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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici isolati dal tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Questo protocollo prevede preparazione flash-congelati campioni di tessuto intestinale umano, cryosectioning, colorazione etanolica e disidratazione, LCM e l'estrazione di RNA.

Abstract

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici raccolti da tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Abbiamo identificato cinque passaggi del flusso di lavoro che sono cruciali per l'ottenimento di RNA isolati dai gangli enterici con sufficientemente alta qualità e quantità per RNA-seq. In primo luogo, quando si prepara il tessuto intestinale, ogni campione deve avere tutto il liquido in eccesso rimosso dal macchiare prima della spianatura serosa quanto possibile nella parte inferiore della grande stampi base. I campioni allora rapidamente sono congelati in cima a una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano. In secondo luogo, durante il taglio del tessuto, è importante posizionare cryomolds modo che sezioni intestinali in parallelo il piano completo del plesso mioenterico, producendo quindi il maggiore della superficie dei gangli enterici per ogni diapositiva. Terzo, durante LCM, polietilene napthalate (PEN)-diapositive di membrana offrono la massima velocità e flessibilità nel delineare le forme non uniforme dei gangli enterici durante la raccolta dei gangli enterici. In quarto luogo, per la visualizzazione distinte dei gangli enterici all'interno delle sezioni, etanolo compatibile con coloranti, come la viola di Cresyl, offrono ottima conservazione dell'integrità di RNA rispetto acquose coloranti. Infine, per l'estrazione di RNA da gangli catturati, abbiamo osservato le differenze tra kit commerciali di estrazione RNA che restituito superior RNA quantità e qualità, eliminando la contaminazione del DNA. Ottimizzazione di questi fattori nel protocollo corrente notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni di gangli enterici con eccezionale qualità di RNA e la quantità.

Introduzione

Questo metodo è progettato per ottenere campioni di RNA di alta qualità dei gangli enterici da tessuto intestinale umano mediante microdissezione laser (LCM). Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per fornire sufficiente qualità di RNA e rendimenti per RNA (RNA-seq) di sequenziamento ed è destinato a essere utilizzato con tessuto intestinale umano appena resecato, slegato, flash-congelato.

Disturbi funzionali della motilità gastrointestinale dell'intestino ed interessano uno su quattro persone negli Stati Uniti. Il sistema nervoso enterico (ENS), noto anche come il secondo cervello1, è spesso al centro di questi disordini, che svolge un ruolo fondamentale nell'omeostasi dell'intestino e motilità. Manipolazione della motilità intestinale è stato generalmente limitato a resezione chirurgica del tessuto aganglionic/noncontractile, modifica dietetica cronica e/o farmaci. Sorprendentemente, il trascrittoma completo del ENS adulto rimane essere sequenziato, limitando notevolmente la nostra capacità di identificare le molecole all'interno l'ENS che possono essere mirati farmacologicamente o utilizzate nelle terapie con cellule staminali.

Ci sono relativamente pochi metodi per l'isolamento di RNA dai gangli enterici umani. Il primo approccio, cella dissociazione2, richiede temperature di incubazione elevate e tempi di incubazione lungo; sia di cui sono noti per promuovere la degradazione del RNA e alterare il trascrittoma2,3. Un approccio alternativo, LCM, più attendibilmente conserva il trascrittoma e protegge l'integrità del RNA. Anche se parecchi studi hanno utilizzato LCM per raccogliere dei gangli da tessuto intestinale umano fresco congelato4,5,6, questi approcci erano sia ostacolata dalla scarsa qualità di RNA e la quantità, erano abbastanza laboriosi, o necessaria modifica di colorazione o di tecniche di estrazione di RNA a lavorare nelle nostre mani. Altri protocolli di LCM progettati per la conservazione del RNA che sono stati trovati nel prodotto di LCM manuali forniti ulteriori miglioramenti7,8, ma l'adattamento è stato necessario quando applicato all'isolamento di gangli enterici8, 9. per queste ragioni, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato basato su queste risorse che produce notevoli quantità di RNA ad alta integrità dai gangli enterici umani, ha un flusso di lavoro relativamente veloce e produce risultati coerenti attraverso un grande numero di campioni.

In questo studio, presentiamo una sintesi delle procedure ottimizzate che facilitano l'isolamento di RNA ad alta integrità dai gangli enterici provenienti da tessuto intestinale umano resecato. Il nostro metodo incorpora cinque aspetti importanti. Primi, appena resecato, unfixed campioni intestinali umani devono essere tagliati a misura, hanno tutta l'umidità in eccesso rimossi con un tessuto di laboratorio e appiattito in un grande stampo base prima del flash-congelamento in cima ad una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano (2 MB). Seconda sezioni istologiche dell'intestino dovrebbero essere preparate per ottenere il piano completo del plesso myenteric in una diapositiva, che offre un payload di grandi dimensioni dei gangli enterici. Successo con questo passaggio dipende in larga misura il processo di preparazione del tessuto. In terzo luogo, la struttura non uniforme dei gangli in ENS richiede l'utilizzo di polietilene napthalate (PEN) membrana diapositive6, che offrono la massima velocità e precisione durante il processo di LCM. Coloranti quarto, etanolo-compatibile, ad esempio Cresyl Violet, dovrebbero essere utilizzati per preservare l'integrità di RNA durante la macchiatura dei gangli enterici. Infine, il processo di estrazione di RNA è fondamentale per un risultato di successo con RNA-seq. Abbiamo cercato un approccio di estrazione di RNA che produce alta integrità di RNA, massimizza RNA rendimenti quando si inizia con piccole collezioni di gangli enterici, Elimina la contaminazione di DNA e conserva specie di RNA come molti come possibile.

Presi insieme, ottimizzazione di questi fattori nel presente studio notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni dei gangli enterici con eccezionale quantità di RNA e di qualità. Risultati sono stati in gran parte coerenti tra un considerevole gruppo di campioni, che indica la consistenza di questo approccio. Inoltre, abbiamo usato questi approcci per sequenziato decine di campioni di RNA dai gangli enterici. Le strategie evidenziate qui possono anche essere ampiamente adattate per l'esecuzione di LCM di gangli desiderati o i nuclei dell'unità periferica e del sistema nervoso centrale e altri casi che richiedono l'isolamento di RNA di alta qualità.

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Protocollo

Tutti i protocolli descritti qui sono stati approvati dalla Vanderbilt University istituzionale Review Board (IRB).

1. preparazione prima dell'arrivo del tessuto

  1. Ottenere l'approvazione IRB corretto e coordinare con agenzie di donazione di organi umani per ottenere tessuto intestinale appena resecato, slegato da donatori che soddisfano tutti i criteri di ricerca necessari per lo studio.
    Nota: Questo protocollo può essere adattato per l'uso con topi e altri modelli del roditore.
    1. Immediatamente dopo la resezione di ogni segmento intestinale, accuratamente lavare il lume con PBS refrigerati o tessuto-memorizzazione per rimuovere materiale residuo luminal o feci.
    2. Dopo vampate di calore e scartando i rifiuti in un contenitore per rifiuti biologici appropriati, immergere il tessuto in un volume sufficiente di tessuto-memorizzazione (ad esempio 3 - 5 volte il volume del tessuto intestinale) e conservare in plastica etichettati individualmente, a tenuta stagna contenitori, sommersa nel ghiaccio o refrigerato fino all'utilizzo).
    3. Processo il tessuto all'interno 18-26 ore dal momento della raccolta per evitare la degradazione del RNA notevole.
      Nota: A seconda la pulizia del segmento intestinale e deposito, può essere possibile estendere il nostro limite di tempo suggerito.
  2. Preparare tutti i materiali necessari per la raccolta di tessuto umano in anticipo, come indicato nel presente protocollo (fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni più dettagliate). Verificare che tutti i necessari dispositivi di protezione individuale sono indossato in ogni momento.
  3. Preparare, benne di ghiaccio secco con una miscela di ghiaccio secco come mostrato in Figura 1.
    1. Schiacciare abbastanza ghiaccio secco per riempire 4 secchielli circolari standard e uno rettangolare secchiello del ghiaccio. Uno dei secchi standard dovrebbe avere laboratorio di piccole dimensioni (11 x 21 cm) tessuti collocato sulla superficie del ghiaccio secco. Se possibile, utilizzare le caselle di nuove, non aperte dei tessuti di laboratorio.
    2. Fare un impasto di ghiaccio secco da powderizing 2L di ghiaccio secco in un secchio di ghiaccio pulito rettangolare.
    3. Aggiungere 2 MB pre-refrigerati fino alla superficie del ghiaccio secco. Leggermente, mescolare e appiattire l'impasto usando una pipetta punta casella cover a forma di superficie del liquame in un canale circondato da grandi pezzi di ghiaccio secco lungo i lati del secchio rettangolare.
    4. Posizionare vari blocchi sottili di ghiaccio secco lungo i bordi del secchio ghiaccio per incoraggiare più rapido congelamento. Ci dovrebbe essere spazio per ≥ 4 stampi base andare bene scioltamente il secchio di liquami di ghiaccio secco in un dato momento.
      1. Facoltativamente, dello stack il secchiello del ghiaccio all'interno di un altro secchio di ghiaccio rettangolare riempita ¼ con ghiaccio secco. Questo posizionamento consente di isolare meglio i residui di ghiaccio secco e previene la necessità di frequenti aggiustamenti di ghiaccio secco e 2 MB durante la procedura.
    5. Posizionare i secchi di ghiaccio secco in una catena di montaggio nel seguente ordine: 1) ghiaccio secco liquami benna, benna di ghiaccio del tessuto-dry 2) laboratorio, 3 & 4) normale secche secchi di ghiaccio, secchio di ghiaccio secco 5) rettangolare (Figura 1A).

2. preparazione del tessuto intestinale umano congelato Flash

Nota: L'intero processo può richiedere tra 45-80 min ogni segmento intestinale, a seconda della qualità del tessuto intestinale. Si consiglia inoltre di raccolta dei campioni di controllo di qualità per valutare la qualità di RNA e l'istologia prima di procedere con LCM.

  1. Riempire un grande vassoio con ghiaccio bagnato e bordi di taglio chirurgico in cima il ghiaccio secco.
  2. In questa configurazione, chill un becher 500 mL e 100 mL per la conservazione del tessuto e segmenti tagliati nella soluzione di conservazione frigorifera. Base pre-raffreddamento stampi sui taglieri affinché siano pronti a ricevere il tessuto.
  3. Dopo aver ricevuto fresco tessuto intestinale, versare i media in cui il tessuto è trasportato e conservarlo in bicchieri pre-refrigerati. Un tuffo in queste coppe per lo stoccaggio temporaneo del tessuto intestinale e segmenti tagliati, che saranno preparati nei passaggi successivi.
  4. Tagliare il segmento intestinale ad una lunghezza di circa 20 cm, che fornisce un ampio tessuto (40-60 cm2) per generare RNA per applicazioni a valle e campioni di controllo di qualità. A seconda l'integrità del tessuto, può essere fattibile per realizzare isolamento del RNA per l'elaborazione a valle con una lunghezza molto più piccola (cioè, 5 cm di intestino).
  5. Tagliare via adiposo e connettivo dall'intestino utilizzando forbici chirurgiche. Adiposo lungo la sierosa intestinale residuo compromette la capacità di appiattire completamente tessuto nei passaggi successivi. Accuratamente tagliare il tessuto, in modo da evitare di intaccare il serosa durante la rimozione di grasso e tessuto connettivo, che può danneggiare il plesso mioenterico strutturalmente o rendere l'esterno del tessuto appiattire in modo non uniforme per il sezionamento.
  6. Fare un'incisione longitudinale lungo tutta la lunghezza del campione intestinale, preferibilmente presso il sito di attaccamento mesenterica.
  7. Sezionare distanza e scartare la tenia coli dal colon, in modo che appiattisce più prontamente, dopo essere stato rilasciato dalla tensione.
  8. Il mucosa dell'intestino-lato di strombatura giù sul tagliere refrigerati e tagliare strisce di 1,25 cm di larghezza da tutta la lunghezza del tessuto.
    Nota: Tessuto intestinale spesso si espande dopo la rifinitura, così questa dimensione dovrebbe essere adattata di conseguenza.
  9. Memorizzare temporaneamente le strisce in tessuto refrigerati-unità di storage.
    Nota: Utilizziamo Belzer UW frigorifere soluzione perché ha una lunga durata, è relativamente economico e può essere conservato a temperatura ambiente fino a quando necessario.
  10. Rimuovere una striscia di tessuto dalla soluzione di conservazione frigorifera e tagliarlo in segmenti ~1.5-2 cm di lunghezza.
  11. Asciugare rapidamente i segmenti intestinali su una pila di salviettine di laboratorio, per rimuovere il liquido in eccesso e prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio lungo la sierosa intestinale durante il flash-congelamento. Se il tessuto non è sufficientemente essiccato, sarà difficile ottenere sezioni di alta qualità dal plesso mioenterico.
  12. Cordatura lato mucosa intestinale blotted pezzi su un pre-refrigerato, grande, USA e getta stampo base plastica (37 x 24 x 5 mm).
  13. Appiattire con attenzione ogni segmento leggermente allungando il tessuto sopra la superficie dello stampo base e usando il forcipe curvo di premere delicatamente e di espellere eventuali bolle d'aria che può essere intrappolata sotto il serosa. Nota che il tessuto si espande mentre appiattimento. Se necessario, rifilare i segmenti e tagliare gli altri campioni in un formato più piccolo.
    Nota: Se il tessuto è troppo teso, questo falserà il plesso mioenterico. Dopo aver rimosso tutte le bolle d'aria, valutare lo spessore del campione prima del congelamento. Se necessario, premete i bordi del perfezionamento attivo campione fino a quando il campione intestinale si avvicina il suo spessore iniziale.
  14. Posizionare lo stampo di base caricato sulla superficie del ghiaccio secco, liquami di 2 MB. Il tessuto dovrebbe congelare completamente entro 30-60 s, a seconda della dimensione e spessore del segmento intestinale.
  15. Asciugare il fondo dello stampo base per rimuovere il residuo 2 MB sfregando rapidamente la muffa base sui tessuti laboratorio pre-raffreddati nel secondo secchio di ghiaccio secco.
  16. Trasferire il campione essiccato alla terza vasca di ghiaccio secco e seppellirlo sotto la superficie del ghiaccio secco fino a quando è pronto per essere avvolto.
  17. Osservare rapidamente il fondo dello stampo base prima del confezionamento, per esaminare la qualità della preparazione del campione. Prendere nota di tutti i prelievi che non apparire piatta o prive di bolle d'aria di grandi dimensioni, come questi dovrebbero essere evitati per cryosectioning e LCM.
  18. Avvolgere l'esempio in un foglio di alluminio pre-etichettata che è posta in cima a ghiaccio secco in un secchio in modo che avvolgimento del tessuto si verifica mentre veniva tenuto completamente congelato.
  19. Avvolgere il campione con uno strato di involucro di plastica, per ridurre al minimo la disidratazione del tessuto durante la conservazione a-80 ° C.
  20. Conservare i campioni nel secchio rettangolare finché non sono pronti per essere spostati nel congelatore.
  21. Pre-etichetta e pre-chill box congelatore a-80 ° C per deposito immediato dei campioni dopo la raccolta.
  22. Prendere una piccola porzione di tessuto da ogni segmento intestinale per la valutazione dell'integrità di RNA prima di svolgere LCM.
    1. Pre-etichetta un tubo di RNAsi-libera di 2mL per ogni segmento, riempito con ≥ 500 µ l di tampone di lisi. Si consiglia di utilizzare il Kit di estrazione di RNA "D", elencati nella Tabella materiali.
    2. Omogeneizzare un pezzo piccolo (2 x 2 mm) dell'intestino in un tessuto standard micro-omogeneizzatore (20-40 s, finché non rimangono senza pezzi di tessuto). Poi, immediatamente congelare il RNA lisato su ghiaccio secco e conservare a-80 ° C fino a procedere con l'estrazione di RNA.
    3. Facoltativamente, incorpora alcune delle sezioni nel mezzo di congelamento del tessuto (TFM) come back-up. Preparare le sezioni di tessuto nello stesso modo descritto in questa sezione, ma immergere campioni in TFM entro lo stampo base prima del flash-congelamento.

3. Cryosectioning

  1. Prima cryosectioning, preparare tutti i materiali necessari per la colorazione e la disidratazione e trasferire i campioni di tessuto desiderato dal congelatore-80 ° C in un secchio di ghiaccio secco.
  2. Preparare il criostato per uso impostando la temperatura ottimale di taglio (-18 a-22 ° C) e pulire le superfici con etanolo al 100% e trattamento la lama e pennello vassoio con soluzione di decontaminazione di RNAsi.
  3. Per meglio aderire il campione al mandrino, utilizzare il seguente approccio.
    1. Collocare la pinza in ghiaccio secco per almeno 30 s prima di scartare il campione intestinale e l'immissione sulla superficie del ghiaccio secco sierosa-side-up.
    2. Versare un tumulo di 3-5 mm di medium di congelamento del tessuto (TFM) su un portacampioni grande criostato e trasferire immediatamente il campione intestinale sierosa-side-up sul TFM.
    3. Trasferire velocemente il portacampioni su ghiaccio secco e coprire con powderized ghiaccio secco dopo permettendo il TFM di aderire al campione per 2-5 e a temperatura ambiente. Assicurarsi che il TFM rimane sotto il piano del plesso myenteric.
      Nota: Idealmente, la superficie esterna della mucosa intestinale completamente aderirà a TFM prima TFM comincia a congelare senza scongelamento del campione.
  4. Montare il portacampioni nella testa dei campioni del criostato e allineare l'esemplare con la lama del criostato, in modo tale che il piano del plesso myenteric sarà parallelo alla lama di taglio.
  5. Impostare lo spessore del taglio del criostato a 8 µm. Lo scopo di allineare perfettamente l'esemplare è quello di ottenere la massima superficie possibile del plesso mioenterico su ogni diapositiva. Questo spessore è generalmente raccomandato per tessuto umano e del roditore, ma può essere regolato, secondo necessità.
  6. Sezione attraverso la sierosa e muscolo longitudinale fino a raggiungere il plesso mioenterico.
    1. Per individuare il plesso mioenterico, montare una sezione del campione su un vetrino e macchia la sezione con una tintura acquosa, come 1% cresile viola o blu di toluidina, ecc.
    2. Visualizza la sezione sotto un microscopio chiaro 40-2000 ingrandimenti per identificare la giunzione tra gli strati di muscolo longitudinale e circolare. Parametri del microscopio sono forniti nella Tabella materiali. All'inizio del sezionamento, il serosa sarà contrassegnato dalla presenza di tessuto connettivo. Alcuni resto grasso mesenterico può anche essere presente lungo la sierosa. Inizia poi un foglio dello strato esterno del muscolo longitudinale. Una volta raggiunto il confine tra gli strati di muscolo longitudinale e circolare, sarà osservata una porzione del ganglia enterico.
      Nota: Nelle prossime sezioni diverse, il plesso mioenterico diventerà molto evidente, con vaste aree dei gangli essendo presenti all'interno di una singola sezione (Figura 2C). Se il tessuto non è completamente pianeggiante all'inizio del sezionamento, quindi solo una parte dei gangli sarà presente in ogni sezione in un determinato momento. A volte, l'esempio intestinale può avere un plesso mioenterico intrinsecamente irregolare, nonostante il tessuto che appaiono perfettamente piana. Questo è particolarmente vero per i campioni del duodeno. Nella nostra esperienza, questi campioni possono richiedere molto più tempo per elaborare con LCM, ma sufficiente RNA possa essere raccolti all'interno di sessione di un singolo giorno. La posizione esatta del plesso myenteric possa variare notevolmente tra i campioni, basati sul tessuto e la sua preparazione prima del congelamento.
  7. Iniziare la raccolta sezioni seriali per LCM, con collezioni ottimale, fornendo il maggior numero di neuroni e glia per ogni diapositiva. A seconda della superficie del campione, più sezioni possono essere combinati in una singola diapositiva di penna-membrana.
  8. Montare i profili sui vetrini di membrana di penna, refrigerati brevemente nel criostato per 5-10 s. Durante il montaggio, il tessuto dovrebbe fondere solo leggermente, al massimo preservando l'integrità del RNA.

4. colorazione

Nota: Per una panoramica del processo di colorazione, fare riferimento alla tabella 1. Tutte le soluzioni utilizzate sono preparate in flaconi da 50 mL coniche. Il trattamento esterno dei tubi con soluzione di decontaminazione di RNAsi non sembra migliorare i risultati (dati non mostrati).

  1. Preparare una soluzione satura di viola di Cresyl 4% in etanolo al 95% almeno un giorno in anticipo e completamente ri-sospendere la viola di Cresyl prima di caricare la siringa.
    Nota: La concentrazione di etanolo potrebbe essere necessario essere abbassata per la macchiatura efficace, come descritto nella sezione discussione. Non abbiamo testato se utilizzando il 50% o 75% etanolo durante la colorazione significativamente riduce l'integrità di RNA. Cresyl violet è sensibile alla luce e così dovrebbe essere protetto dalla luce.
  2. Dopo aver montato le sezioni del plesso mioenterico sulla diapositiva, immediatamente immergere il vetrino in un flacone conico di etanolo al 95% (pre-raffreddata a-20 ° C) per 30 s.
    1. Se le sezioni non aderiscono completamente alla diapositiva nel passaggio precedente, leggermente caldo parte inferiore della slitta con una mano guantata (un wipe di laboratorio deve essere posizionato tra la diapositiva e guanto), per la piena adesione prima dell'immersione in etanolo al 95%. Questa soluzione può essere riutilizzata per almeno 3-6 diapositive senza ridurre l'integrità di RNA.
  3. Posare la diapositiva a faccia in su un wipe di laboratorio disposto in cima ad un contenitore pre-trattati, RNAsi-libera8.
  4. Pre-riempire una siringa da 3mL con la viola di Cresyl 4% e allegare un filtro per siringa da 0,2 µm.
    Nota: Si consiglia di filtri di acetato di cellulosa.
  5. Applicare 6-10 gocce di macchia direttamente sul tessuto sezioni8 e incubare per 10-30 secondi, o fino alla tintura sufficiente viene mantenuta quando de-macchiato. Mentre la macchiatura, ruotare delicatamente il contenitore di diapositiva a mano per assicurare che le sezioni di tessuto sono uniformemente ricoperti di macchia.
  6. Versare la macchia e immediatamente de-macchia la diapositiva in un flaconcino di etanolo di 75%. Immergere ripetutamente la diapositiva fino a quando il colorante in eccesso per la maggior parte ha filtrato fuori il campione. Questo può richiedere tra 10-20 s.
  7. Finalizzare la de-macchiatura immergendo ripetutamente il campione in una fiala di etanolo al 95% per 10 s. Immergere il campione ripetutamente fino a quando ogni macchia in eccesso è stato rimosso.
    1. Modificare la durata decolorante, come necessario, per ottimizzare la macchiatura dei gangli. Se troppo macchia viene rimossa, il campione diventa troppo trasparente e può essere difficile da visualizzare
      Nota: Questo protocollo di colorazione è stato ottimizzato basato su diverse pubblicazioni5,8,10,11 che richiedesse modifiche prima che i risultati soddisfacenti sono stati ottenuti. Di conseguenza, la concentrazione di etanolo utilizzato nella tintura e durante il processo di decolorante deve essere modificata, quando necessario, per ottenere un risultato ottimale.

5. disidratazione

  1. Immediatamente immergere il vetrino in etanolo 100% 2 - 3 volte, per un totale di 10-20 s.
  2. Immergere il vetrino in etanolo anidro 100% per almeno 30 s. Come etanolo anidro è molto igroscopico, aggiungere setacci molecolari (maglia 8-12) nel flaconcino di etanolo al 100% prima dell'inizio della procedura per rimuovere l'acqua assorbita e così più completamente disidratare il campione5.
  3. Ripetutamente immergere il vetrino in xilene per 15-20 s. Questo passaggio rimuove completamente lo strato di etanolo sulla diapositiva. Aggiungere i tubi di xilene, completamente assorbire molecole di acqua e etanolo in eccesso5setacci molecolari prima del tempo.
    Attenzione: Xileni sono classificati come un irritante per gli occhi e le vie respiratorie superiori e devono essere utilizzati in una cappa chimica.
  4. Immergere il vetrino in xilene (con setacci molecolari, 8-12 mesh) per almeno 10 min.
    Nota: Una breve pausa può essere presa dopo questo passaggio, se necessario. Campioni possono essere lasciati in xilene per 4-5 ore senza effetti dannosi alla macchiatura, LCM o RNA resa/integrità.
  5. Facoltativamente, individualmente preparare diverse diapositive aggiuntive a questo punto. Se preparando un secondo turno di diapositive dopo aver completato il LCM su tutti i vetrini preparati, potrebbe essere necessario essere rettificato, a causa di disidratazione della superficie del tessuto il tessuto nel criostato. Potrebbero essere necessario essere scartato prima di sezioni utilizzabili possono essere raccolti da uno a quattro sezioni.

6. laser Capture Microdissection (LCM)

  1. Rimuovere il vetrino da xilene e asciugare all'aria e in una cappa chimica per almeno 1 min inserire una cartuccia di tappi LCM nel tavolino del microscopio LCM. Caricare la diapositiva sul palco e acquisire un'immagine panoramica della diapositiva.
  2. Identificare il percorso desiderato per LCM e caricare un tappo sulla diapositiva.
  3. Allineare il laser infrarosso (IR) e regolare la sua potenza e durata per rendere un diametro di 20-30 µm catturare spot.
  4. Individuare il laser ultravioletto (UV) e impostare una velocità di taglio appropriato e intensità.
  5. Delineare i gangli desiderati deve essere raccolto utilizzando il software di LCM, avendo cura di rimanere entro il limite dell'area da collezione sul tappo (raffigurato nei cenni preliminari sulla diapositiva del programma software come un cerchio verde).
  6. In ciascuna delle tracce, è necessario regolare le macchie IR tale che c'è almeno uno IR spot ogni 100-500 µm.
  7. Premere il pulsante taglio IR/UV per procedere con la raccolta di tutti i gangli contrassegnati.
  8. Una volta raccolte vengono completate, spostare il tappo in una nuova posizione e ripetere il processo di raccolta oppure esaminare il tappo di LCM presso la stazione QC, una volta che il tappo è sufficientemente riempito con gangli (o fino a quando viene raggiunto il limite di tempo consigliato di 60-80 minuti).
  9. Se i detriti sono presenti sul tappo, pulire via con un pennello a punta fine che è stato pre-trattato con soluzione di decontaminazione di RNasi, risciacquato con acqua priva di nucleasi e completamente asciugato.
  10. Esaminare attentamente il cappuccio dall'occhio o con ingrandimento sotto un campo luminoso microscopio per garantire tutti i detriti è stato rimosso. Se i detriti possono essere rimossi attraverso l'uso del pennello pre-trattato, quindi utilizzare una pipetta bene (RNAsi-libera) per raschiare via i detriti.
  11. Fissare il tappo su un tubo di microfuge 0,5 mL riempito con 230 µ l di tampone di lisi di RNA (Buffer RLT dal Kit di estrazione di RNA "B", con β-mercaptoetanolo aggiunto ad una concentrazione di 10 µ l/mL).
  12. Invertire il tappo, brevemente vortex e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  13. Centrifugare a ≥ 5.000 x g per 5 min e poi il trasferimento al microfuge tubo di ghiaccio secco.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. RNA lisati possono essere memorizzati a-80 ° C senza un effetto sostanziale sulla degradazione del RNA per almeno 1 settimana. Se l'isolamento del RNA viene eseguita lo stesso giorno, poi raffreddare i campioni su ghiaccio finché non sono pronti per l'estrazione.
  14. Eseguire tutte le altre raccolte entro il limite di tempo massimo consigliato di 80-90 min dopo aver tolto lo slide dal xilene. Come le sezioni disidratate sono esposti ad umidità ambientale, RNasi possono gradualmente diventare riattivato. Limitando il periodo di raccolta può minimizzare tali effetti e preservare al massimo l'integrità del RNA.

7. isolamento di RNA

  1. Preparare una workstation RNAsi-libera per le estrazioni RNA.
  2. Preparare tutti i tubi e i reagenti in base al manuale per il Kit di estrazione di RNA.
    Nota: Mentre ci sono molti kit disponibili per isolamento di RNA dopo LCM, abbiamo avuto miglior successo utilizzando il Kit di estrazione di RNA "B", elencati nell'elenco materiali. Vedere la Figura 5 per un confronto side-by-side di reagenti di estrazione di RNA.
  3. Rimuovere i campioni dal congelatore-80 ° C e scongelare rapidamente in bagnomaria a 37 ° C.
  4. Immediatamente il vortice scongelati campioni per 2-3 e distribuire uniformemente i sali di tiocianato di guanidinium.
  5. Combinare ogni campione con un volume uguale di etanolo al 70%. Piscina lisati di 2 o più insieme, se necessario, per raggiungere una sufficiente concentrazione di RNA.
  6. Procedere come da istruzioni del produttore, nel manuale per il processo di estrazione di RNA, utilizzando il protocollo ottimizzato per microdissected campioni.
  7. Eluire RNA nella fase finale in volume minimo consigliato di acqua esente da nucleasi (14 µ l).
  8. A seguito di isolamento del RNA, il aliquota 1-2 µ l di RNA di ciascun campione in un nuovo pre-etichettata RNAsi-libera tubo per il controllo di qualità/valutazione di qualità con un dispositivo di microfluidica che può visualizzare piccole quantità di RNA, come ad esempio un Bioanalyzer. Aliquota un ulteriore 1 µ l in un tubo separato per quantificazione con un kit di quantificazione di RNA ad alta sensibilità.
    1. Regolare questi passaggi, come necessario, per ottenere una quantità sufficiente di RNA per analisi a valle (cioè., piscina un numero maggiore di tappi di LCM prima dell'estrazione di RNA).
  9. Archivio RNA a-80 ° C fino a raccogliere il numero sufficiente di campioni per analisi a valle.

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Risultati

Abbiamo apportato diversi miglioramenti ai protocolli esistenti che consentono la raccolta relativamente rapida dei gangli enterici dai campioni intestinali umani utilizzando LCM, conforme agli standard per RNA-seq. In primo luogo, abbiamo ottimizzato il congelamento rapido di segmenti di tessuto intestinale in grandi stampi base collocati sulla superficie di un impasto di ghiaccio secco in 2 MB (Figura 1B). Il miglior successo durante cryose...

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Discussione

Questa procedura consente la raccolta efficiente dei numerosi gangli enterici come fonte per la derivazione di RNA per RNA-seq. Qui, abbiamo abbiamo accelerato i processi illustrati in protocolli esistenti mantenendo al massimo l'integrità del RNA. Come tutti i passaggi di questa procedura sono interdipendenti, è importante che tutti i problemi verranno eliminati dall'inizio dello studio e che tutti i campioni sono preparati come similmente ad uno altro come possibile, per ottenere affidabile RNA-seq.

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Riconoscimenti

Siamo grati per i donatori e le loro famiglie che hanno reso possibile questo lavoro. Apprezziamo anche l'assistenza di personale presso l'International Institute of Medicine e Tennessee Servizi per i donatori per aiutare la raccolta delle coordinate del tessuto utilizzato in questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 per supporto di EMS2 e stipendio da NIH T32-DK007673 a AMZ. Siamo grati al personale della Vanderbilt traslazionale patologia ha condiviso risorsa per l'accesso allo strumento di LCM e consigli sulla preparazione dei tessuti. La risorsa ha condiviso la foto di Vanderbilt tessuto patologia è sostenuta in parte da sovvenzioni NIH P30-CA068485-14 e U24-DK059637-13. Ringraziamo il genoma Technology Center di accesso del dipartimento di genetica presso la Washington University School of Medicine per aiuto con analisi genomica. Il GTAC è parzialmente supportato da NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 alla Siteman Cancer Center e da TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 dal centro nazionale per ricerca risorse (NCRR), un componente del National Institutes of Health (NIH) e NIH Tabella di marcia per la ricerca medica. Questa pubblicazione è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale di NCRR o NIH.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Neutral-buffered formalinSigmaHT501128-4L
2-MethylbutaneFisherO3551-4
3-mL syringeBD309628
50-mL conical tubes, polypropylene Corning05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposableElectron Microscopy Sciences5025511
Belzer UW  Cold Storage SolutionBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCM capsArcturus, ThermoFisherLCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal   Glad  N.A. 
Cresyl Violet AcetateAcros OrganicsAC405760025
Cutting BoardElectron Microscopy Sciences63308
Ethanol, 190-proofPharmco-AAPER111000190
Ethanol, 200-proofPharmco-AAPER111000200
Glass Microscope slidesFisher12-550-343
Gloves, extended cuffMicroflex 19010144
Gowns, surgical-disposableKimberly-Clark 19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)Nalgene  1335920B
Kimwipes (large)Kimberly-Clark 34120
Kimwipes (small)Kimberly-Clark 34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm Southeast Pathology Instrument ServiceN.A. 
Light MicroscopeOlympusCX43
Microscope objective (20X)Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
Microscope objective (10X)Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
Molecular SievesAcros OrganicsAC197255000
Nuclease-free waterAmbionAM9937
PicoPure RNA extraction kitApplied Biosystems12204-01
Pellet PestleKimble Kontes4621973
PEN membrane LCM slidesArcturus, ThermoFisherLCM022
RNase-free tubes, 1.5 mLAmbionAM12400
RNaseZAP SigmaSigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)Applied Biosystems12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)Qiagen74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)Invitrogen15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)Qiagen74134
Splash Shield, disposable faceshieldFisher17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"Fine Science Tools14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)Nalgene  190-2520
Tissue Freezing MediumGeneral Data HealthcareTFM-5
XylenesFisherX3P1GAL

Riferimenti

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