l'esigenza di evitare l'innesco della DC durante il loro isolamento.

Pertanto, il presente protocollo descrive l'isolamento di MoDC da sangue e tumori, che differiscono notevolmente da BM e milza DC, ed evidenzia le precauzioni da prendere in considerazione durante il processo.

Protocollo

I seguenti protocolli si riferiscono all'isolamento del mouse MoDC, ancora sui principi generali possono applicare ad altre celle di sottoinsiemi DC, pure. 12 - i topi C57Bl/6j 16-settimana-vecchio sono stati mantenuti in un'associazione americana per l'accreditamento di laboratorio Animal Care – accreditato animale impianto. Tutti i protocolli sono stati approvati dalla Stanford University e Tel-Aviv University istituzionale Animal Care e Comitato di uso.

1. isolamento del tumore associato monocito-derivate DC

  1. In una cappa a flusso laminare, rimuovere tumori da topi di CO2 eutanasizzati e tumori nel medium RPMI senza siero bovino fetale (FBS).
    Nota: Si consiglia di radere i topi e spruzzateli con etanolo al 70% prima di rimuovere i tumori, per ridurre al minimo potenziali contaminazioni dalla pelliccia. Essere certi che il tumore non superi 25-40 mm2 poiché i tumori più grandi hanno meno DC che tendono ad essere fragili e inclini a subire la morte delle cellule. Se sono necessarie più grandi numeri di DC, ogni mouse possa essere iniettati con cellule di tumori in più siti.
  2. Sotto una cappa laminare sterile, tritare i tumori utilizzando chirurgia forbici in piccoli pezzi (circa 1 x 1 mm2).
    1. Aggiungere tutti i frammenti del tumore da un mouse in un 30-mL fondo piatto tubo sterile con barre magnetiche, che contiene 5 mL di Hank equilibrata soluzione salina (HBSS), 2 mg/mL collagenasi IV e 0,01 mg/mL dnasi I.
      Attenzione: Le cellule mieloidi producono energia attraverso la glicosilazione, anche in stato stazionario. Di conseguenza, solo utilizzare supporti che contiene glucosio (per esempio HBSS, RPMI e DMEM), come fame di glucosio per il poco quanto 10-15 min si tradurrà in morte cellulare e l'apoptosi nell'arco delle 24 ore uso solo un basso endotossina collagenasi IV, come collagenasi vengono prodotte da batteri Gram-positivi batteri (Clostridium histolyticum).
  3. Mescolare a circa 200-400 giri/min in un incubatore a 37 oC con un agitatore magnetico per 20-30 min.
  4. Aggiungere 5 mL di multimediale completo e risospendere vigorosamente.
  5. Celle filtranti attraverso un colino di cella di 70 µm. Centrifugare a 4 oC 400 rcf per 5-10 min agglomerare le cellule.
    Attenzione: Non tentare di isolare le cellule direttamente dopo digestione enzimatica, come alcuni tumori sono necrotiche e contengono relativamente grandi quantità di detriti cellulari o matrice extracellulare. Applicare le cellule sul 15% densità gradiente medio per ottenere solo le celle.
  6. Sospendere 9 mL di mezzo di gradienti di densità con 1 mL di PBS 1x 10 per regolare osmolalità e ottenere 100% soluzione di riserva di Percoll. Mix 1.5 mL di terreno gradienti di densità soluzione con 8,5 mL HBSS e mescolare vigorosamente con pellet cellulare tumore-derivata. Delicatamente strato 2 mL di DMEM sulla cima 15% densità gradiente medio e centrifugare a 400 rcf per 20 min a temperatura ambiente. Scartare i surnatanti, come le cellule si formano una pallina nella parte inferiore del tubo.
    1. Lavare le cellule pellettate due volte da ri-sospendendoli in 10 mL HBSS contenenti 2% FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 10 mM EDTA (Buffer di isolamento) e centrifugare a 4 oC 400 rcf per 5-10 min per agglomerare le cellule.
    2. Contare le celle su un emocitometro utilizzando trypan blu sotto un microscopio chiaro.
  7. Risospendere le cellule di 1 x 108 isolatamente 1ml buffer e li Incubare a 4 oC con 30 μL di CD11b+ coniugato biglie magnetiche per 15 min.
    Attenzione: Evitare l'uso di perline CD11c-coniugati, poiché questo attiverà la DC e indurre la morte delle cellule. Non tentare di bloccare FcγRII e FcγRIII con gli anticorpi anti-CD16/32. Bloccando gli anticorpi legare FcγR e indurre forte fosforilazione delle MAP chinasi e adescare la DC.
    1. Rimuovere le perline non associate in eccesso aggiungendo 9 mL di buffer di isolamento e centrifuga cellule a 400 rcf per 5-10 min a 4oC.
  8. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di isolamento. Applicare le celle in una colonna magnetica lavata. Lavare la colonna due volte con 3 mL di buffer di isolamento.
    1. Rimuovere la colonna dal magnete. Pipettare 6 mL di buffer di isolamento sulla colonna e scovare le cellule magneticamente etichettati in una provetta sterile raccolta premendo lo stantuffo. Cellule di centrifuga a 400 rcf per 5-10 min a 4 oC.
    2. Risospendere le cellule in 100 μL per 1 x 107 cellule e macchia con i seguenti anticorpi coniugati fluorophore: Linage negativa (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI e Ly6G), MHCII, Ly - 6C.
  9. Ordinare celle di gating le cellule piccole, usando la dispersione laterale (SSC) e forward scatter (FSC) e cultura in completa supplementato con 5 ng/mL GM-CSF. Incubare le cellule per 1 ora a 3 7 oC al fine di consentire i macrofagi ad aderire la piastra. Quindi, trasferire il vagamente e cellule non aderenti a una nuova piastra di coltura.
    Nota: Il Mouse MoDC sono definiti come CD11b+/CD11c+/MHCIICiao/Ly6C/int 7,26,27. Espressione di Ly6C può variare notevolmente tra i modelli di tumore e in alcuni modelli (ad es. LMP) MoDC sono totalmente privi di espressione Ly6C. Nel complesso, un tumore di3 B16F10 100 millimetri in genere contiene 5 x 104 di DC, con conseguente circa 4-5 x 106 cellule totali. Di queste cellule, 10-15% sono cellule del sistema immunitario e 8-10% sono MoDC. Aumentando i numeri di CC può essere ottenuta iniettando topi con tumori a più siti. Solo piccole cellule SSC/FCS sorta, come altre cellule mieloidi possono esprimere marcatori quali CD11c e Ly6C.
    Opzionale: Ordinare i monociti di tumore-infiltrazione come piccole cellule SSC/FSC che esprimono Ly6CCiao sono negativi per MHCII. In seguito, cultura monociti in vitro con 50 ng/mL GM-CSF per ottenere DC.

2. isolamento di DC monocito-derivate da sangue periferico

Nota: Poiché MoDC maturo sono relativamente rari nel sangue del topo, il protocollo qui sotto si riferisce alla loro derivazione in vitro da monociti ordinati.

  1. Per aumentare i livelli dei monociti nel sangue, anestetizzare topi con 4% isoflurane e li iniettare per via sottocutanea (s.c.) con 1 μg di GM-CSF in 50 μL PBS.
  2. Dopo 1-2 h, sacrificare topi usando CO2.
    Attenzione: Non sacrificare topi di dislocazione cervicale, come questo provocherà un'emorragia interna.
  3. Subito dopo euthanization, spruzzare il mouse con etanolo al 70% e rimuovere la pelle che copre il cuore utilizzando forbici chirurgiche, sotto cappa a flusso laminare sterile. Pulire le forbici con etanolo e tagliare l'atrio destro del cuore. Lentamente, svuotare il cuore attraverso il ventricolo destro con 20 mM EDTA HBSS utilizzando una siringa da 10 mL e un ago 25-G.
    1. Raccogliere il sangue con una siringa sterile dalla cavità pleurica in una provetta sterile contenente solfato di heparan ed EDTA. Continuare a sciacquare il cuore fino a quando il fegato e il polmoni diventati rosa o il bianco.
  4. Applicare sangue su una centrifuga di medio gradiente di densità a 400 rcf a temperatura ambiente per 15 min con freni basso.
    Attenzione: Utilizzo privo di endotossina densità gradiente medio (di solito meno di 0,12 EU / mL).
    1. Raccogliere le cellule mononucleari in una nuova provetta. Lavare le cellule sospendendo nuovamente in 10 mL HBSS contenenti 2% FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 10 mM EDTA (buffer di isolamento) e centrifugazione poi alle 4 oC 400 rcf per 5-10 min agglomerare le cellule.
      Attenzione: Utilizzare solo i supporti che contiene almeno 1 g/L di glucosio.
  5. Per la selezione positiva di CD11b, risospendere 1 x 108 cellule in 1 mL di tampone di isolamento e li Incubare per 15 minuti con 50 µ l di coniugato CD11b biglie magnetiche alle 4 oC.
    1. Lavare in eccesso perline aggiungendo 9 mL di buffer di isolamento e centrifugazione a 400 rcf per 5-10 min a 4 oC. aspirato i sovranatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di isolamento. Applicare le celle in una colonna magnetica lavata secondo le istruzioni del produttore.
    2. Rimuovere la colonna dal magnete, pipettare 6 mL di buffer di isolamento sulla colonna e scovare le cellule magneticamente etichettati in una provetta sterile raccolta premendo lo stantuffo. Centrifugare le cellule a 400 rcf per 5-10 min a 4 oC. Wash la colonna due volte con 3 mL di buffer di isolamento.
    3. Risospendere le cellule a 1 x 107 cellule/100 μL isolamento buffer e macchia con i seguenti anticorpi coniugati fluorophore: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII e 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 celle.
  6. Ordinare celle di gating su piccola dispersione (SSC) e le cellule piccole forward scatter (FSC).
    Nota: Monociti infiammatori del Mouse sono generalmente definiti come CD115+/MHCII/neg/Ly6CCiaoe pattugliare i monociti sono definiti come CD115+/MHCII/neg/Ly6Cneg 4,5. In casi in cui non è necessaria nessuna separazione tra i due sottoinsiemi, totale SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo celle possono essere ordinate. Sia ingenuo e topi del tumore-cuscinetto contengono circa 5-8 x 104 MoDC per 1 mL di sangue e fino a 4-5 x 105 MoDC segue iniezione di GM-CSF. Di loro, circa il 70% sono monociti infiammatori e 30% pattugliano i monociti.
  7. Piastra le cellule ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL in un completo media completato con 20 ng/mL GM-CSF. Dopo 1 giorno, trasferire le cellule non-aderenti e vagamente aderente a una cultura e una nuova piastra per altri 4-5 giorni.
    Attenzione: Media DC non dovrebbe essere completati con piruvato.

3. preparazione dei complessi immuni tumore-IgG

  1. Cellule del tumore e di cultura nel matraccio di cultura 75cm2 alla confluenza del 70% in media DMEM completi.
    1. Aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina/EDTA per staccare le cellule dalla morfologia cultura boccetta e monitor cella sotto un microscopio chiaro per evitare sovra-trypsinization.
    2. Aggiungere 8 mL di coltura completo (ogni 2 mL di tripsina) per inibire la digestione della tripsina e centrifugare a 4 oC, 400 rcf per 5-10 min agglomerare le cellule.
      Nota: Assicurarsi di controllare le cellule del tumore per Mycoplasma utilizzando un kit commerciale di PCR. Test per la presenza di batteri gram-negativi e fungine endotossine utilizzando Limulus metodo Lysate (LAL) analisi di28). Siero deve essere filtrato attraverso 0.22 μM e testato per i 9 virus Code of Federal Regulations. Inoltre, testare la cultura media e sieri facendo cadere 100-200 μL su LB agar o brodo e la cultura per 2 giorni a 37 oC.
    3. Lavare le cellule ancora da resti di tripsina e siero sospendendo nuovamente in 10 mL di PBS e centrifugare a 400 rcf per 5-10 min. aspirare il surnatante e ripetere il lavaggio 2 volte.
  2. Difficoltà cellule in paraformaldeide al 1,8% tamponata per 10 min a temperatura ambiente.
    1. Lavare le cellule sospendendo nuovamente in 10 mL di PBS e centrifugare a 4 oC 400 rcf per 5-10 min.
    2. I surnatanti aspirato e ripetere lavare due volte.
      Facoltativo: Per analisi di assorbimento del tumore, le cellule possono essere contrassegnate tramite incubarle per 5 min a 37 oC in PBS contenente estere di 1 μM carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE). CFSE viene raffreddato con supporto completo per 10 min in ghiaccio. Le cellule devono essere lavate estensivamente in PBS contenente 2% di siero per rimuovere tintura residua.
  3. Risospendere le cellule in FACS buffer (PBS completato con 2% FCS + 5 mM EDTA) e 0,5 μg/mL di anti-CD16/32 per bloccare potenziali interazioni non specifiche proteina-proteina. Piastra in una forma a U 96 pozzetti/piastra ad una concentrazione di 1 x 105 cellule per 100 μL.
    1. Aggiungere varie diluizioni di anticorpi tumore-leganti che vanno da 5 μg - 5 ng/1 x 105 celle. Incubare la piastra sul ghiaccio per 15-20 min.
      Nota: IgG anticorpi sono stati isolati dal siero dei topi femminili di 20-24 settimane vecchio ingenuo su colonne di proteina A, come descritto24.
  4. Lavare le cellule aggiungendo 150 µ l di PBS e centrifugazione la piastra a 4 oC 400 rcf per 5-10 min.
    1. Eliminare i sovranatante e ripetere il lavaggio due volte. Risospendere le cellule in 100 μL FACS tampone anticorpo secondario coniugato fluoroforo. Incubare la piastra sul ghiaccio per 20 min.
    2. Lavare le cellule con l'aggiunta di 200 μL di tampone di FACS e centrifugazione la piastra a 400 rcf per 5-10 minuti scarta i sovranatante e ripetere il lavaggio.
    3. Analizzare l'associazione del tumore tramite flusso cytometry e determinare la concentrazione minima richiesta per rivestire le cellule.
      Nota: Anticorpi che non aumentano intensità media di fluorescenza (MFI) delle cellule del tumore macchiate da almeno cinque volte sopra controllo di isotipo non dovrebbero essere usati nelle successive analisi funzionale.

4. attivazione di MoDC con IC tumore-IgG

  1. Rivestire le cellule del tumore con una concentrazione minima di IgG, come descritto nelle sezioni 3.1-3.4.3
    1. Un giorno prima di attivare MoDC con tumore IC, sostituire MoDC cultura media, che contiene GM-CSF. Per farlo, è delicatamente aspirare i media e lavare le cellule una volta con mezzi di coltura completa pre-riscaldato.
      Nota: Isolato maturo MoDC associati al tumore dovrebbe essere coltivato per almeno 2-3 h (o anche durante la notte) dopo l'ordinamento in media completi senza GM-CSF e prima di loro attivazione con IC.
    2. Per le analisi di assorbimento di tumore, aggiungere il tumore CFSE-etichetta IC a MoDC in un rapporto di 1:5 (IC:MoDC) e incubare per una notte per 12-16 h in 1 mL di multimediale completo per 1 x 106 DC.
    3. Per le analisi di FACS di esperimenti di attivazione MoDC, aggiungere tumore-IC con rapporto 1:1 (IC:MoDC) e incubare per una notte per 12-16 h.
      Nota: Si consiglia vivamente di includere un controllo positivo, in cui MoDC sono stimolati con 1 μg/mL di LPS o altri agonisti TLR.
    4. Dopo l'attivazione durante la notte, aspirare i sovranatante e lavare le cellule delicatamente tre volte con buffer di isolamento o 10 mM EDTA HBSS.
    5. Per dissociare DC dalla piastra, incubare le cellule per 2-3 min in 1 mL HBSS contenente 10 mM EDTA e staccare le cellule pipettando vigorosa.
    6. Centrifugare le cellule a 400 rcf e risospendere 1 x 106 DC in 90 μL PBS, completati con 2% di FCS, 5mm EDTA (buffer di FACS) e 0,5 μg di bloccare gli anticorpi. Incubare in ghiaccio per 5-10 min.
    7. Aggiungere 10 μL di miscela di anticorpi alle cellule di colorazione e incubare in ghiaccio per 15 min.
    8. Aggiungere 2 mL FACS tampone alle cellule e centrifugare a 4 oC 400 rcf per 5-10 min.
  2. Risospendere le cellule in buffer di FACS 200 μL.
    1. Aggiungere 0,5 - 1 μg/mL di DAPI 1-2 min prima di eseguire i campioni, per escludere le cellule morte dalle analisi. Non sovra-Incubare DAPI, come MoDC esso assumerà entro 10-15 min.

Risultati

Inizialmente abbiamo confrontato la capacità degli anticorpi da topi syngeneic e trapianto allogeneic ingenuo di legarsi alle cellule del tumore. A tal fine, B16F10 e LMP linee cellulari del tumore erano fissate in paraformaldeide e lavate estensivamente. B16F10 è una linea cellulare di melanoma, che è stato originariamente isolato da metastasi del polmone in topi C57Bl/6. LMP è una cellula di tumore pancreatico che è stata isolata da KrasG12D / +, LSL-Trp53R172H / + e Pdx-1-Cre topi...

Discussione

Dato il gran numero di DC necessaria per vaccinare i topi (circa 2-4 x 106 DC per un topo), la maggior parte della vaccinazione strategie nei topi si basano sull'isolamento di DC da BM e milza seguita da loro attivazione ex vivo . Tuttavia, i tentativi di attivare tumore DC in vivo, utilizzando le stesse condizioni per l'attivazione della milza e BM DC, spesso rimaste soccombenti nella produzione efficace immunità. In due successive pubblicazioni, Carmi et al. hanno trovato che sang...

Divulgazioni

Tutti gli autori dichiarano non hanno alcun conflitto di interessi e che non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Nessuno

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19861
Collagenase IVSigmaC9697-50MGTest each lot for endotoxin
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071Test each lot for endotoxin
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC/Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE/Cy7-CD15Biolegend135523

Riferimenti

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