Valutazione basata sulle attività di anoressia in topi

Riepilogo

Topi alloggiati individualmente con una rotella corrente mentre dato accesso limitato al cibo sviluppano riduzioni nel consumo alimentare e aumentano l'attività sulla ruota in esecuzione. Questo fenomeno sperimentale viene chiamato anoressia basato sulle attività. Questo paradigma fornisce uno strumento sperimentale per lo studio della neurobiologia e comportamenti sottostanti gli aspetti dell'anoressia nervosa.

Abstract

Roditori sviluppano anoressia basato sulle attività (ABA) quando esposti a un programma di alimentazione limitato e consentito l'accesso gratuito ad una rotella corrente. Queste condizioni portano a una pericolosa riduzione del peso corporeo. Tuttavia, roditori esposti a una sola di queste condizioni, in definitiva, adattano per ristabilire il peso corporeo normale. Anche se aumentato esecuzione accoppiato con riduzione dell'ingestione di cibo volontaria apparire paradossale in condizioni di ABA, ABA comportamento è osservato attraverso numerose specie di mammiferi.

Il paradigma di ABA fornisce un modello animale per anoressia nervosa (AN), un disturbo alimentare con grave alterazione dell'appetito-comportamento. Soggetti sono alloggiati singolarmente con accesso gratuito ad una rotella corrente. Ogni giorno, il soggetto viene offerto cibo per un periodo limitato di tempo. Durante il corso dell'esperimento, il peso corporeo di un soggetto diminuisce da alta attività e basso apporto calorico. La durata dello studio varia in base quanto cibo è offerto ogni giorno, il tipo di cibo offerto, il ceppo del mouse, se i farmaci sono in fase di test e fattori ambientali.

Una mancanza di trattamenti farmacologici efficaci per un pazienti, qualità della vita bassa, alto costo del trattamento e loro alto tasso di mortalità indicano l'urgenza di ulteriori ricerche AN. Forniamo una struttura di base per l'esecuzione di ABA esperimenti con i topi, offrendo un metodo per indagare AN-come comportamento al fine di sviluppare nuove terapie. Questo protocollo è ottimizzato per l'utilizzo in topi Balb/cJ, ma può essere facilmente manipolato per altri ceppi, offrendo grande flessibilità nel lavorare con diverse domande, soprattutto legate a fattori genetici dell'ABA.

Introduzione

Dal 1953, roditori sono stati segnalati per mostrare un'iperattività paradossale sull'esecuzione ruote quando ricevono accesso gratuito alle ruote mentre subiva hypophagia volontaria quando la disponibilità di cibo è limitato¹. Al contrario, roditori non cadere rapidamente nel peso corporeo quando offerto cibo su un programma senza eseguire ruote o quando ospitato con rotelle di scorrimento in e offerto cibo ad libitum^1,2,3. Il modello di ABA in modo affidabile risultato drammatico calo del peso corporeo, hypophagia, ipotermia, perdita di estro e una maggiore stimolazione dell' asse HPA⁴. In definitiva, ABA provoca la morte, a meno che il soggetto è rimosso dal paradigma⁵. Il paradigma di ABA offre ai ricercatori un modello animale di AN, un complesso disturbo alimentare caratterizzata da grave alterazione dell'appetito-comportamento, che colpisce circa 1 su 100 femmine e una minore percentuale di maschi⁶. I pazienti affetti da AN esibiscono frequentemente iperattività, che consiste di estrema quantità di esercizio fisico, e/o irrequietezza generale^7,8. Con un tasso di mortalità di circa il 10%, AN ha il più alto tasso di mortalità tra tutti i disturbi psichiatrici⁹. Il trattamento corrente per AN è limitato alle terapie cognitive, come esistono trattamenti farmacologico approvato per chi soffre di una di^10,11.

AN è stato considerato in genere come un disordine che interessa principalmente le femmine. Come una diagnosi che è 10 volte più probabile nelle femmine rispetto ai maschi, soggetti di sesso femminile sono tradizionalmente il fuoco in un¹². Tuttavia, dovrebbe adottare particolare attenzione ad escludere i maschi dagli studi. Mentre la diagnosi di un resti inferiore nei maschi, dismorfia muscolare (MD) è una condizione che ha molte somiglianze con AN, in quanto è distorta immagine corporea e dieta è spesso disordinata. Non c'è supporto per la nozione che la MD e AN possono essere classificati in un simile modo^13,14,15. Questo potrebbe suggerire che alcuni casi di MD rappresentano la versione"maschile" di AN. Nel contesto di modelli animali, alcuni rapporti hanno suggerito che i maschi sono più suscettibili rispetto alle femmine il paradigma di ABA. Ad esempio, un recente studio ha mostrato un più alto tasso di mortalità e diminuita assunzione di cibo rispetto alle femmine di topi C57Bl/6¹⁶. Un fattore predittivo di suscettibilità all'ABA è l'attività fisica spontanea (SPA). Ratti con maggiore o minore SPA sono più probabilità di perdere peso nel paradigma della ABA, con maschi ratti che mostrano un effetto più forte di femmine¹⁷. Al contrario, femminile roditori sono stati osservati per esercitare più di maschi durante la fase di restrizione di ABA¹⁸. Inoltre, studi con topi Balb/cJ hanno dimostrato l'effetto opposto di topi C57Bl/6, dove i topi femminili hanno un più alto tasso di mortalità e diminuita assunzione di cibo rispetto ai maschi (Figura 1)⁶. Con diversi risultati tra i sessi nel paradigma della ABA e aumentare la consapevolezza dei maschi con disordinata mangiare modelli, soggetti maschili e femminili devono essere testati.

A parte le differenze del sesso nel paradigma della ABA, età e ceppo deve essere considerati quando scegliendo soggetti. Adolescente topi possono modellano più accuratamente AN, poiché AN in genere emerge nell'adolescenza, come osservato con ratti e topi^19,20,,,²¹²². Ceppi che sono più attivi di altri a livello della linea di base hanno un più alto tasso di suscettibilità e la severità di ABA²³. Ceppi conosciuti per avere livelli elevati di ansia, come DBA/2, hanno aumentato l'attività, che indicherebbe un più veloce tasso di abbandono del paradigma di ABA²⁴della rotella. Secondo il disegno sperimentale, il ceppo di scelta può essere adattato per massimizzare la durata dell'ABA.

Il paradosso di ABA non è univoco ai topi. Altri mammiferi tra cui ratti, criceti, gerbilli, maiali, scoiattoli e cavie hanno dimostrato questo fenomeno⁶. La conservazione del fenomeno ABA attraverso specie di mammiferi suggerisce che il paradigma di ABA può fornire uno strumento traslazionale per studiare i meccanismi alla base di anoressia-come comportamento negli esseri umani. Topi in particolare sono adatti per lo studio dei meccanismi alla base di ABA. Topi possono essere alloggiati densamente e tempo di generazione è relativamente breve. I topi hanno un genoma sequenziato completamente, e numerosi ceppi inbred, nazionali e speciali, ad esempio congenics, sono disponibili. Un vasto numero di linee geneticamente manipolati è stato generato, che li rende ideale per gli studi di valutazione genetica influenza sui disturbi quali e Depending sulla questione a portata di mano, i ricercatori possono manipolare l'espressione complessa di circuiti e/o gene neurale per valutare il comportamento del paradigma di ABA, potenzialmente rispondendo alle domande su influenza genetica che non sono possibili quando si studia gli esseri umani.

Un numero limitato di modelli animali di AN attualmente esistenti. Modelli di stress inducono hypophagia nei roditori utilizzando coda pizzicotti, indotta da novità hypophagia, piscina fredda e stimolazione cerebrale. Attraverso l'induzione di stress, cambiamenti nell'asse HPA diminuiscono l'appetito con conseguente corpo ridotto peso²⁵. Tuttavia, l'asse di HPA è anche potentemente stimolato dall'ABA, che incorpora anche funzionalità aggiuntive di AN come iperattività. Un altro modello da considerare a studiare AN è la restrizione alimentare cronica. Limitando il cibo ad una gamma da 40 a 60% di ad libitum, uno in grado di simulare la risposta fisiologica a malnutrizione²⁶. Anche se questo metodo è efficace per studiare gli effetti di alimentazione inadeguata, non riprodurre una questione fondamentale di AN, che è la restrizione alimentare volontaria. Nel paradigma della ABA, gli animali sono privi di accesso al cibo per parte della giornata, ma anche volontariamente riducono l'ingestione di cibo, se è presente anche una ruota. Modelli genetici sono stati utilizzati anche per esaminare l'eziologia dei ricercatori e hanno trovato fattori neurochimici e genetici implicati in AN, come il gene BDNF e neurotrasmettitori dopamina e serotonina²⁷. L'uso di modelli genetici è fondamentale capire i meccanismi neurali alla base AN. Tuttavia, gli studi di vasta associazione di genoma per AN non hanno ancora dato i successi significativi, e non rare varianti in AN sono state identificate. Gli studi futuri dovrebbero combinare un approccio genetico con il modello di ABA per aumentare la comprensione dei fenotipi AN-correlati.

Lo sviluppo di modelli animali per intero disturbi psichiatrici è praticamente impossibile a causa della complessità e l'eterogeneità dei disordini umani. Tuttavia, di componenti specifici, ben definite di un disturbo psichiatrico di modellazione, è possibile ottenere intuizioni uniche di neurobiologia o fisiopatologia sottostante. Tali intuizioni biologici possono quindi essere utilizzati per identificare nuovi trattamenti. Il paradigma di ABA roditore pertanto fornisce uno strumento preclinico per studiare i meccanismi alla base di un simile comportamento che eticamente non può essere studiato nell'uomo, come gli effetti delle manipolazioni genetiche, perturbazioni ai circuiti neurali e la conseguenze di alcuni fattori ambientali.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di California, San Diego.

1. topi

1. Scegliere il ceppo del mouse appropriato per lo studio.
2. Topi di acquistare da un fornitore o amplificare una linea per ottenere numeri sperimentali appropriati.
3. Gruppo-casa acquistata topi nella struttura animali per almeno 1 settimana prima dell'inizio dello studio per consentire per un periodo di acclimatazione ampio.
4. Iniziare la fase di acclimatazione pre-sperimentale quando i topi sono 8 settimane di vita.

2. abitazione

1. Scegliere gabbie che sono abbastanza grande da contenere una rotella corrente non ostruita, ricettacolo di cibo e una bottiglia d'acqua.
2. Regolare la temperatura e l'umidità per integrare l'ipotesi da testare.
   Nota: Temperature più elevate riducono lo sviluppo di ABA²⁸.

3. rotelle di scorrimento in

1. Scegliere ruote con comunicazione wireless per evitare potenziali distrazioni e coinvolgimenti all'interno della gabbia, vedere la Tabella materiali per un esempio.

4. bottiglie di acqua

1. Selezionare una bottiglia di acqua che non saranno in concorrenza per lo spazio con il running ruota o recipiente di cibo dalla gabbia.
2. Se fornendo trattamento farmacologico nell'acqua potabile, nastro di condotta della bottiglia per creare un ambiente sensibile alla luce.

5. cibo

1. Selezionare un chow di basso contenuto di grassi appropriato per l'ipotesi in fase di test (ad es., roditore dieta 8604 di Envigo).
   Nota: Le diete alte in grassi e zuccheri possono ridurre lo sviluppo di ABA²⁹.
2. Utilizzare un piccolo vaso di vetro per fornire chow, circa 65 cm di diametro x 50 cm in altezza.
   Nota: Un alimentatore automatico può essere utilizzato invece di un barattolo di vetro, che può ridurre lo stress limitando l'interferenza di investigatore. Questo può essere più vantaggioso se eseguire studi di ABA con manipolazioni farmacologiche.

6. fase di acclimatazione pre-sperimentale

1. Impostare l'area sperimentale scegliendo un rack di gabbia vicino i mozzi ruota e computer portatile. Ciò limiterà problemi con trasmissione dei dati.
2. Accendere il computer portatile e senza fili mozzi.
3. Aprire il software di gestione di ruota sul portatile.
   1. Guarda il software per garantire che entrambi gli hub sono attivi.
   2. Apri "strumenti" e seleziona "Elimina ruote". Ripetere questo passaggio 5 volte.
   3. Chiudere il software, quindi riaprirlo.
4. Inserire 3 batterie AAA nella batteria di una base della rotella.
   1. Collegare i cavi di pack batteria all'hardware della base della rotella. Questo sarà disconnesso prima dell'uso. Chiudere il pacco batteria nella base della rotella.
5. Controllare il software affinché la base della rotella è elencato con l'ID "1" sotto l'hub wireless appropriata. Se la base non è elencata come ID "1", sganciare la batteria e iniziare sopra al punto 6.2.
6. Modificare l'ID di ruota da "1" per l'ID del mouse nella colonna nome.
7. Base di rotella corrente sul fondo della gabbia con del nastro adesivo per garantire stabilità di aderire. Non consentire qualsiasi nastro attaccare fuori, come topi saranno masticare sul nastro esposto.
8. Scegli un disco volante in esecuzione senza un pezzo magnetico corroso.
9. Posizionare la ruota sulla base e ruotare la rotellina per verificare la distanza dalle pareti della gabbia e grata.
10. Girare il disco un numero specifico di rotazioni per garantire che il software della rotella è correttamente conteggio rotazioni.
11. Evitare che pezzi di chow vada perduta sul bagnato biancheria da letto o di ottenere dal dotto-taping la parte inferiore del vaso del cibo per il piano di gabbia, lontano la ruota e la bottiglia d'acqua.
    Nota: Chow bagnato aumenta l'assunzione di cibo rispetto ad per asciugare chow³⁰.
12. Posto 5 pezzi di chow nel barattolo.
    Nota: Il chow durante la fase di pre-sperimentale è disponibile ad libitum e non deve necessariamente essere pesato. L'esposizione all'esecuzione ruote durante il periodo di acclimatazione può intensificare ABA^21,31.
13. Posizionare una bottiglia piena di acqua nella gabbia e fornire acqua ad libitum.
14. Ripetere fino a quando tutte le gabbie hanno una trazione in esecuzione in modalità wireless collegato, cibo e acqua.
15. Individualmente posizionare topi nelle loro gabbie appropriate.
16. Nella ruota gestione del software, andare su "file" e fare clic su "Avvia acquisizione".
17. Guarda l'aggiornamento del software per garantire rotazioni ruota vengono contate e il sistema sta funzionando bene.
18. Acclimatare topi per le condizioni di stabulazione per 2 giorni totale.
19. Valutare topi durante questa fase per garantire che siano abbastanza sani per gestire l'esperimento di ABA.
20. Verifica gabbie per qualsiasi allagamento da bottiglie di acqua ogni giorno. Se bottiglie hanno allagato, sostituire la vecchia gabbia con una nuova gabbia e ripetere i passaggi necessari per aderire ruote e cibo per la gabbia senza interferenze.
21. Il giorno 2, verifica gabbie per i livelli di cibo. Se il cibo è basso, rabboccare con 2 pezzi di chow. Farlo senza disturbare i topi.
    Nota: Se durante la fase di acclimatazione pre-sperimentale qualsiasi mouse espone hypophagia o è sottopeso, rimuovere il mouse dallo studio.

7. sperimentale della linea di base fase - giorno 1

1. Selezionare "fine" e poi "Avvia acquisizione" nel software di gestione della rotella.
2. Misurare chow 9 g in un piccolo bicchiere in plastica su una scala con sensibilità 0.00 g. Registrare il peso esatto.
3. Rimuovere delicatamente e pesare il mouse in un grande bicchiere in plastica su una scala con sensibilità 0.0 g. Peso record.
   Nota: È fondamentale limitare lo stress dei topi durante la manipolazione, quindi gestirli con pazienza.
4. Smaltire tutto il cibo acclimatazione.
5. Biancheria da letto di ricerca per qualsiasi cibo che sia stato rimosso dal vaso e smaltire che pure.
6. Lasciare la bottiglia d'acqua in luogo, ma assicurarsi che sia adeguatamente completo.
7. Pulire sporchi in esecuzione ruote con 70% isopropanolo e carta asciugamani.
8. Se la pulizia era necessario, dopo che si asciuga l'isopropanolo, tornare il mouse alla sua gabbia e sostituire la gabbia sul rack.
9. Ripetere questi passaggi fino a quando ogni mouse viene pesato e 9 g di cibo è misurata fuori e messi in gabbie.

8. sperimentale della linea di base fase - 2-7 giorni

1. Tornare all'alloggio degli animali allo stesso tempo ogni giorno. Non variano nel prendere misure di più o meno di 10 min.
2. Misurare chow 9 g in un piccolo bicchiere in plastica su una scala con sensibilità 0.00 g. Registrare il peso esatto.
3. Rimuovere delicatamente e pesare il mouse in un grande bicchiere in plastica su una scala con sensibilità 0.0 g. Peso record.
4. Tirare il barattolo di cibo fuori dalla gabbia e dump tutto il cibo in un piccolo Becher sulla scala 0.00 g.
   1. Se le feci e biancheria da letto sono nel vasetto con il cibo, scegliere tutte le lenzuola e le feci. Usare un piccolo setaccio per strofinare il cibo in polvere nel becher pesatura. Rimuovere qualsiasi feci prima di fare questo con una pinzetta (se necessario).
      NOTE: Biancheria da letto non si romperà in pezzi più piccoli per passare attraverso il filtro.
   2. Cercare eventuali residui di cibo nella gabbia e aggiungerli al becher da pesare. Registrare la quantità di cibo restanti.
      Nota: Se la biancheria da letto e la gabbia deve essere cercati, è meglio farlo mentre il mouse è nella gabbia pesare Becher o trasferimento per ridurre lo stress.
   3. Smaltire tutto il cibo.
5. Pulire il vaso pulito e inserire nuovamente la gabbia. Se necessario, sostituire il nastro.
6. Posto il misurato in precedenza 9 g di nuovo alimento nel barattolo.
7. Pulita di sporco in esecuzione ruote con 70% isopropanolo, quindi asciugare le ruote. Fare questa uno gabbia alla volta e non accidentalmente scambiare ruote.
8. Terminare e riavviare l'acquisizione nel programma della rotella ogni altro giorno.
9. Ripetere questi passaggi fino all'inizio della fase di restrizione.

9. sperimentale restrizione fase - giorno 1

1. Fine e inizio acquisizione del software di gestione di ruota.
2. Pesare il cibo di vecchi e nuovi di topi, secondo il protocollo di linea di base.
3. Non pulire le ruote ora. Questo potrebbe distrarre topi durante il loro periodo di alimentazione limitata.
4. Consentire l'accesso al nuovo cibo, 9 g di chow, per 6 h. Registrare l'ora di cibo è offerto.
   Nota: Il tempo durante il ciclo di luce che il cibo è disponibile influenzerà lo sviluppo dell'ABA. Poiché topi dormono normalmente durante il ciclo di luce, dando accesso al cibo durante questo tempo esacerba lo sviluppo dell'ABA, dal momento che i topi non consumano solitamente la maggior parte del loro cibo quotidiano in questo momento. Al contrario, topi dati accesso al cibo durante il ciclo scuro si svilupperanno più lentamente ABA³². Regolare la durata dell'accesso al cibo si tradurrà in più o più breve sopravvivenza volte (Figura 2). Attività anticipatoria cibo (FAA) è iperattività, che si verifica immediatamente prima che il cibo è offerto^32,33,34. FAA può influenzare lo sviluppo dell'ABA, come è stato dimostrato che la negazione di accesso della rotella durante FAA migliora ABA comportamento³².
   1. Rimuovere il cibo esattamente 6 h più successivamente per ogni mouse e misurare il quantitativo residuo. Registrare l'ora di cibo viene rimosso.
5. Pulire le ruote in questo momento, se necessario e tentare di farlo senza ottenere il tirando cibo dalle gabbie successive.
6. Pesare il cibo e calcolare la differenza in cibo per determinare la quantità di cibo mangiato per topo.
7. Calcolare il peso di dropout per ogni mouse.
   Nota: Peso di Dropout è quando un mouse deve essere rimosso dall'esperimento quando raggiunge il 75% della sua misurazione finale del peso corporeo basale. Ad esempio, se un mouse pesa 20g all'inizio della fase di restrizione, quando raggiunge 15 g deve essere rimosso dall'esperimento.
8. Conservare una copia del forcellino pesi sul mano nella struttura degli animali.
   Nota: Gli esperimenti valutazione recupero da ABA possono essere tentati; il cibo è sia fornito ad libitum o ruote sono bloccate, per studiare il processo mediante il quale topi ritorno un corpo sano peso³⁴.

10. sperimentale restrizione fase - 2 e 14 giorni

1. Ripetere tutti i passaggi di misurazione nel protocollo 1 giorno di restrizione. Non riavviare acquisizione di ruota.
2. Se un mouse raggiunge goccia peso (75% del suo peso corporeo basale), rimuovere il vaso ruota e cibo dalla gabbia e fornire cibo in abbondanza sul fondo della gabbia, quindi procedere con altri topi. Una volta che hanno visto la partecipazione di tutte le gabbie, eutanasia tutti i topi che hanno raggiunto il peso di goccia.
3. Lasciare la ruota per ogni mouse per tutta la durata dell'esperimento.
4. Controllare ogni mouse al giorno per eventuali lesioni. Se necessario, clip danneggiati le unghie dei piedi, trattare piaghe, ecc Ask personale di cura degli animali per un Consiglio se non siete sicuri su come procedere con un infortunio.

11. che termina lo studio

1. Se lo studio è durato 14 giorni, pesare tutti i topi il giorno 15. Restrizione giorno 1 peso è considerato un peso basale.
   Nota: La lunghezza dello studio può essere modificata per indirizzare l'ipotesi da testare. Lunghi periodi di accesso cibo di durata possono essere utilizzati per estendere la lunghezza di studio.
2. Eutanasia topi come necessario.
3. Prendere attrezzature sporche di camere adeguate.
4. Fine acquisizione totali ruota il giorno 15 di fornire 10 giorni completi dei dati.
5. Disabilita i mozzi delle ruote senza fili.
6. Estrarre i dati.
7. Analizzare i dati.

Risultati

Fattore neurotrophic cervello-derivato (BDNF), una proteina che contribuisce alla regolazione di alimentazione così come manutenzione del peso, è ridotta nel siero di pazienti con un³⁵. Questo esperimento ha valutato gli effetti dell'alimentazione pianificata, in esecuzione accesso ruota o entrambi sull'espressione di BDNF nell'ippocampo (HPC), area tegmentale ventrale (VTA), nucleo accumbens (NAc) e la corteccia prefrontale mediale (mPFC). Espressione della mole...

Discussione

L'esperimento di ABA può essere modificato da sperimentatori di testare diversi ceppi, età, droghe e varie altre variabili del cuscinetto e nella variabilità genetica mente, regolazioni per il running ruota o il periodo di accesso di cibo sarebbero aumentare o fare diminuire la severità di sintomi e tasso di dropout. Questo può servire per aumentare o diminuire la durata dell'esperimento, a seconda della domanda sperimentale di interesse.

Misurazione accurata dell'ingestione di cibo è un...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wireless Low Profile Running Wheels, Hubs, Software	Med Associates	ENV-047
Standard Teklad Rodent Chow	Envigo	8604
8 Week Old Mice	Jackson Laboratories	Balb/cJ	Strain used in our study - Can use other strains to assess ABA
Scout Pro Scale 200 g	Ohaus	SPE202	Used to weigh mice
Scout Pro Scale 400 g	Ohaus	SPE402	Used to weight food