L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare iniezione ultrasuono-guida del neuroblastoma (NB) e cellule (ES) il sarcoma di Ewing (stabilito linee cellulari e cellule tumorali derivate dal paziente) biologicamente rilevanti siti per creare modelli preclinici affidabili per il cancro ricerca.

Abstract

Test preclinici di terapie anticancro si basa su modelli di xenotrapianto pertinenti che imitano le tendenze innate del cancro. Modelli standard fianco sottocutaneo vantaggi procedurali facilità e la capacità di progressione del tumore monitor e risposta senza imaging invasivo. Tali modelli sono spesso incoerenti nei test clinici traslazionale e con limitate caratteristiche biologicamente rilevanti con bassa propensione a produrre metastasi, come c'è una mancanza di un microambiente nativo. In confronto, modelli di xenotrapianto ortotopici presso siti nativi del tumore sono stati indicati per imitare il microambiente tumorale e replicare le caratteristiche di malattia importante come diffusione metastatica distante. Questi modelli richiedono spesso noiose procedure chirurgiche con periodi prolungati di tempo e recupero anestetici. Per risolvere questo problema, i ricercatori del cancro hanno recentemente utilizzato tecniche di iniezione ultrasuono-guida per stabilire modelli di xenotrapianto del cancro per gli esperimenti preclinici, che permette per istituzione rapida e affidabile di tessuto-regia di modelli murini. Visualizzazione di ultrasuono fornisce anche un metodo non invasivo per la valutazione longitudinale del tumore attecchimento e crescita. Qui, descriviamo il metodo per iniezione ultrasuono-guida delle cellule tumorali, che utilizzano la ghiandola surrenale per NB e capsula renale sub per ES. Questo approccio mini-invasivo supera l'impianto noioso chirurgia a cielo aperto delle cellule tumorali nel tessuto-specifici percorsi di crescita e di metastasi e sporadicamente periodi di recupero morboso. Descriviamo l'utilizzo di linee cellulari stabilizzate e di linee cellulari derivate paziente per iniezione ortotopico. Pre-fatte kit commerciali sono disponibili per la dissociazione del tumore e luciferasi tagging delle cellule. Iniezione di sospensione cellulare utilizzando Consiglio di immagine fornisce una piattaforma come minimo dilagante e riproducibile per la creazione di modelli preclinici. Questo metodo viene utilizzato per creare modelli preclinici affidabili per altri tumori, come la vescica, fegato e pancreas, esemplificando il suo potenziale non sfruttato per numerosi modelli di cancro.

Introduzione

Modelli animali dello xenotrapianto sono strumenti essenziali per studi preclinici di terapie anticancro. Gli xenotrapianti murini standard si basano sull'impianto sottocutaneo fianco delle cellule, fornire un sito efficiente e facilmente accessibile per controllare la crescita del tumore. Lo svantaggio dei modelli sottocutanei è la loro mancanza di caratteristiche biologiche del tumore-specifici, che possono limitare la loro potenziale riprodurrsi per metastasi¹. Tali limitazioni sono superate mediante l'utilizzo degli xenotrapianti di orthotopic in quale tumore le cellule sono innestate in siti di tessuto nativo, fornendo un microambiente pertinente con potenziale metastatico². Modelli di xenotrapianto ortotopici mantengono originale caratteristiche biologiche e forniscono modelli affidabili per droga preclinici discovery^3,4. Le cellule tumorali utilizzate per l'impianto diretto di tessuto sono linee cellulari stabilizzate o cellule paziente-derivate da tumori di pazienti. Gli xenotrapianti stabiliti da linee cellulari del cancro possono esibire alta divergenza genetica del tumore primario rispetto al paziente gli xenotrapianti derivata⁵. Detto questo, l'istituzione degli xenotrapianti orthotopic paziente-derivato è diventato lo standard preferito per testare nuove terapie nella scoperta della droga di cancro.

Nel neuroblastoma (NB) di cancro pediatrico, modelli di xenotrapianto ortotopici ricapitolano biologia del tumore primario e sviluppano metastasi ai tipici siti di NB diffondere^6,7. NB si sviluppa nella ghiandola adrenale o lungo la catena simpatica paravertebral. I metodi più comuni di orthotopic impianto richiedono procedure chirurgiche trans-addominale aperte. Tali metodi sono spesso noiosi, hanno un'elevata morbilità animale e periodi di recupero complesso. Ecografia ad alta risoluzione è stato recentemente utilizzato per l'impianto diretto di tessuto delle cellule del tumore nello sviluppo di diversi modelli murini per cancro ricerca^8,9. La tecnica è affidabile, riproducibile, efficiente e sicuro per la creazione di tumore metastatico pertinenti xenotrapianti^10,11.

L'istituzione degli xenotrapianti di cancro pediatrico di ultrasuono-guida destinazione organo ago e localizzazione impianto di linee cellulari e cellule tumorali paziente-derivato è dimostrata¹¹. La tecnica è stata utilizzata per NB mirati alla ghiandola surrenale murina. Sarcoma di Ewing (ES) è principalmente un cancro osseo, comunemente-veduto nelle ossa lunghe come il femore e le ossa pelviche¹². Rapporti di caso hanno dimostrato che per determinare se la crescita di un cancro principalmente osseous è realizzabile in tessuto renale, una posizione capsulare renale sub è stato scelto per l'impianto di orthotopic¹³. L'impianto delle cellule capsulare renale sub delle cellule del tumore è stata utilizzata come un promettente modello per studiare le metastasi spontanee per ES¹⁴.

Protocollo

Tutto il lavoro è stato fatto in conformità con la University of Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) ed è conforme alle procedure approvate dal Comitato Università sull'uso e la cura degli animali (UCUCA). L'unità per laboratorio di medicina animale (ULAM) ha supervisionato la cura degli animali.

Tutto il lavoro è stato fatto con l'approvazione da The University of Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) ed è conforme a tutte le norme di comitato etico di ricerca umana. Le cellule umane sono considerate essere un materiale potenzialmente a rischio biologico, quindi seguire tutte le precauzioni speciali e accordo con le richieste dal proprio istituto. NSG topi sono gravemente immunocompromessi e suscettibile di malattia causata da batteri che si trovano comunemente nell'ambiente.
Utilizzare sempre rigorosa tecnica sterile durante la preparazione di materiali per l'impianto ed eseguire le iniezioni.

1. coltura cellulare

1. Stabilite linee cellulari umane NB (SH-SY5Y, SK-N-BE2 e IMR32) di crescere in terreno minimo essenziale, completati con 10% siero bovino fetale, la glutamina 2mm, 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Integrare le cellule IMR32 ulteriormente con 1 mM di piruvato e 0,075% NaHCO₃. Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO₂ e confluenza di 70-80%_.
2. Crescere le linee delle cellule ES umane (TC32, A673, Beyonce-25 e A4573) in medium RPMI supplementato con 10% siero bovino fetale e 6 mM L-glutammina. Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO₂ al 70-80% confluenza_.
3. Inviare tutte le linee cellulari per l'autenticazione.
   Nota: L'autenticazione delle cellule avviene presso una struttura esterna, consultare i riconoscimenti.

2. preparazione di cellule primarie del tumore paziente-derivato

1. Con il consenso del paziente e del parere conforme, vendemmia scartato tessuto di tumore umano NB da pazienti sottoposti a resezione chirurgica per controllo locale e il trasporto al laboratorio in soluzione di archiviazione di tessuto per la conservazione.
   Nota: Tutti i campioni dei pazienti sono de-identificati e gestiti conformemente agli orientamenti Institutional Review Board.
2. Generare una sospensione di cellule di cancro singolo paziente-derivato (UMNBL001, UMNBL002) dal tessuto del tumore usando un kit di dissociazione del tumore. Trasferire circa 0,5 g di tumore a una piastra di coltura delle cellule di mm 100 contenente 5 mL di tampone di RPMI, 200 µ l di enzima H, 100 µ l di enzima R e 25 µ l di enzima A dal kit di dissociazione umane del tumore.
3. Tritare il tumore in piccoli pezzi (2-4 mm) con delle forbici, pinze. Mescolare questi frammenti con le soluzioni al punto 2.2.
4. Pipettare la miscela del tumore in un tubo di dissociatore e chiudere il tubo. Capovolgere la provetta e attaccarsi a manicotto del dissociatore di tessuto. Eseguire il programma h_tumor_01.
5. Incubare la sospensione delle cellule del tumore ottenuta sopra a 37 ° C per 1 h su una griglia rotante con triturazione intermittente ogni 15 min.
6. Trasferire la sospensione cellulare per una nuova provetta conica 50 mL e aggiungere 10 mL di RPMI. Centrifugare la sospensione cellulare a 314 x g per 5 min.
7. Rimuovere il supernatante e sospendere il pellet in 5 mL di RPMI. Passare questa soluzione attraverso un colino di cella di 40 µm e raccogliere la soluzione tesa in un tubo conico di fresca 50 mL. Questo filtro una volta con 5 mL di terreno RPMI di lavare e centrifugare la miscela a 314 x g per 5 min raccogliere un pellet.
8. Misurare la densità delle cellule usando un emocitometro¹⁵. Sospendere il pellet ottenuto dall'alto in RPMI per ottenere una concentrazione finale di 4 × 10⁵ cellule/10 µ l. Prendere 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di matrigel a fare 10 µ l di soluzione di cella per ogni iniezione.
   Nota: Quantità di RPMI utilizzato dipende la misura di densità cellulare. Ad esempio, se la densità delle cellule misurata del pellet ottenuti è di 4 x 10⁵ celle, è possibile sospendere il pellet in 10 µ l di RPMI.

3. luciferase Tagging delle cellule tumorali

1. Fare 10 mL di media di trasduzione con 5 mL di surnatante virale EF1a-Luc2-IRES-mCherry e 5 mL di media delle cellule staminali. Aggiungere 7,5 µ l di 1x polybrene.
2. Mix 5 × 10⁶ cellule tumorali in media di trasduzione e piastra a piastra di attacco ultra-low di 100 mm. Incubare a 37 ° C e 5% CO₂ durante la notte.
   Nota: Come piastre di ancoraggio basso sono utilizzati, le cellule non aderirà alla piastra.
3. Dopo 24 h, portare il piatto di 100 mm contenenti cellule sotto cofano di coltura del tessuto e trasferire il composto in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 314 x g per 5 min ottenere il pellet cellulare. Lavare il pellet cellulare una volta con 1 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di HBSS contenente 1% siero bovino fetale (FBS).
   1. Ordinare celle luciferasi basate sul segnale di GFP-positive sulla fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS). Piastra le cellule ordinate il 100mm coltura di tessuti trattati piatto e mantengono la confluenza di 70-80%, 37 ° C e 5% CO₂ fino a quando richiesto.
4. Confermare la luciferasi segnale con kit di saggio di luciferasi. Piastra 10 x 10⁴ ordinati cellule per pozzetto in un illuminometer 96 compatibile piastra ed incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% CO₂. Dopo 24 h, portare la piastra ben 96 a temperatura ambiente e aggiungere il reagente Steady-Glo ai media coltivate in pozzi in rapporto 1:1. Consentire alle cellule di lisare per 5 min e leggere luminescenza in spettrofotometro.
5. Portare il piatto di 100 mm sotto una cappa di coltura del tessuto. Scartare i surnatante media. Lavare le cellule una volta con 2 mL di PBS 1X.
6. Aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% e riporre il piatto di 100 mm nell'incubatore per 2-3 min. Dopo 2-3 min, controllare per rimetterli cellule sotto il microscopio e aggiungere 8 mL di RPMI per disattivare tripsina.
7. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 314 x g per 5 min ottenere una pallina. Scartare il surnatante. Lavare il pellet cellulare con 1 mL di PBS 1X, sospendere il pellet in 5 mL di RPMI e determinare la densità delle cellule usando un emocitometro¹⁵. Centrifugare yhe restanti soluzione cella a 314 x g per 5 min ottenere una pallina.
8. Sospendere il pellet in RPMI per ottenere una concentrazione di 4 x 10⁵ cellule/10 µ l. Prendere 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di matrigel a fare 10 µ l di soluzione di cella per ogni iniezione.

4. ultrasuono guida della ghiandola surrenale (NB) o Sub renale capsula (ES) dell'impianto

Nota: Tutte le procedure di ultrasuoni vengono eseguite utilizzando un alta risoluzione in vivo imaging system. Per le procedure descritte, è stato usato il trasduttore, che ha una frequenza centrale di 40 MHz e una larghezza di banda di 22-55 MHz.

1. Utilizzare topi NSG immune-carenti di 6-8-settimana-vecchio per tutte le procedure di iniezione.
2. Chill il matrigel e autoclavati Siringhe Hamilton con ago 27G (1.25"), e cateteri 22G (diametro esterno 0,9 mm, 25 mm di lunghezza) durante la notte a 4 ° C.
3. Posto la soluzione di cella preparata nel passaggio 3 il ghiaccio.
4. Anestetizzare i topi in una camera di induzione utilizzando 2% isoflurano O₂ consegnato a 2 L/min.
   Nota: Un'anestesia adeguata è determinata con la mancanza di movimento attivo e il mantenimento della respirazione spontanea.
5. Una volta anestetizzato, depilare la schiena e il fianco degli animali utilizzando un rasoio e lozione per capelli rimozione (ad esempio Nair).
6. Trasferire l'animale alla piattaforma di imaging con addominali laterali verso il basso, dove il naso dell'animale è inserito in un musetto e protetta durante l'inspirazione isoflurano.
7. Posto unguento ottico negli occhi dell'animale per evitare l'essiccazione. Il mouse in luogo per impedire qualsiasi movimento involontario del nastro.
8. Identificare il fegato murino, vena cava, milza, rene sinistro e ghiandola surrenale sinistra adiacente utilizzando visualizzazione di ultrasuono.
9. Utilizzare guanti sterili, mascherina e cappuccio per la protezione personale e la manutenzione di condizioni di sterilità. Sotto guida ecografica, delicatamente inserire un catetere 22g attraverso la pelle e muscolo direttamente nella ghiandola surrenale sinistra per fornire un canale per iniezione cellulare. Rimuovere l'ago e lasciare il catetere in posizione.
10. Carico una siringa Hamilton refrigerata con un ago piccolo calibro con 10 µ l di soluzione di cella, quindi Guida la siringa stereotactically attraverso il catetere posizionato al centro della ghiandola surrenale.
11. Iniettare le cellule nel tessuto adrenale mirato. Lasciare l'ago in posizione per 1-2 min consentire il matrigel impostare. Rimuovere lentamente l'ago, seguita dalla rimozione del catetere.
12. Rimettere i topi nella loro gabbia e assicurarsi che il mouse riprende conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
    Nota: a causa della natura come minimo dilagante di questa tecnica, dolore post procedurale è minimo, ma ancora monitorati su base giornaliera con topi salute controlli. "deve essere seguita con una frase:"se inaspettati segni di dolore o angoscia sono si identificate nel corso di un esperimento, consultare con il vostro apparecchio istituzionale supporto veterinario per informazioni riguardanti l'analgesia o altre cure mediche.
    

Risultati

Utilizzando le procedure presentate, impianto ecoguidato di NB cellule nella ghiandola adrenale è stato fatto in una procedura dedicata sala attrezzata con un tavolo operatorio riscaldato. Rilievi di braccio e il piede sono stati disposti per monitoraggio attività del cuore murino (Figura 1A). L'animale è rimasto anestetizzato sotto utilizzando il cono di naso inalazione isoflurane. Usando una sonda di ultrasuono ad alta definizione, il rene di sinistra è...

Discussione

Ultrasuono-guida l'impianto delle cellule NB ed ES è un metodo efficace e sicuro per stabilire gli xenotrapianti murini affidabili per studi preclinici nella biologia del cancro. Fondamentale per il successo di ultrasuono-guida del tessuto-mirati l'impianto è la presenza e la disponibilità di personale qualificato con esperienza nella localizzazione anatomica dell'organo di interesse e nella iniezione stereotactic delle cellule del tumore.

La dissociazione del tessuto del tumore si è rivel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G