Metodo diagonale misura sinergia tra un qualsiasi numero di farmaci

Riepilogo

In questo protocollo, descriviamo come fare Loewe misurazioni di interazione del farmaco a base di additività per pairwise e combinazioni di farmaci a tre vie.

Abstract

Una combinazione sinergica di droga ha un'efficacia superiore rispetto agli effetti dei singoli farmaci. Saggi di scacchiera, dove i farmaci vengono combinati in molte dosi, consentono sensibile misura di interazioni farmacologiche. Tuttavia, queste analisi sono costose e non scala bene per misurare l'interazione tra i molti farmaci. Parecchi studi recenti hanno segnalato misurazioni di interazione di droga utilizzando un campionamento diagonale del dosaggio tradizionale scacchiera. Questa metodologia alternativa notevolmente riduce il costo degli esperimenti di interazione della droga e permette la misura di interazione per le combinazioni con molti farmaci. Qui, descriviamo un protocollo per misurare le tre interazioni coppie e un tre vie interazione tra tre antibiotici in duplice copia, in cinque giorni, usando solo tre a 96 pozzetti e normale attrezzatura da laboratorio. Presentiamo i risultati rappresentativi dimostrano che la combinazione di tre-antibiotico di levofloxacina + acido nalidixico + penicillina G è sinergica. Il nostro protocollo di scale per misurare le interazioni tra i molti farmaci e in altri contesti biologici, permettendo per schermi efficienti per le sinergie della multi-droga contro agenti patogeni e tumori.

Introduzione

Combinazioni di farmaci possono presentare effetto sorprendentemente alta o bassa su un fenotipo dato gli effetti dei farmaci costituenti, corrispondente alle interazioni della droga sinergici o antagonistici, rispettivamente^1,2,3. L'uso di combinazioni sinergiche può permettere dose-escalation per aumento di efficacia e riduzione della dose per effetto collaterale di rilievo. Trattamenti di combinazione possono anche applicare più battute d'arresto al macchinario cellulare, bloccando così il potenziale evolutivo fuggire meccanismi di resistenza⁴. Di conseguenza, combinazioni di tre o più farmaci sono abitualmente utilizzati in agente patogeno o cancro trattamento⁵.

Sinergia e antagonismo sono definiti da un confronto tra l'effetto osservato di una combinazione contro un effetto previsto dato diversi effetti della droga. Tra i modelli per le interazioni di droga, additività di Loewe è la più severa e ha un modello ben definito null (Figura 1)⁶, e l'interazione di sinergia/antagonismo dedotto è indipendente dalla concentrazione di farmaco utilizzata ^{6 , 7}. Tuttavia, il modello di Loewe è sperimentalmente costoso anche per un test pairwise interazione. Analisi di interazione farmaco tradizionalmente costituiscono una matrice 2D di combinazioni di farmaci concentrazione (un saggio della scacchiera) (Figura 2). 5 dosi sono utilizzate per ogni farmaco, se 25 combinazioni sono necessari, corrispondente ad una metà di una micropiastra se gli esperimenti vengono condotti in replica. Il costo di questo approccio vieta misura sinergia dal modello di additività di Loewe per combinazioni di multi-farmaci (Figura 3). Ad esempio, per testare un'interazione di 10 vie, metodi tradizionali richiederebbe più di 100 mila micropiastre, blocco misura sperimentale delle sinergie di alto ordine dal modello di additività Loewe rigoroso, ben teorizzato e indipendente dalla concentrazione ⁸.

Gli attuali trattamenti clinici utilizzano solo una frazione di combinazioni di farmaci possibili. Ad esempio, il trattamento standard della tubercolosi attiva è una combinazione di tre antibiotici. Ci sono circa 20 antibiotici usati nel trattamento di Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Ci sono combinazioni di 3 vie possibili 1140 tra 20 farmaci, ciascuno con la possibilità di avere una forte sinergia contro Mtb. Poiché non c'è nessun metodo economico per misurare le interazioni farmacologiche tra molti farmaci, combinazioni sinergiche potenzialmente salva-vita rimangono non testati.

Qui, descriviamo un protocollo semplice per misurare le interazioni farmacologiche pairwise e tre vie campionando soltanto la diagonale di un dosaggio di scacchiera (nella figura 4 e Figura 5). Il concetto sottostante di campionamento la diagonale di un esperimento della scacchiera è stato teorizzato da Berenbaum nel suo lavoro seminale in 1978⁹. Eppure, questo approccio è stato applicato solo recentemente al farmaco sinergia schermi^10,11,12. Vi presentiamo il nostro protocollo con Escherichia coli (e. coli) ed il fenotipo di crescita. Tuttavia, notiamo che il protocollo è indipendente dalla specie biologiche e il fenotipo di interesse e quindi può essere applicato per la misurazione della sinergia di alto ordine droga in altri contesti biologici.

Protocollo

Nota: Qualsiasi piccola molecola che inibisce la crescita di batteri e. coli può essere utilizzato per il metodo diagonale. In questo protocollo, levofloxacina (LEV), acido nalidixico (NAL) e penicillina G (PNG) verrà utilizzato come esempio, dal momento che questi farmaci mostrano una sinergia di tre vie saliente. Il flusso di lavoro del presente protocollo è indicato come nella figura 6. Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente. Utilizzare fresche aliquote di batteri e farmaci ogni giorno. Eseguire l'esperimento sotto livelli di biosicurezza adeguati per e. coli.

1. procedura di preparazione

1. Preparare il supporto di Luria-Bertani (LB) con l'aggiunta di 25 g di brodo LB a 1 L di acqua distillata e miscelare. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min e archivio media in autoclave a temperatura ambiente.
2. Preparare scorte di glicerolo di e. coli mescolando volumi uguali di glicerolo sterile 50% e cellule batteriche diluite a OD₆₀₀ = 1 in libbra di brodo e congelare 150 aliquote µ l in microcentrifuga da 1,5 mL a-80 ° C.
3. Sciogliere 20 mg di antibiotici, LEV, NAL e PNG in 1 mL di solfossido dimetilico (DMSO) ciascuna. 10 µ l di soluzione LEV di miscelazione con 990 µ l di DMSO, diluire LEV soluzione 100x a 0,2 µ g/mL. Utilizzare LEV 0,2 mg/mL e 20 mg/mL NAL e PNG nei passaggi procedere.
4. Aliquotare 50 µ l di ciascun antibiotico per provette per microcentrifuga da 1,5 mL e congelare a-20 ° C.
5. Aliquota di prendere uno 150 µ l di e. coli da-80 ° C. Disgelo.
6. Aggiungere 100 µ l di brodo di glicerolo di e. coli in 5 mL di LB media in un tubo di cultura 14 mL.
7. Agitare le provette in un incubatore a 37 ° C durante la notte a 200 giri/min.

2. esperimento di Dose-Risposta di diluizione seriale

1. Prendere un'aliquota delle droghe LEV, NAL e PNG da-20 ° C, lasciarli a temperatura ambiente per 10 min scongelare e preparare diluizioni seriali di questi farmaci.
2. Preparare 1100 µ l di sol LB - 10% mescolando 990 µ l di LB media e 110 µ l di solvente (DMSO).
3. Preparare 500 µ l di LB - 10% LEV mescolando 450 µ l di LB media e 50 µ l di LEV.
4. Vortice LB - 10% sol per 5 s l'impostazione massima. Aggiungere 20 µ l di sol LB - 10% per le prime quattro righe di pozzi in una micropiastra a 96 pozzetti.
5. Vortice LEV LB - 10% per 5 s l'impostazione massima. Aggiungere 20 µ l di LEV LB - 10% per il primo pozzo nella riga A.
6. Preparare diluizioni seriali per LEV LB - 10% con 20 µ l dal primo bene, aggiungendo all'interno della seconda pipettaggio su e giù per cinque volte. Ripetere questa operazione per tutti i pozzetti in sequenza fino a 11 ben, che finisce con 40 µ l (figura 7A).
7. Rimuovere e scartare 20 µ l del contenuto dall'11 Beh, utilizzando una micropipetta.
8. Ripetere i passaggi da 2.3-2.7 per le droghe NAL e PNG con la seconda e terza fila della micropiastra, rispettivamente.
9. Ripetere i passaggi 2.3-2.7 per la droga LEV nuovamente sulla quarta riga come controllo positivo interno.
10. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare il OD₆₀₀ di un 01:10 diluizione della cultura (passi 1.5-1.7).
11. Diluire le cellule in 5 mL di LB media per un OD₆₀₀ di 0,01. Versare in un flacone.
12. Utilizzando una micropipetta multicanale, aggiungere 80 µ l delle cellule diluite per le diluizioni seriali di droga preparate al punto 2.4-2.9. Le concentrazioni di farmaco finale in ciascun pozzetto è mostrato nella figura 7A. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione.
13. Incubare la piastra per 16 h a 37 ° C.
14. Iniziare una nuova coltura batterica da utilizzare nel passaggio 3 (ripetere passaggi 1.5-1.7).

3. esperimento di diluizione lineare Dose-risposta

1. Misurare l'assorbanza di₆₀₀ OD per piastra di dose-risposta di diluizione seriale dal passaggio 2 utilizzando un lettore di piastra (figura 7A giusto) e interpretare i risultati in base alla seguente procedura.
2. Normalizzare la crescita dividendo la crescita in tutti i pozzetti con la crescita di nessun controllo di droga per ogni riga e calcolare la crescita percentuale normalizzando OD₆₀₀a nessuna condizione di droga.
3. Per ogni farmaco, individuare i pozzi che hanno l'inibizione della crescita ~ 50% (IC50), indicato in arancione nella figura 7A giusto. Assegnare la concentrazione in questi pozzetti "seriale IC50" per ogni farmaco.
4. Disgelare aliquote di droga fresca, preparare 1 mL di sol LB - 10% con LB media e solvente (DMSO) in un rapporto 9:1 e LB - 10% droga mescolando LB media e droga in un rapporto di 9:1, dove la concentrazione del farmaco è 100 x di IC50 seriale di ogni farmaco prima di aggiungere il supporto LB , come indicato al punto 3.3.
5. Preparare linearmente crescente dosi di farmaci LEV, NAL e PNG in 11 concentrazioni, con droga LB - 10% e sol LB - 10% a volumi indicati in figura 7B.
6. Preparare le dosi linearmente crescente di LEV sulla quarta riga come controllo positivo interno.
7. Misurare il OD₆₀₀ del 01:10 diluizione della cultura avviato nel passaggio 2.14.
8. Diluire le cellule in 5 mL di LB media per un OD₆₀₀ di 0,01. Versare in un flacone.
9. Aggiungere 80 µ l delle cellule diluite per le diluizioni lineare droga preparate al punto 3.6 utilizzando una micropipetta multicanale. Le concentrazioni di farmaco finale in ciascun pozzetto è mostrato in figura 7B.
   Nota: La metà bene in dose-risposta riceverà il IC50 seriale per questo farmaco. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione.
10. Incubare la piastra per 16 h a 37 ° C.
11. Avviare due colture batteriche fresche da utilizzare nel passaggio 4 (ripetere passaggi 1.5-1.7).

4. esperimento di interazione di droga diagonale

1. Misurare l'assorbanza di₆₀₀ OD per diluizione lineare dose-risposta dal passaggio 3 (figura 7B).
2. Per ogni farmaco, scegliere la concentrazione che ha provocato il IC50 e preparare droga LEV, NAL e PNG in 100 x IC50 concentrazioni.
3. Scongelare i farmaci freschi, preparare 100 x IC50 per ogni droga e preparare miscele di droga 1:1 in volume di LEV + NAL, LEV + PNG e NAL + PNG e 1: miscela di droga 1:1 in volume di LEV + NAL + PNG.
4. Preparare due piastre per esperimenti di interazione della droga come mostrato in Figura 8.
5. Misurare il OD₆₀₀ del 01:10 diluizione delle culture iniziato nel passaggio 3.11.
6. Preparare OD₆₀₀ = 0,01 diluizioni di due culture in due 10 mL di LB media.
7. Aggiungere 80 µ l delle cellule dalla cultura 1 e 2 su piastre 1 e 2, rispettivamente. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione. Incubare le piastre per 16 h a 37 ° C.

5. diagonale droga interazione Spartiti

1. Misurare l'assorbanza di₆₀₀ OD interazione farmacologica diagonale sperimentare piatti dal passaggio 4.
2. Normalizzare la crescita dividendo la crescita in tutti i pozzetti con la crescita senza controllo droga bene per ogni riga.
3. Per ogni riga, individuare la colonna che è più vicina alla IC50, mostrati in arancione nella Figura 8 giusto l'inibizione della crescita. Assegnare IC50 basato sulla concentrazione relativa di droga in questo pozzo.
4. Per LEV + NAL, LEV + PNG e NAL + PNG e LEV + NAL + PNG di dose-risposta, è necessario calcolare IC50 previsto calcolando il IC50 dei singoli farmaci in ogni combinazione. Si noti che in media è una semplice approssimazione per il calcolo esatto di IC50 previsto come descritto prima delle¹².
5. Calcolare punteggi concentrazione inibitoria frazionario (FIC) dividendo il IC50 osservati dal IC50 previsto in ogni combinazione.

Risultati

Precedentemente, abbiamo segnalato il pairwise interazioni tra i tre farmaci: LEV, NAL e PNG basata su test nelle analisi miniaturizzati scacchiera, dove i due farmaci sono stati combinati in una matrice 4 x 4^13,14. Mentre NAL e LEV erano sinergici, PNG è stato segnalato per essere antagonistico con sia LEV e NAL^13,14. Qui, abbiamo verificato queste interazioni pairwise e misurata l'interazione di tre vie tra questi tre farmaci usando un'analisi di diagonale. I nostri risultati dimostrano che LEV + NAL + PNG è una combinazione sinergica di antibiotica 3 vie. Rappresentazioni schematiche per i risultati delle sezioni individuali procedura sperimentale sono stati dati sul lato destro della Figura 7 e Figura 8. Qui, presentiamo e interpretare risultati rappresentativi crudi da tre letture di piastra, che sono riportati nella Figura 9. La lettura della piastra superiore corrisponde alla diluizione seriale e lineare esperimenti condotti nei passaggi 2 e 3. Le letture di piastra inferiore due sono piastre duplicate interazione condotti nel passaggio 4.

I dati grezzi in Figura 9 dimostra che crescita superiore è intorno a 0,55, ma c'è una densità ottica 0.05 del supporto stesso, come osservato nel OD₆₀₀ delle concentrazioni di farmaco alta dove non c'è nessuna crescita. Di conseguenza, definiamo IC50 come (0.55-0.05)/2 = 0,25. Per ogni dose-risposta, i pozzi che si trova più vicino a questo valore vengono visualizzati con l'arancio.

La metà superiore della Figura 9A Mostra i risultati del passaggio 2, esperimento seriale dose-risposta. I pozzetti di IC50 per LEV è alle repliche di 10 in due colonne, che corrispondono a 4 ng/mL. Il IC50 per NAL e PNG sono a 3 µ g/mL e 25 µ g/mL, rispettivamente. Queste concentrazioni corrispondono alla concentrazione di 1 x mostrato in figura 7B. La metà inferiore della figura 9B Mostra i risultati dal passaggio 3, esperimenti di dose-risposta lineare. LEV, NAL e IC50 di PNG si trovano a 0,4 x, x 0,8 e 1,2 x, rispettivamente. Queste concentrazioni sono assegnate come 1 X IC50 per il passaggio 4.

Due piastre corrispondenti a replicare due esperimenti sono mostrati in figura 9B, dove il IC50 pozzi sono mostrati con l'arancio. In piastra 1, tutte le singole droghe hanno loro IC50 alla concentrazione di 1 x. Il IC50 previsto per la combinazione di coppie o a tre vie viene calcolata la media aritmetica delle droghe costituente, rendendo previsto IC50 per concentrazione di 1x anche tutte le combinazioni. In lamiera di 2 LEV e PNG hanno loro IC50 alla concentrazione di 1 x, ma NAL IC50 è a 1.2 x. Il IC50 previsto per ogni combinazione è definita utilizzando la media aritmetica di questi valori di IC50. Ad esempio, il IC50 previsto per LEV + NAL e NAL + PNG è 1.1 x. L'interazione della droga Punteggio (FIC) per ogni combinazione è calcolato dividendo osservato IC50 con IC50 previsto, come mostrato sul lato destro delle piastre. Ispezione dei punteggi delle due piastre FIC dimostra che LEV + NAL e LEV + NAL + PNG sono sinergici, mentre LEV + PNG e NAL + PNG sono antagonisti. FIC punteggi ottenuti nelle due piastre sono d'accordo, sostenendo l'affidabilità del protocollo.

Figura 1: Null definizione modello per modello di interazione di Loewe additività droga. Due 5x5 matrici su una micropiastra, dove droga A è aumentato linearmente in un asse come mostrato a sinistra, e una concentrazione superiore di droga inibisce un fenotipo quantificabile (in alto a destra). L'aggiunta di queste matrici è indicata nel mezzo, dove le linee che collegano equipotenti droga un concentrazioni in ogni singola droga hanno la stessa concentrazione come farmaco A. Quando le cellule vengono aggiunti su questa «scacchiera» concentrazione di combinazioni di farmaci, si prevede che il fenotipo registrato su questa linea sarà equivalente per i pozzi che si connette. In questo esperimento di interazione di droga self-self, il isobole raffigurante un fenotipo (indicato con una linea verde tratteggiata) dovrebbe essere lineare, definizione del modello di additività null. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: interazioni farmacologiche Pairwise secondo il modello di interazione di Loewe additività droga. Quando due farmaci sono combinati in un'analisi della scacchiera come in Figura 1, il contorno di isophenotypic osservato può essere diritta, convesso o concavo. A destra, isophenotypic possibili contorni (linee tratteggiate verdi) si sovrappongono sulla scacchiera saggi. Combinazioni di farmaci con dritto isophenotypic contorni sono Loewe-additivi, come i contorni non sono diversi da un'interazione della droga di auto-self, ovvero Loewe-additivo per definizione. Quando il contorno di isophenotypic è significativamente concavo o convesso, la combinazione è sinergico o antagonistico, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: interazioni farmacologiche tre vie secondo il modello di interazione di Loewe additività droga. Simile al dosaggio della scacchiera per interazioni pairwise, tre-farmaci vengono combinati in una griglia 3D (un "checkercube"), dove ogni droga è aumentato linearmente in un asse. Se i tre farmaci erano identici, la superficie di isophenotypic dovrebbe essere piatto, definendo l'additività per tre combinazioni di farmaci. Se la superficie è più concavo o convesso rispetto a questo modello null Loewe-additivo, combinazioni di farmaci sono sinergici o antagonistici, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: metodo diagonale per misurare interazioni farmacologiche pairwise. Per ogni dosaggio della scacchiera, si misurano solo le regioni mostrate in rettangoli rosso magenta. i e ii linearmente stiamo aumentando le concentrazioni di farmaco singolo. III è valutata facendo una miscela 1:1 dei due farmaci e linearmente titolazione questa miscela come se fosse una singola droga. La FIC è uguale all'IC50 osservati nella combinazione divisa per il IC50 previsto di due singoli farmaci. Per il modello di additività di Loewe, il IC50 previsto è approssimata dal IC50 medio dei due singoli farmaci. Un valore FIC è 1 per le coppie di Loewe-additivo ed è inferiore o superiore a 1 per coppie sinergiche o antagonistiche, rispettivamente^2,12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: metodo diagonale per misurare le interazioni farmacologiche di tre vie. Per ogni dosaggio checkercube, solo le regioni indicate sono misurate. i, ii e iii linearmente stiamo aumentando le concentrazioni di farmaco singolo. IV viene misurata facendo un 1:1:1 miscela di tre farmaci e linearmente titolazione questa miscela come se si trattasse di una singola droga. La concentrazione inibitoria frazionario è uguale all'osservato IC₅₀ nella combinazione divisa per la IC50 previsto dato tre singoli farmaci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: flusso di lavoro per il protocollo metodo diagonale descritto nel presente documento e i dettagli di installazione per ogni micropiastra. La piastra mostrata nel giorno 4 è condotta in duplicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: esperimenti di dose-risposta di diluizione seriale e lineari. (A) preparazione della diluizione seriale dose-risposta per una droga e le corrispondenti concentrazioni di farmaco finale. Cellule di e. coli vengono aggiunti alla piastra; crescita è registrato dopo 16 h. seriale IC50, arancione, è selezionato per ogni droga per uso nel giorno seguente di lineare esperimenti di dose-risposta di diluizione. (B) preparazione della diluizione lineare dose-risposta per una droga e le corrispondenti concentrazioni di farmaco finale. Cellule di e. coli vengono aggiunti alla piastra; crescita è registrato dopo le 16h. Per ogni farmaco, il IC50s selezionati che verrà utilizzato nel giorno seguente droga interazione esperimenti sono mostrati in arancione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: esperimenti di interazione della droga. Preparazione di esperimenti di interazione è simile a singola droga lineare dose-risposte, tranne che un 1:1 o 1:1:1 miscela di farmaci viene utilizzato per due o tre farmaco dose-risposta, rispettivamente. Osservato IC50s per ogni dose-risposta, raffigurato in arancione, vengono utilizzati per calcolare i punteggi FIC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: rappresentante sperimentare risultati. Risultati rappresentativi ottenuti utilizzando il protocollo descritto vengono visualizzati, con dettagli forniti nel testo principale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'uso di combinazioni di farmaci contro gli agenti patogeni o i tumori è una prospettiva allettante, soprattutto nelle circostanze della pipeline antibiotica essiccazione. Tuttavia, questo potenziale è ostacolato da almeno due difficoltà. La prima difficoltà è il numero astronomico di possibili combinazioni. Ci sono, ad esempio, 4950 combinazioni possibili coppie tra 100 antibiotici. Tutte le possibili combinazioni tra 100 antibiotici (2¹⁰⁰) è dello stesso ordine di grandezza con il numero di batteri sulla terra (~ 10³⁰). Come predire combinazioni fortemente sinergiche tra queste possibilità è stata oggetto di numerosi studi computazionali. La seconda difficoltà è la misurazione delle interazioni farmacologiche di alto ordine. Considera che una piattaforma computazionale può suggerire che una certa combinazione di 10-droga è fortemente sinergica contro un certo agente patogeno. Metodi tradizionali per testare le interazioni farmacologiche è troppo costoso per verificare o smentire questa ipotesi, pertanto lo studio della sinergia tra molti farmaci è stato fuori dai confini della ricerca scientifica. Il metodo diagonale, che è stato inizialmente proposto quasi 30 anni fa ed è stato utilizzato in alcune schermate di sinergia recenti forniscono una solida base per il primo problema, consentendo l'analisi dell'interazione tra molte coppie. Risolve il secondo problema di un campionamento informativo delle analisi tradizionali e consente lo studio delle interazioni farmacologiche di alto ordine.

D'importanza, notiamo che il nostro protocollo utilizza un dosaggio lineare per misurazioni di interazione della droga, per fornire la sensibilità per la rilevazione anche interazioni deboli. Stabilire l'intervallo di concentrazione giusta per dosaggio lineare è un compito impegnativo. Eseguendo prima una diluizione seriale, facciamo una decisione informata circa lo spazio di ricerca per il dosaggio lineare. Tuttavia, il protocollo può essere modificato per utilizzare 2 volte o più diluizioni seriali per interazione test antidroga. Tale modifica sarebbe ridurre il tempo di esperimento e consentire la sperimentazione di più interazioni; Tuttavia, avrebbe sensibilità per rilevare interazioni solo fortemente sinergiche o antagonistiche.

Il protocollo che abbiamo descritto Mostra la misurazione delle interazioni di coppie o a tre vie. Un aspetto critico del protocollo è che singoli agenti sono nello stesso piatto come la combinazione, per minimizzare la distorsione a causa di variazioni di piastra. Di conseguenza, il protocollo può essere regolato per misurare le interazioni fino a 7 vie combinazioni di semplici modifiche. Combinazioni di più di 7 farmaci richiederà più di una micropiastra da 96 pozzetti e considerazioni aggiuntive devono essere prese per garantire l'integrazione di dati corretti, come replica inter-supporto.

Una notevole limitazione del metodo diagonale è la limitazione che ogni droga nel dosaggio deve inibire il fenotipo di interesse. Di conseguenza, il metodo diagonale non è utile per comprendere le interazioni tra agenti attivi e inerti coadiuvanti. Tali interazioni 'potenziamento' potrebbero essere studiati sotto modelli alternativi come modelli Bliss o più alto singolo agente.

Una considerazione importante per l'analisi di interazioni farmacologiche di ordine superiore è la scelta del modello null per il "IC50 previsto." Quando si combinano due farmaci, effetto di combinazione può essere paragonato solo agli effetti singola droga. Quando tre farmaci vengono combinati, effetto di combinazione può essere paragonato agli effetti singoli o coppie effetti. Ad esempio, se pairwise tutte le combinazioni di tre farmaci sono sinergiche, quindi si può supporre che queste droghe mostrerà una sinergia di tre vie. Deviazione di un'interazione tre vie da cosa ci si aspetta da interazioni pairwise è stato recentemente ribattezzato "interazione emergente"^16,17. Per semplicità, il nostro protocollo descrive la misura di triplice combinazione "netto l'interazione," che definisce il modello null come effetti dei singoli farmaci. Tuttavia, i dati ottenuti dal protocollo possono anche essere utilizzati per calcolare l'interazione emergente della combinazione di tre vie. Nella nostra analisi, abbiamo definito il IC50 previsto della combinazione tre vie come la media del singolo farmaco IC50s. In alternativa, il IC50 previsto può essere definita come la media di IC50s di combinazioni pairwise (~1.1-1.2). Quando il IC50 osservata è divisa da questa alternativa IC50 previsto, la FIC ottenute fornisce la FIC emergente per la combinazione di tre vie, come descritto in precedenza¹². Questa considerazione rivela che LEV + NAL + PNG è più sinergica rispetto a quanto ci si aspetterebbe dalle interazioni pairwise tra tre farmaci, dimostrante che LEV + NAL + PNG ha sinergia emergente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Semi Micro Cuvette	VWR	97000-586
1.5 mL  Eppendorf Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	4036-3204
1000 µL Tips	Geneseesci	24830
14 mL Breathable Cell Culture Tube	VWR	60819-761
20 µL Tips	Geneseesci	24804
200 µL Tips	Geneseesci	24815
37 °C Incubator	Panasonic	MIR-262-PA
37 °C Shaker Incubator	Thermo Scientific	SHKE8000
5 mL Cell Culture Serological Pipette	VWR	53300-421
96-well Microplates	VWR	15705-066
Breathable Sealing Film	USA Scientific	2920-0010
DMSO	Sigma	41647
Escherichia coli	ATCC	700926
Glycerol	Sigma	G9012
LB Broth Powder	RPI	L24065
Levofloxacin	Sigma	28266
Micropipette	GILSON	PIPETMAN Classic
Microplate reader	BioTek	Synergy H1
Multichannel micropipette	VistaLab	1060
Nalidixic acid	Sigma	N8878
Penicillin G	Sigma	P3032
Pipette Pump	Drummond	4-000-501
Reagent Reservoir	VWR	89094-658
Spectrophotometer	BIO-RAD	1702525
Vortex Mixer	Fisher Scientific	10-320-807