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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Abstract

Interneuroni GABAergici (INs) sono componenti fondamentali delle reti neuronali che guidano la cognizione e comportamento. INs destinato per popolare la corteccia tangenzialmente migrano dal loro luogo di origine nel telencefalo ventrale (compresi da eminenze gangliare mediale e caudale (MGE, CGE)) alla piastra corticale dorsale in risposta ad una varietà di intrinseche ed estrinseche Stecche pool. Diversi metodi sono stati sviluppati nel corso degli anni per geneticamente manipolare percorsi specifici e indagare come regolano le modifiche dinamiche del citoscheletro necessari per una corretta migrazione. Nell'utero elettroporazione è stato ampiamente utilizzato per studiare l'effetto di repressione genica o sovraespressione in specifici IN sottotipi durante la valutazione dell'impatto sulla morfologia e posizione finale. Tuttavia, mentre questo approccio viene prontamente utilizzato per modificare radialmente migrazione delle cellule piramidali, più tecnicamente è difficile quando ins nell'utero elettroporazione di targeting genera un rendimento basso dato i tassi di sopravvivenza in diminuzione di cuccioli quando l'elettroporazione è condotta prima e 14.5, come di consueto quando si studia INs MGE-derivato. In un approccio alternativo, MGE espianti consentono un facile accesso a MGE e facilitano l'imaging del INs geneticamente modificati. Tuttavia, in questi espianti, INs migrare in una matrice artificiale, priva di spunti di orientamento endogeno e thalamic ingressi. Questo li ha spinti per ottimizzare un metodo dove INs possono migrare in un ambiente più naturalistico, mentre eludere le sfide tecniche di approcci nell'utero . In questo articolo, descriviamo la combinazione dell'elettroporazione ex utero dei cervelli embrionali del mouse seguita da fetta su colture organotipiche prontamente traccia, immagine e ricostruire geneticamente INs la migrazione lungo i loro percorsi naturali in risposta a Stecche pool endogeno. Questo approccio consente sia la quantificazione degli aspetti dinamici della migrazione con Time-lapse imaging confocale, così come l'analisi dettagliata dei vari parametri morfologici utilizzando un neurone ricostruzioni sul tessuto fisso immunolabeled.

Introduzione

Interneuroni GABAergici corticale (INs) sono diverse per quanto riguarda la loro proprietà biochimiche, connettività e proprietà fisiologiche e mediano funzioni diverse in reti maturo1,2,3 ,4,5. La specifica dei diversi sottotipi di INs corticale è strettamente regolata attraverso cascate genetiche che sono stati estesamente studiati1,2. La maggior parte (70%) di corticali GABAergici INs provengono da progenitori nell'eminenza gangliare mediale (MGE), una struttura embrionale situata ventralmente e necessario migrare attraverso le distanze relativamente lunghe per raggiungere la placca corticale1, 2 , 6. mentre le cellule piramidali corticali migrano radialmente dalla zona ventricolare (VZ) alla piastra corticale lungo il patibolo glia radiale, la migrazione tangenziale di INs, che non sono collegati a tali un'impalcatura, richiede una varietà di intrinseca e estrinseche spunti per attirare la migrazione dei neuroni verso la piastra corticale, mentre guidarli lontano da strutture non-corticali2,7,8. Dopo l'uscita del ciclo cellulare, INs sono respinti da MGE da chemio-ripugnante segnali espressi all'interno il VZ di MGE, che innesca la migrazione tangenziale verso il piatto corticale9,10. Migrazione in evitare lo striato con l'ausilio di diversi spunti ripugnante11 e, dopo aver raggiunto la placca corticale, passare da una tangenziale a una modalità di migrazione radiale e raggiungere la loro posizione finale laminare, parzialmente in risposta a stimoli da piramidale le cellule12 e altre popolazioni cellulari13. La migrazione di INs, come per altre popolazioni neuronali, comporta vari cambiamenti morfologici dinamici per consentire l'effettivo movimento del neurone. Questa cosiddetta locomozione neuronale è caratterizzata da cicli ripetitivi di tre fasi successive: l'allungamento di un processo di leader, un movimento attivo anterograda del nucleo (nucleokinesis) e la retrazione del processo finale14. IN migrazione è regolata da numerosi segnali intrinseci ed estrinseci che guidano la ramificazione e rimodellamento attivo del processo di leader per guidare INs nella direzione corretta, determinare l'orientamento e la velocità di migrazione14,15 ,16.

I fattori determinanti che regolano corticale IN migrazione sono stati ampiamente studiati negli ultimi anni1,2,7,17,18,19,20, e la rottura in alcuni di questi attori molecolari è stata postulata per condurre ai disordini dello sviluppo neurologico, quali pediatrici refrattari epilessia o autismo spettro disturbi1,2,21, 22 , 23 , 24. Pertanto, lo sviluppo di diversi approcci in vitro e in vivo è stato perseguito per avanzare in modo significativo la nostra capacità di studiare questo processo dinamico, come precedentemente esaminati25. In vitro i metodi, tra cui l'analisi della camera di Boyden e analisi della scelta di striscia, forniscono il mezzo più veloce e più riproducibile per valutare il requisito e la cella-autonomo impatto di specifici geni o proteine durante la migrazione neuronale, senza l'influenza di altri fattori25. Questi test sono particolarmente utili quando combinato con formazione immagine live8,26,27. Con queste tecniche, INs sono facilmente Estratto da e13.5 MGE e isolato da dissociazione enzimatica e meccanica, dopo di che possono essere studiate diverse vie di segnalazione e spunti di orientamento, come illustrato in precedenza8,28 . Tuttavia, queste analisi si svolgono in una tabella extracellulare artificiale in assenza di architettura tridimensionale del tessuto, che può alterare un neurone proprietà di comportamento e delle cellule, che interessano potenzialmente cella migrazione e/o sopravvivenza25. Per ovviare a queste limitazioni, ex vivo MGE espianti sono stati sviluppati come uno strumento alternativo per quantificare i dinamici cambiamenti morfologici che si verificano durante la migrazione insieme a parametri quali la velocità e l'orientamento14, 29. Generazione di espianti MGE è relativamente semplice ed è stato ampiamente descritto altrove30. Essa comporta la placcatura di un piccolo estratto di MGE su un monostrato di cellule corticali miste o in una miscela di matrigel e collagene in presenza di segnali di attrazione o repulsione25, anche se questi ultimi sono opzionali31. MGE espianti consentono per l'alta risoluzione di imaging delle cellule scarsamente etichettate, semplificando lo studio di processi intracellulari, come rimodellamento del citoscheletro durante processo leader di ramificazione, come illustrato in precedenza32,33 ,34 e nello studio presente. MGE espianti sono stati utilizzati con successo per valutare dinamici cambiamenti citoscheletrici durante la migrazione in un ambiente 2D, ad esempio dopo specifiche manipolazioni farmacologiche o chemiotattiche (Vedi, ad esempio, Tielens et al 201633) . Tuttavia, con questo approccio, INs la migrazione all'interno di una matrice artificiale, e questo potrebbe alterare nel comportamento e la riproducibilità e la significatività dei risultati sperimentali.

Al contrario, nell'utero elettroporazione consente la manipolazione genetica di INs nel loro ambiente nativo ed è un metodo ampiamente usato a rapidamente ed efficientemente valutare l'impatto di guadagno e la perdita di funzione del gene mentre eludere le limitazioni di lunghe e costose knockout e knock-in strategie25,35. Elettroporazione in utero può essere sbilanciata verso nei progenitori utilizzando promotori specifici di tipo cellulare e posizionando gli elettrodi verso le strutture ventromedial, tra cui il MGE36. Inoltre, nell'utero elettroporazione consente l'espressione tempestiva dei costrutti sperimentale entro 1-2 giorni, rispetto al 7-10 giorni necessari per costrutto espressione utilizzando virali vettori25. Tuttavia, nell'utero elettroporazione nei progenitori tende ad essere basso rendimento. Infatti, anche se dei progenitori delle cellule piramidali che si trova nella zona ventricolare dorsale possono essere efficientemente transfected utilizzando nell'utero elettroporazione, targeting più ventralmente trova strutture, come il MGE, è tecnicamente più impegnativo, soprattutto in e13.5 piccoli embrioni e l'alto tasso di letalità embrionale ulteriormente riduce la resa sperimentale25.

Per aggirare alcune delle limitazioni tecniche associate in vitro MGE explant esperimenti e in vivo nell'utero elettroporazione, ex vivo su colture organotipiche fetta sono stati sviluppati8,37, 38,39. Cervello organotipiche fetta culture offerta il vantaggio di che imita in vivo le condizioni, pur essendo meno costoso e che richiede tempo di generazione animale i modelli25. Infatti, queste preparazioni consentono un facile accesso a MGE, insieme con la visualizzazione specifica dell'INs e possono essere combinate con focale elettroporazione per indagare i meccanismi molecolari specifici nella INs la migrazione in un ambiente più fisiologico8 , 39 , 40 , 41. Pertanto abbiamo ottimizzato un approccio per organotipiche culture38, che abbiamo combinato con elettroporazione ex utero e time-lapse imaging confocale, per valutare appieno il processo morfologico e dinamico che si verificano durante la migrazione tangenziale di MGE-INs. Il presente protocollo è stato adattato e ottimizzato da altri che hanno usato le culture di fetta elettroporazione e organotipiche a cervello ex utero o nell'utero per studiare la migrazione delle cellule piramidali42,43 e corticale INs36,39,44. In particolare, gli embrioni del mouse vengono decapitati e MGE è individulamente ex vivo dopo l'iniezione intraventricolare dei plasmidi sperimentali, che permette più efficiente e preciso targeting dei progenitori MGE rispetto a ciò che può essere raggiunto con nell'utero elettroporazione. I cervelli sono quindi estratte e sezionato a fette coronali intero cervello che possono essere coltivate per pochi giorni, consentendo in tal modo continuo monitoraggio e imaging di INs trasfettate. Questo approccio etichette in genere 5-20 INs tangenzialmente la migrazione per fetta di cervello, riducendo al minimo il numero di iterazioni sperimentali necessari per raggiungere la significatività statistica, mentre etichettatura una sufficientemente scarsa densità di popolazione neuronale per garantire facile separazione delle singoli neuroni per la ricostruzione e la valutazione morfologica bene. Inoltre, rispetto al MGE espianti, colture organotipiche garantiscono che la migrazione aggiuntivi sono esposti a un ambiente più naturale, tra cui ingressi da afferenze thalamic e chemochine secrete localmente. Questo approccio è così adatto per quantificare la direzionalità e migratorio percorso adottato da trasfettate INs, offrendo dettagli anatomici sufficienti per consentire la caratterizzazione dei processi dinamici più fini come leader processo ramificazione, nucleokinesis e retrazione del processo finale.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) presso il centro di ricerca di CHU Sainte-Justine e sono stati condotti in conformità con il Consiglio canadese su Guida di cura degli animali per la cura e l'uso di animali da esperimento (ed. 2).

Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per elettroporazione di embrioni al giorno embrionale (e) 13.5, in un momento quando INs MGE-derivati vengono generati attivamente, prima il picco della CGE-derivato INs produzione45,46. Inoltre, per polarizzare l'elettroporazione verso GABAergic INs, usiamo un promotore selettivamente espresso in INs (per esempio il promotore Dlx5/6 con relativo minimo enhancer)47.

1. preparazione di soluzioni per elettroporazione e culture organotipiche fetta

  1. Preparare 125 mL di terreno di coltura sterile.
    1. Misura 125 mL di terreno di coltura di neurone-specific regolare (Vedi Tabella materiali per formulazione) in un flacone sterilizzato in un precedentemente sterilizzati con UV di biosicurezza spruzzato con etanolo al 70%. Aggiungere 2,25 mL di 50 x supplemento privo di siero di neurone-specific, 1,75 mL di glutamina 200mM (concentrazione finale di 0,5 mM) e 6,25 mL di siero inattivato con calore cavallo precedentemente aliquotato in condizioni sterili. Mescolare accuratamente, aliquota in 15 mL provette coniche sterili e conservare a 4 ° C.
      Nota: Il terreno di coltura preparato possono essere memorizzato fino a 3 settimane a 4 ° C.
    2. Dividere un 100 X soluzione di riserva di N-2 formulazione48 di Botteinstein 150 aliquote µ l in condizioni sterili e congelare a-20 ° C fino all'utilizzo.
  2. Preparare 1 L di liquido sterile cerebrospinale artificiale (ACSF).
    1. Misura 800 mL di acqua distillata in un becher da 1 litro. Aggiungere 25,67 g di saccarosio, 5,08 g di cloruro di sodio (NaCl), 2,18 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3), 1,80 g di glucosio, 0,19 g di cloruro di potassio (KCl), 0,15 g di sodio fosfato monobasico anidro (NaH2PO4), 1 mL di 1 M stock CaCl2 .2H2O e 2 mL di 1 M stock MgSO4.7h2O. mescolare per sciogliere a temperatura ambiente. Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume totale di 1 L.
    2. Usando un filtro da 0,22 µm, filtrare la soluzione in una bottiglia sterile in una cappa di biosicurezza sterilizzato e conservare a 4 ° C per 1 mese.
  3. Preparare una soluzione fresca di 4% di agarosio in ACSF prima di ogni esperimento.
    1. Misura 25 mL di ACSF precedentemente preparato in una provetta conica sterile da 50 mL e aggiungere 1 g di agarosio di punto basso punto di fusione.
    2. Calore per 45 s nel forno a microonde. Per evitare fuoriuscite, interrompere il riscaldamento ogni 3-4 e quando inizia a bollore, aprire il tubetto per consentire la pressione fuori, richiuderlo e agitare manualmente per mescolare l'agarosio. Ripetere fino a quando la soluzione di agarosio è omogenea. Tenere la soluzione di agarosio a 42 ° C durante il resto dell'esperimento per evitare la solidificazione.
      Nota: Temperature più elevate possono danneggiare i tessuti cerebrali.

2. preparazione di plasmidi per l'iniezione

  1. Tirare una pipetta di vetro microiniezione
    1. Impostare la levetta micropipetta con i parametri appropriati, fissare il capillare di vetro nello spazio fornito e assicurarsi che sia centrato con il filamento.
    2. Premere il tasto di tiro.
    3. Rimuovere con cautela le pipette di microiniezione appena effettuata dall'estrattore di calore e posto in una scatola o una capsula di Petri pulita fino all'ulteriore utilizzo per evitare di danneggiare la punta.
  2. Set-up la cappa di biosicurezza con tutti gli strumenti necessari per questo esperimento (Vedi Figura 1A), Spruzzare generosamente tutti gli strumenti nella cappa di biosicurezza con etanolo al 70% e sterilizzare gli strumenti e l'ambiente con luce UV per 15-20 min.
  3. Durante la fase di sterilizzazione, scongelare i plasmidi su ghiaccio (4 ° C).
  4. Misurare 10 µ l del plasmide da una soluzione madre (4 µ g / µ l) in una provetta da centrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 0.01% di Fast Green FCF. Mescolare delicatamente, gira brevemente e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo.
    Nota: Maxi-prep DNA dovrebbe essere preparato secondo il protocollo del produttore utilizzando un kit di endotossina-libero maxi-prep. DNA può essere solubilizzato buffer di TE o nucleasi-free H2O e la preparazione del plasmide con colorante soluzione può, ma non non devono essere eseguite in condizioni sterili. Plasmidi da Maxi-prep dovrebbero essere aliquotati per evitare più cicli di gelo-disgelo. Plasmidi aliquotati devono essere miscelati con il colorante più che 2 h prima dell'uso e non devono essere ricongelati per ulteriore uso.
  5. Dopo la sterilizzazione, preparare il nano-iniettore come segue.
    1. Scegli uno di vetro precedentemente preparato microinjection pipetta memorizzata in una scatola pulita o la capsula di Petri e la uso piccole pinzette per tagliare la punta della pipetta in modo smussato per ottenere un diametro esterno di circa 15 µm.
      Nota: Il diametro esterno dato qui è una misura approssimativa per dare all'utente un'idea di ciò che usiamo nei nostri esperimenti ed è stato ottimizzato al fine di agevolare il piercing del cranio per l'iniezione di plasmide senza danneggiare il cervello, pur consentendo il fluido caricamento e rilascio del DNA. Il diametro esterno può essere misurato osservando il tagliata punta della pipetta microiniezione vetro apposto a una barra di scala micrometrica con un microscopio a campo chiaro.
    2. Utilizzare una siringa per riempire la micropipetta con olio minerale dalla sua fine unpulled (per espellere tutta l'aria).
    3. Inserire la micropipetta di vetro riempito in nano-iniettore seguendo le istruzioni del produttore.
    4. Vuoto 2/3rds della micropipetta di vetro (mantenendo abbastanza olio per impedire l'immissione di aria).
  6. Inserire la micropipetta preparata nella provetta contenente la soluzione di plasmide/colorante e riempire la micropipetta di vetro con la soluzione di plasmide/colorante.

3. raccolta di embrioni di topo da femmine gravide

  1. Monitorare femmine riproduttrici quotidianamente per valutare per collegare vaginale, preferibilmente allo stesso tempo ogni giorno (primo pomeriggio). Giorno 0.5 corrisponde al primo giorno quando si osserva un plug vaginale.
    Nota: Gli esperimenti descritti qui possono essere condotti in topi wild-type. Tuttavia, per facilitare l'identificazione di MGE e di etichettare tutti i GABAergici INs (o specifici sotto-insiemi come INs MGE-derivato), animali transgenici possono essere utilizzati (ad es.: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre con un allele di Cre-reporter, ecc47,49). In questo caso, il plasmide sperimentale iniettato dovrebbe esprimere un altro fluoroforo (per esempio mCherry o TdTomato) per consentire la visualizzazione del INs trasfettate (giallo) che può essere confrontato con INs non trasfettate (verde).
  2. Sacrificare la femmina al e13.5 giorno embrionale, dalla dislocazione del collo.
    Nota: Gli anestetici dati al momento del sacrificio possono avere un impatto IN migrazione e la sopravvivenza di50,51 e dovrebbero essere evitati.
  3. Raccogliere gli embrioni con taglio cesareo, come segue.
    1. Spruzzare generosamente l'addome femminile con etanolo al 70%. Tirare la pelle dell'addome con un paio di pinze sterili e, con l'altra mano, utilizzare forbici chirurgiche sterilizzate per tagliare la pelle dall'addome.
    2. Con un secondo paio di forbici e pinze sterilizzate, tirare la fascia addominale e tagliarlo, evitando accuratamente l'utero.
    3. Utilizzando un terzo paio di forbici e pinze sterilizzate, tirare i corni uterini e tagliarli fuori dalla cavità pelvica. Posizionare i corni uterini dissecati in una capsula di Petri 60mm sterile riempito con neurali basati cultura supplementato con aminoacidi, vitamine e sali inorganici (Vedi Tabella materiali per prodotto commercialmente disponibile).
  4. In una sterile di biosicurezza, utilizzare due coppie di pinzette bene (uno in ogni mano) per sezionare gli embrioni fuori la placenta e isolare le teste per decapitazione.
  5. Taglio obliquo la punta di una pipetta di trasferimento in plastica sterile mL 3, aspirare le teste e trasferimento in un nuovo piatto di petri sterile di 60 mm a strati con cera nera solidificata e riempito con la stessa base neurale completati terreno di coltura come sopra.
    Nota: Questo passaggio riduce al minimo il trasferimento di contaminanti (mouse capelli, sangue). La cera nera viene utilizzata per stabilizzare la testa durante la dissezione. Terreni di coltura non è necessario essere ossigenato durante queste procedure.

4. intraventricolare plasmide iniezioni ed Ex Vivo elettroporazione di MGE

Nota: La procedura seguente deve essere eseguita in condizioni sterili nella biosicurezza precedentemente preparato.

  1. Posto di Petri 60 mm a strati con cera nera e contenente le teste decapitate in neurale basato completati di coltura sotto il binocolo nella cappa di biosicurezza.
  2. Stabilizzare la testa, la parte rostrale rivolto verso destra, con una pinzetta bene con la mano sinistra e utilizzare il nano-iniettore nella mano destra per iniettare 1-2 µ l della soluzione plasmide/colorante nel ventricolo laterale di destra.
    Nota: Gli esperimenti di co-espressione possono essere condotto da co-electroporating un plasmide di salvataggio e un plasmide che esprimono shRNA mescolando entrambi plasmidi alle concentrazioni equimolari.
  3. Electroporate il cervello iniettato.
    1. Posizionare la testa tra gli elettrodi con l'elettrodo negativo posizionato dorsalmente e parallelo alla testa e l'elettrodo positivo verso il lato ventrale della testa per indirizzare il MGE.
    2. Una volta che gli elettrodi siano ben posizionati, consegnare 4 impulsi quadrati di 40 V per 50 ms a 500 ms interpulso intervalli.
    3. Rimuovere qualsiasi tessuto residuo dagli elettrodi usando la pinzetta già nel pensile la biosicurezza.
      Nota: Questi parametri sono stati ottimizzati appositamente per il electroporator utilizzato nei nostri esperimenti. È consigliabile che gli utenti eseguano test di ottimizzazione in anticipo se si utilizza un diverso tipo di electroporator.
    4. Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.3 per tutti i cervelli rimanenti.
      Nota: Sebbene questo protocollo descrive le manipolazioni necessarie per un cervello, è possibile inserire fino a 4 cervelli in sequenza prima di electroporating ogni cervello, aumentando così il rendimento. Questa strategia è particolarmente vantaggiosa quando 2 o più diversi plasmidi sono iniettati in sequenza (ad es. controllo o plasmide sperimentale) durante lo stesso esperimento (permettendo per il confronto tra littermates). Inoltre, è possibile iniettare ed electroporate contemporaneamente entrambi i lati del cervello per aumentare il rendimento, posizionando gli elettrodi completamente parallela alla superficie del cervello.

5. dissezione e culture organotipiche fetta del cervello

  1. Mentre ancora manipolare in ambiente sterile della cappa di biosicurezza, sezionare il cervello dal cranio.
    1. Stabilizzare la testa sullo strato di cera nera inserendo un ago in ogni occhio, evitando accuratamente il cervello.
    2. Utilizzare un paio di pinzette bene di tenere il lato sinistro del collo e un secondo paio di pinzette bene per strappare la pelle dal cranio, dal retro al fronte.
    3. Tenendo la testa lateralmente con le pinzette in una mano, è necessario utilizzare un altro paio di pinzette in altra mano per tagliare con cura il cranio a livello del tronco cerebrale e tirare delicatamente il cranio. Con ogni pinzetta, tagliare il cranio nel piano sagittale (linea mediana) verso la parte anteriore e poi incise lateralmente per liberare i frammenti di cranio.
    4. Sollevare il tronco cerebrale e tagliare con cura le meningi e dei nervi cranici, fino a quando il cervello è completamente fuori dal cranio.
      Nota: Tutti i passaggi descritti in 5.1 devono essere eseguiti in severe condizioni di sterilità in una cappa di biosicurezza.
  2. Incorporare il cervello in agarosio al punto basso punto di fusione 4% per il sezionamento.
    1. Riempire una scatola di Petri 35mm con la soluzione di agarosio preparata in precedenza (mantenuto liquido a 42 ° C).
    2. Trasferire rapidamente un cervello individulamente al piatto pieno di agarosio utilizzando la pipetta tagliato precedentemente. Tenere il piatto a temperatura ambiente.
    3. Mescolare l'agarosio con un bastone di metallo per mantenere il cervello al centro del pozzo (per evitare l'affondamento) e posizionare il cervello in un aereo rostro-caudale parallelamente al piatto. Smettere di mescolare quando l'agarosio inizia a solidificare, per evitare danni cerebrali.
    4. Usare una lama di rasoio per tagliare l'agarosio che circonda il cervello al fine di formare un blocco rettangolare, lasciando un margine di 1-2 millimetri intorno al cervello. Assicurarsi che la parte rostrale del cervello sia perpendicolare al limite anteriore del blocco per facilitare l'orientamento per le successive fasi di sezionamento.
    5. Ripetere per ogni cervello.
      Nota: È possibile tagliare più di un cervello alla volta (massimo 3) dalla modellatura dell'agarosi separata blocchi durante l'impostazione di ogni cervello a diverse altezze.
  3. Sezioni coronali VIBRATOME e fetta di cultura.
    1. Disgelo un'aliquota di 100 X N-2 supplemento (150 µ l) sul ghiaccio e aggiungere 15 mL di coltura aliquotati in condizioni sterili.
    2. Trasferire 750 µ l di terreno di coltura (con 1 X N2 supplemento) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti.
    3. Con una pinzetta curva, inserire un inserto di cultura cellulare (diametro 30 mm, diametro dei pori 0,4 µm, PTFE) in ciascuna medio-riempito bene.
    4. Riempire il bagno vibratome ACSF continuamente ossigenato. Raffreddare a 4 ° C con il ghiaccio circostante la vasca, o utilizzare una vibratome refrigerate.
    5. Impostare la velocità del vibratome a 0,150 mm/s e la frequenza a 80 Hertz.
    6. Incollare il blocco di agarosio su piattaforma vibratome, rostrale bordo rivolto verso il basso e ventrali tagliente rivolto verso l'utente.
    7. Tagliare il cervello in sezioni coronali per ottenere 250 µm di spessore sezioni (a 4 ° C).
    8. Con spatole sterilizzate, raccogliere le sezioni 2-3 contenente la MGE e luogo inseriscono tutte le sezioni del cervello da un animale su una singola membrana di 30 mm, mentre con cura evitando sovrapposizioni tra le sezioni. Collocare l'inserto in un pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti (contenente 750 µ l di terreno di coltura completato, come descritto sopra). In alternativa, ogni sezione può essere posizionato su una membrana di diametro 13 mm separato in una piastra di coltura 12-pozzetti riempita con terreno di coltura 500 µ l completati. La quantità di terreno di coltura consigliata per ciascun pozzetto permette le sezioni di cervello deve essere nutrita dai media senza essere sommersi.
      Nota: La procedura descritta in 5.3.6 e 5.3.7 non avvengono in condizioni di sterilità completa, a meno che il vibratome possono essere sterilizzate e utilizzate in una cappa di biosicurezza. Di conseguenza, è fondamentale per condurre questi passi attentamente per evitare eventuali contaminazioni. Adeguati dispositivi di protezione (pulire la maschera, guanti chirurgici e camice da laboratorio) devono essere indossato in ogni momento e parti del corpo, anche coperto, come capelli, viso e mani, non dovrebbe mai passare sopra piastre di coltura (con o senza terreno di coltura). Si raccomanda anche di spruzzare etanolo al 70% frequentemente sui guanti e spatole utilizzate per raccogliere le sezioni di cervello.
    9. Posizionare la piastra di coltura in un ventilata sterile incubatore a 37 ° C con 60% umidità e 5% CO2 per 48 o 72 h.
      Nota: Questi tempi di incubazione sono stati ottimizzati per l'imaging time-lapse di MGE-derivato INs e imaging confocale di fette fisse, rispettivamente. Tempi di incubazione ottimale dovrebbero essere testati in anticipo per ogni disegno sperimentale. Inoltre, se l'incubazione selezionata è 72 h e sotto, non c'è nessuna necessità di cambiare il mezzo di coltura. Tempi di incubazione più lunghi, il terreno di coltura dovrebbe essere cambiato ogni 2-3 giorni.
    10. Dopo il tempo di incubazione desiderato, trasferire le sezioni di interesse a un vetrino coprioggetti 8-a temperatura ambiente e aggiungere 3-5 µ l di terreno di coltura. Posto il vetrino coprioggetto in una camera climatica (37 ° C, umidità 60%, 5% CO2) collegato a un invertito filatura disco confocale equipaggiato con un software di acquisizione di computer-assistita di set-up la sessione di imaging time-lapse.
      Nota: In alternativa, sezioni possono essere fissati con paraformaldeide al 4% (durante la notte a 4 ° C o 2 ore a temperatura ambiente) e, successivamente, immunostained con anticorpi differenti per la visualizzazione delle caratteristiche morfologiche di individulamente INs sotto un confocale microscopio. Anche se eGFP e mCherry possono essere visualizzate mediante microscopia confocale senza alcuna procedura di contro-colorazione, si consiglia di eseguire immunohistochemistry contro GFP e mCherry per migliorare il segnale, poiché il processo di fissazione può ridurre la fluorescenza, riducendo il rilevamento di componenti più fini dei neuroni embrionali, come rami più piccoli nei processi iniziali o finali.

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Risultati

In questa sezione forniamo risultati rappresentativi ottenuti seguendo l'elettroporazione ex utero di un plasmide di controllo, o di un plasmide sperimentale un gene di interesse, in MGE degli embrioni del mouse e13.5 seguita da colture organotipiche fetta di targeting incubati a 37 ° C per 48 h (per l'imaging di time-lapse) o 72 h (per la fissazione e l'etichettatura immunohistochemical) (cfr. Figura 1B per protocollo schematico). Esempi rappresent...

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Discussione

In questo articolo, forniamo un metodo affidabile per l'esecuzione ex utero elettroporazione del mouse MGE presso e13.5 e per la generazione di colture organotipiche di fette del cervello embrionale. Sebbene metodi in vitro , quali l'analisi della camera di Boyden, sono relativamente facili da eseguire e possono essere utilizzati per valutare i ruoli specifici di diversi geni e proteine senza l'interferenza di altri fattori, precludono l'indagine IN dinamiche di migrazione per quanto riguarda la direzio...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare. Le opinioni qui espresse non rappresentano necessariamente le opinioni di ministro della sanità o il governo del Canada.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla Fondazione Savoy e Fondazione Epilessia cura di funzionamento e di attrezzature concede dalla Fondazione canadese per l'innovazione al pronto soccorso (microscopio confocale) e Gallo (microscopio confocale del disco di filatura). Pronto soccorso riceve un premio alla carriera dalla Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) così come dalla canadese Institutes for Health Research (CIHR; Premio giovane ricercatore). G.H. è un anziano studioso di FRQ-S. L. e è il destinatario del premio di formazione post-dottorato Steriade-Savoia dal Savoy Foundation, il premio di formazione post-dottorato CHU Sainte-Justine Foundation e il premio di formazione post-dottorato FRQ-S, in collaborazione con la Fondazione delle stelle. Questo progetto è stato reso possibile dal cervello Canada attraverso il fondo di ricerca del cervello Canada, con il sostegno finanziario di Health Canada, assegnato a L.E.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103049Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplementThermoFisher Scientific1750404450X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubesSarstedt62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)ThermoFisher Scientific11415064Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-GlutamineInvitrogen25030-081
Horse serum, heat inactivatedMillipore-SigmaH1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100XWisent305-016Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mLVWR89132-062
Class II Type A Biosafety CabinetNuaireNU-540
SucroseBioShopSUC700.1
Sodium ChlorideBioShopSOD001.1
Sodium bicarbonateThermoFisher ScientificS233-500
D+ glucoseMillipore-SigmaG7528-250G
Potassium ChlorideThermoFisher ScientificP217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrousBioShopSPM400.500
Calcium chloride dihydrate ThermoFisher ScientificC79-500
Magnesium sulfate heptahydrateBiosShopMAG522
AgaroseBioShopAGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubesSarstedt62.547.004
1.5 mL centrifuge tubesSarstedt72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette pullerSutter Instruments Co.Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary TubeDrummond scientific1-000-800/12
EthanolVWRE193
5 mL syringeBecton Dickinson & Co309646
Mineral Oil (heavy)Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5World Precision Instruments50451111 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7World Precision Instruments50450411.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC TweezersWorld Precision Instruments50461711 cm, Straight, flat
Operating scissorsWorld Precision Instruments50122516 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing ForcepsWorld Precision Instruments50121712.5 cm, straight, serrated
Iris ForcepsWorld Precision Instruments50447810.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue ForcepsWorld Precision Instruments50199615 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded endsFisherScientific21-401-5You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond scientific3-000-204
TC Dish 60, StandardSarstedt83.390160-mm dish
Tissue culture dishSarstedt83.180035-mm dish
Black WaxFisherScientificS17432
Transfer pipettes Ultident170-CTB700-2123 mL, small bulb
Stereo MicroscopeLeica BiosystemsLeica M80In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square PoratorBTX Harvard ApparatusECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mmBTX Harvard Apparatus45-0487
25G 1 1/2Becton Dickinson & Co305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtomeLeica BiosystemsVT1000S
GEM, Single edge razor bladeElectron Microscopy Sciences71952-10Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 wellIbidi80827Pack of 15
Millicell cell culture insertMillipore-SigmaPICM0RG5030 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscopeLeica MicrosystemsN/A
Spinning disk confocal head Ultraview VoxPerkin ElmerN/A
Volocity 6.0 acquisition softwareImprovision/Perkin ElmerN/A
LiveCell Stage top incubation systemPathology devicesLC30030Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscopeLeica
mCherry-Lifeact-7Addgene54491Gift from Michael Davidson
Fast Green FCFMillipore-SigmaF7258-25G25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

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