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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo viene illustrato come impostare un metodo affidabile di HFS in topi. Neuroni nel giro dentato dell'ippocampo sono stimolati elettricamente da HFS direttamente e indirettamente in vivo. Attività neuronale e induzione di segnali molecolari sono esaminate dal c-fos e macchiatura immunofluorescente Notch1, rispettivamente; neurogenesi è quantificata mediante analisi di etichettatura della bromodeossiuridina.

Abstract

Stimolazione elettrica ad alta frequenza (HFS), utilizzando elettrodi impiantati in varie regioni del cervello, il targeting è stata dimostrata come un efficace trattamento per vari disturbi neurologici e psichiatrici. HFS nella regione profonda del cervello, anche denominato stimolazione cerebrale profonda (DBS), sta diventando sempre più importante negli studi clinici. Recenti progressi nel campo della chirurgia DBS (HF-DBS) ad alta frequenza ha iniziato a diffondersi la possibilità di utilizzare questa tecnica invasiva ad altre situazioni, come trattamento per il disturbo di depressione maggiore (MDD), disturbo ossessivo-compulsivo (OCD) e così su.

Nonostante queste indicazioni in espansione, i meccanismi degli effetti benefici di HF-DBS rimangono enigmatici. Per rispondere a questa domanda, un approccio consiste nell'utilizzare elettrodi impiantati che attivano scarsamente distribuite sottopopolazioni di neuroni di HFS. È stato segnalato che HFS nel nucleo anteriore del talamo potrebbe essere usato per il trattamento dell'epilessia refrattaria in clinica. I meccanismi di fondo potrebbero essere collegati con il neurogenesis aumentato e alterata attività neuronale. Pertanto, siamo interessati ad esplorare le alterazioni fisiologiche tramite la rilevazione di attività neuronale, come pure la neurogenesi nel giro dentato (DG) del mouse prima e dopo trattamento di HFS.

In questo manoscritto, descriviamo metodologie per HFS indirizzare l'attivazione della DG in topi, direttamente o indirettamente e in maniera acuta o cronica. In più, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di fette del cervello per c-fos e Notch1 immunofluorescente macchiatura per monitorare l'attività neuronale e l'attivazione di segnalazione e per bromodeossiuridina (BrdU) etichettatura per determinare la neurogenesi dopo l'induzione HF-DBS. L'attivazione dell'attività neuronale e neurogenesi dopo il trattamento di HF-DBS fornisce la prova diretta neurobiologica e potenziali benefici terapeutici. In particolare, questa metodologia può essere modificata e applicata per altre regioni del cervello interessati quali i gangli basali e subtalamica regioni per disturbi cerebrali specifiche nella clinica di destinazione.

Introduzione

HF-DBS è una tecnologia neurochirurgica per la stimolazione elettrica del cervello, che è stato sviluppato dal 1870s1. Nel tardo 1980, HFS venne usata come intervento terapeutico potenziale per il morbo di Parkinson e disordini di altri movimento2. Negli ultimi decenni, HF-DBS è stato più ampiamente utilizzato nel trattamento dei disordini del cervello che sono attualmente incurabili di una strategia terapeutica tradizionale. In particolare, grazie al miglioramento della precisione dell'elettrodo HFS, i risultati altamente efficaci e gli effetti collaterali minimi, il numero di disturbi cerebrali trattati da HF-DBS ha aumentato significativamente negli ultimi decenni3,4, 5. Ad esempio, HF-DBS è stato approvato da la US Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento della malattia di Parkinson (MDP), demenza di tipo Alzheimer, tremore essenziale e altri tipi di movimento disturbi2,6, 7. nei pazienti del Palladio, il farmaco dopaminergico è ridotto fino al 50% durante la HF-DBS8. Oltre il riuscito trattamento dei disordini di movimento, HF-DBS ha dimostrato anche i suoi potenti effetti nel trattamento di malattie psichiatriche nella clinica e per l'incremento cognitivo come ben2,9, 10 , 11. si deve osservare che la ricerca di HFS per il trattamento di altri disturbi psichiatrici sono in varie fasi, offrendo molta promessa a pazienti12.

Anche se molti studi hanno dimostrato che un HFS focale ha effetti sia locali che remoti in tutto il cervello13, i meccanismi neurologici e molecolari degli effetti rimangono sfuggente2,14. Nella clinica, terapeutica HF-DBS è solitamente applicato in un modo a lungo termine per il trattamento del morbo di Parkinson e dolore cronico, ecc. , che molte opinioni sono sollevate per spiegare il miglioramento generato da un trattamento di HF-DBS, tra cui una possibilità che la corrente HFS modula l'attività di rete neuronale, probabilmente da una depolarizzazione ripetitiva degli assoni in prossimità dell'elettrodo HFS impiantato. In alternativa, HF-DBS possono modificare il tasso di scarico di neuroni di output e gli obiettivi previsti. Inoltre, HF-DBS può portare a cambiamenti sinaptici a lungo termine, tra cui Long-term potentiation (LTP) e depressione a lungo termine (LTD), che può contribuire a un miglioramento sintomatico. Finora, non è ancora chiaro se tali processi di HFS influenze chiavi eventi molecolari che regolano il cellulare come nella neurogenesi adulta in vivo. Parecchie linee di studi hanno dimostrato che HFS in roditori potrebbero imitare simili risposte neurali di clinicamente applicata DBS15,16. Per comprendere i meccanismi cellulari di HF-DBS, in questo studio, abbiamo innanzitutto impostare un in vivo metodologia HFS nei topi in un acuto (un giorno) o cronica (cinque giorni) modo. In secondo luogo, abbiamo istituito una metodologia di analisi di attivazione per determinare l'alterazione dell'attività neuronale e neurogenesi dopo una consegna di HF-DBS.

Dato che la produzione di un neurone da cellule staminali neurali è abbondante durante lo sviluppo embrionale ma continua per tutta la vita adulta, la zona subgranulare hippocampal è una delle principali aree dove si verifica la neurogenesi. Il processo di neurogenesi è influenzato da molti fattori fisiologici e patologici. In alcuni casi epilettici, il neurogenesis hippocampal è drammaticamente in diminuzione17,18. Inoltre, una singola terapia electroconvulsive potrebbe aumentare considerevolmente la produzione neuronale nel giro dentato19. Queste osservazioni suggeriscono che l'attività elettrofisiologica svolge un ruolo critico nella regolazione della neurogenesi adulta e plasticità sinaptica nei neuroni dell'ippocampo. Pertanto, per illustrare ulteriormente gli effetti di HF-DBS sull'attività neuronale e neurogenesi, prima eseguiamo un'analisi immunostaining del inizio immediato gene (IEG) c-fos che è un indicatore ben noto dell'attività neuronale a breve termine derivanti da Esperienza di20. Segnalazione di Notch1 viene rilevato anche per monitorare l'attivazione di segnalazione dopo il HFS consegna21,22. Inoltre, rileviamo anche la produzione di un neurone di un BrdU etichettatura analisi dopo l'induzione HF-DBS in vari modi, anche se BrdU colorazione può anche essere un indicatore per gliogenesis.

Nello studio presente, due metodologie di HFS sono adattati per l'attivazione della DG hippocampal di destinazione direttamente e indirettamente. L'elettrodo è impiantato nella DG direttamente o impiantato nel percorso perforant mediale (PP) che invia proiezioni per attivare i neuroni DG. Per l'induzione HF-DBS, uno stimolatore programmabile è presentato per una stimolazione continua attraverso l'elettrodo fisso sulla testa del mouse. Per determinare gli effetti di HFS su attivazione neuronale e neurogenesi, rileviamo l'espressione di c-fos e Notch1 dalla macchiatura immunofluorescente e il numero di neuroni positivi incorporato BrdU DG della regione ippocampale, rispettivamente, dopo il trattamento di HFS. In particolare, gli effetti del HF-DBS sulla neurogenesi nella DG vengono confrontati tra un acuto e un modo di stimolazione cronica, o tra un telefono e un modo di stimolazione indiretta, rispettivamente.

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Protocollo

Procedure sperimentali animali seguito le indicazioni istituzionali di il Beijing Institute di scienze mediche di base (Pechino, Cina) e i regolamenti governativi cinesi per la cura e l'uso di animali da laboratorio. I topi (uomo, adulto 26 ~ 30g) erano stabulati e tenuti ad una temperatura costante di 23 ° C, con acqua e cibo ad libitum, sotto un ciclo di 12-h luce/12-h scuro (luci accese alle 7:00). Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate durante il ciclo di luce.

1. preparazione chirurgica

Nota: Un elettrodo personalizzato era fatta in casa utilizzando il metodo modificato di Halpern relazione23.

  1. Utilizzare 2 micro-cavi in rame (con un diametro esterno di 200 µm) come l'elettrodo bipolare parallela. Avvolgere gli elettrodi intorno a vicenda per formare gli elettrodi cilindrici per la stimolazione.
    Nota: Qui, la lunghezza dell'elettrodo all'interno PP o DG era varia secondo la profondità anatomica del nucleo.
  2. Sterilizzare gli elettrodi utilizzando un armadietto di disinfezione di ossido di etilene. Maneggiare e conservare gli elettrodi di micro-filo 2 canali fatti in casa senza alcuna contaminazione. Gli elettrodi devono essere rigorosamente sterilizzati prima di qualsiasi impianto chirurgico.
  3. Autoclave gli strumenti chirurgici.
  4. Prima della chirurgia, iniettare il mouse con pentobarbital (20-50 mg/kg) per via intraperitoneale, per realizzare un aereo chirurgico di anestesia.
  5. Iniettare il mouse con una sospensione di sterile penicillina G procaina (75.000 U, I.M.) e un agente analgesico (carprofen, 0.05 - 1 mg/kg, SC) per diminuire il rischio di infezioni e dolore, rispettivamente24.
  6. Dopo l'anestesia degli animali, è possibile applicare un lubrificante di occhio in entrambi gli occhi per prevenire la secchezza degli occhi. Garantire l'induzione della sedazione e della profondità dell'anestesia dai riflessi dell'animale in risposta a pizzicare le dita e procedere con l'operazione solo quando si verifica alcuna risposta.
    Nota: Vet unguento è un'altra opzione per prevenire la secchezza degli occhi.
  7. Radere la maggior parte della pelliccia sulla sommità della testa del mouse con il tagliacapelli elettrico o una lama di rasoio, sterilizzare la zona rasata con tre scrub alternati di soluzione 70% alcool e betadine e procedere con l'operazione dopo il betadine è asciugato sulla pelle.

2. ad alta frequenza stimolazione chirurgia25,26

Nota: In questo passaggio, un elettrodo è unilateralmente impiantato in DG dorsale o mediale PP zona, una parte dell'ippocampo con ruoli critici nell'apprendimento episodico e memoria.

  1. Posizionare il mouse anestetizzato sul telaio stereotassica. Per mantenere la testa del mouse immobile, le barre di orecchio sono allineate correttamente e installarli rapidamente. Stringere le barre dell'orecchio in modo che essi sostengono la testa centrata e garantire il mouse leggermente.
  2. Utilizzare un tampone termostatico per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 ± 0,5 ° C.
  3. Utilizzare pinze per afferrare la pelle anteriore le orecchie da Topolino e tagliare con forbici sterilizzate per rimuovere circa 1 cm2 zona di pelle sulla parte superiore del cranio del mouse.
    Nota: Una piccola quantità di sanguinamento potrebbe essere osservata lungo i bordi del taglio pelle.
  4. Rimuovere il muscolo e altri allegati che ricopre il cranio con un tampone di cotone per esporre la superficie del cranio. Usare un batuffolo di cotone e scalpello per dissezione per pulire tutti i periostio, tendini e tessuto connettivo dalla superficie completamente per identificare la sagittale linee suture lambda e del cranio.
  5. Identificare il bregma e punto di lambda. All'incrocio della sutura coronale e la sutura sagittale sulla porzione superiore centrale di calvaria è dove si trova il bregma. All'incrocio della sutura lamboidea dalla sutura sagittale è dove la lambda è visibile. Utilizzare il bregma come punto originale per impostare la posizione del nucleo.
  6. Dopo l'identificazione della posizione bregma e lambda sul cranio, regolare questi due punti a livello orizzontale. Assicurarsi che l'altezza di questi due punti è quasi lo stesso in senso dorso-ventrale (eventuali errori dovrebbero essere < 0,05 mm). Inoltre, assicurarsi che che il cranio sia a livello in direzione mediale-laterale nel stesso modo26.
  7. Per un intervento unilaterale, è necessario montare un elettrodo in micro-filo rame 2 canali fatti in casa nel porta-elettrodo rotante sul telaio chirurgico stereotassica.
  8. Posizionare l'elettrodo in posizione verticale sopra il punto di bregma in un primo momento e impostarlo come sito originale. Utilizzare il digitale viene visualizzato cornice stereotassica chirurgico per indicare l'antero-posteriore (AP), mediale-laterale (ML), e dorso-ventrale (DV) posizioni.
    Nota: Per impedire che l'elettrodo sempre piegato, non toccare la punta dell'elettrodo sul cranio durante l'operazione.
  9. Spostare delicatamente l'elettrodo nella posizione corretta (Figura 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 per DG e AP-3.8/ML ± 3.0 per PP, rispettivamente)27 sopra il cranio senza alcun contatto. Quando per inserimento dell'elettrodo è stato identificato il sito desiderato, utilizzare adattamenti stereotactic dorsoventral superiore la porta elettrodi e segnare la posizione con un pennarello nero.
    Nota: La posizione esatta in riferimento le coordinate stereotassiche può variare da sesso, peso e razza del topo. Topi adulti dello stesso sesso dovrebbero essere usati per ridurre al minimo qualsiasi variazione nella posizione. Se possibile, scansioni anatomiche pre-Operational devono essere utilizzati per identificare la posizione su un singolo soggetto base27.
  10. Usare un trapano portatile micromanipolatore-assistita (dimensione della bava = 0,5 mm) per rendere i fori della bava la posizione contrassegnata precisamente. Sterilizzare la punta della bava con etanolo al 70% prima di forare. Spostarsi verso l'alto la punta del trapano mini attraverso il cranio lungo l'asse z 0,8 - 1,0 mm senza modificarne la posizione X-Y. Utilizzare un cotone sterile per bloccare qualsiasi emorragia durante l'operazione.
    Nota: Per evitare sovra-foratura ed eccessiva generazione di calore durante la perforazione, verificare la velocità di perforazione è di 15.000-18.000 giri al minuto (RPM) e frequentemente ritirare la punta del trapano dal foro della bava ogni 8-10 s.
  11. Mantenere perforazione fino a quando la dura madre è esposto. Utilizzare un ago piegato per rimuovere eventuali frammenti di osso che vengono generati durante la perforazione e fare un foro stenopeico su dura senza danneggiare il tessuto cerebrale morbido sottostante.
    Nota: Per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale, l'ago smussato piegato può essere sostituito con un forcipe smussato fine.
  12. Per verificare che i fori della bava sono stati fatti correttamente nella posizione desiderata, ridurre l'altezza di elettrodo di una regolazione del telaio chirurgia stereotassica e assicurarsi che l'elettrodo può essere inserito senza intoppi attraverso il foro della bava senza toccare gli ostacoli. In questo caso, inserire lentamente gli elettrodi ad una profondità di 1,8 mm per la DG (o 3,0 mm per i PP) dalla superficie del cranio situato al PP mediale per la DG (PP-DG).
    Nota: Pulire qualsiasi liquido cerebrospinale o il deflusso di sangue dai fori della bava con cotone sterile durante il processo dell'impianto elettrodo.
  13. Dopo l'inserimento di micro-filo-elettrodo nel foro del cranio, tenerlo in posizione con cemento dentale adeguata con una piccola spatola. Come il cemento si ispessisce, la muffa intorno l'elettrodo inserito e viti per formare un bel cappello liscio. Sbrigliare e disinfettare i bordi della ferita.
  14. Disinnestare l'elettrodo dalla pinza porta elettrodo. Rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica e tornare a una gabbia calda.
    Nota: Dopo la chirurgia, aspettare con restituzione degli animali al loro gabbie fino a quando non hanno pienamente recuperato dall'anestesia con sufficiente coscienza.
  15. Lasciare che il mouse muoversi liberamente e consentire di recuperare per 2 giorni nella gabbia. Quindi, collegare l'elettrodo impiantato nel topo cervello per un stimolatore programmabile via conduce. Impostare l'interfaccia del software, come illustrato nella Figura 2. Impostare i parametri HFS come 6 serie di 6 treni di 6 impulsi a 400 Hz (Figura 1B, 100 ms tra i treni, 20 s tra le serie)28. Impostare l'intensità di stimolazione a 200 μA.
  16. Consegnare un HFS per il periodo desiderato come set up. Consegnare la stimolazione 2 volte al giorno alle 8:00 e alle 20:00
  17. Per il gruppo di controllo, dell'impianto di elettrodi nei topi e non eseguire una stimolazione.
  18. Per la colorazione di c-fos , stimolare i topi sperimentali acutamente (2 volte al giorno). Per l'etichettatura di BrdU, dividere i topi sperimentali in un gruppo di stimolazione acuta (applicato 2 volte al giorno) e un gruppo di stimolazione cronica (applicato x 10 a 5 giorni, 2 volte al giorno). Nel corso della stimolazione, assicurarsi che il mouse è sveglio. Ricordarsi di verificare che i cavi non siano attorcigliati.
    Nota: All'ultimo giorno della procedura, i topi nel gruppo stimolazione acuta sono stati stimolati simultaneamente.
  19. Quando la stimolazione avviene, staccare con cautela il pin elettrodo dalla pinza porta elettrodo ed il connettore di sistema di registrazione.

3. immunofluorescenza e bromodeossiuridina etichettatura29

  1. Per il c-fos e colorazione di Notch1, circa 3 h dopo l'ultima stimolazione di HF-DBS, anestetizzare i topi iniettando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) per realizzare un aereo chirurgico di anestesia.
  2. Per l'etichettatura di BrdU, circa 12 h dopo l'ultima stimolazione di HF-DBS, dare 6 iniezioni di BrdU per il controllo e i topi stimolati a intervalli di 2-h (50 mg/kg in soluzione fisiologica allo 0,9%, I.P.). 36 h dopo l'ultima iniezione, anestetizzare i topi iniettando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) per ottenere un piano chirurgico.
  3. Fare delle incisioni con un bisturi attraverso la gabbia toracica per esporre il cuore e poi passare un ago di calibro 22 smussato aspersione al ventricolo sinistro. Praticare una piccola incisione nell'atrio di destra. Via e irrorare con 50 mL di freddo tampone fosfato salino (PBS) seguita da 50 mL di freddo paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 1X (pH 7.4).
    Nota: Passare il PBS a PFA quando il mouse sangue in vivo viene sostituito e il fluido esce pulito. Una buona perfusione può essere giudicata dallo schiarimento del fegato. La perfusione deve essere interrotto una volta tremori di fissazione sono stati osservati30.
  4. Decapitare il mouse con le forbici oftalmiche, fare un'incisione sulla pelle ed esporre il cranio. Usando il forcipe, scheggiare fuori il cranio leggermente e attentamente sezionare il cervello di topo intero. Post-fix il cervello in paraformaldeide al 4% per altri 2 giorni e trasferirlo in una soluzione di saccarosio al 30% a 4 ° C durante la notte.
  5. Utilizzando un criostato, tagliare i cervelli in sezioni coronali di 20 µm. Trasferire e montare i profili sul vetrino con un pennello e conservarli a-20 ° C.
    Nota: Gli animali con misplacements dell'elettrodo o danni meccanici eccessivi saranno esclusi dall'analisi successive.
  6. Trasferire i vetrini in PBS normale (0,1 M, pH 7.4) non contenente alcun fissativo. Lavare le fette con PBS per 3-4 x per 5 minuti ciascuno per rimuovere qualsiasi fissativo in eccesso. Per il gruppo di BrdU-etichettati, incubare le sezioni in HCl 2-N a 37 ° C per 30 minuti e sciacquarli in un tampone borato di 0.1 M (pH 8,4; 10 min). Lavare quindi le fette 2 x per 5 min in PBS.
    Nota: Immunostaining viene quindi eseguita.
  7. Trattamento di fette di incubazione nella soluzione (siero di capra normale 1%, 3% di sieroalbumina bovina < BSA >, 0,5% Triton X-100 e 0,02% di sodio azide in PBS 1X) per 1 h a temperatura ambiente (TA) di blocco.
  8. Incubare le fette con anti -c-fos anticorpo policlonale (1: 500; coniglio), anticorpo anti-Notch1 (01:50; capra) o l'anticorpo anti-BrdU (1: 800; ratto) nella soluzione di blocco a 4 ° C durante la notte.
  9. Lavare le fette 3 x in PBS, poi li incubare con Alexa Fluor 568-coniugato anti-coniglio (1: 500), Alexa Fluor 488-coniugato anti-capra (1:1, 000), o anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 488 anti-ratto (1: 500) per 1 h a TA.
  10. Lavare i campioni 3 x in PBS (10 minuti ogni volta). Coprire le sezioni di cervello immuno-identificati utilizzando un mezzo di montaggio anti-dissolvenza reagente contenente DAPI. Lasciate le fette asciugare all'aria e conservarli al riparo dalla luce a 4 ° C.
  11. Acquisire immagini delle zone hippocampal dai lati stimolati e non stimolate del cervello con un multicanale ad alta risoluzione (sequenziale) microscopio confocale a scansione. Impostare i parametri di imaging costantemente tra controllo e nei gruppi sperimentali.
  12. Eseguire un imaging di mosaico utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento (obiettivo X aria 20, NA 0,45) di acquisire immagini (XYZ) 3D continue di adiacenti campi di vista utilizzando il tavolino motorizzato e utilizzare il software adatto a cucire insieme per rendere grande composito immagini.
    Nota: Tiling funzioni includono vero impunture e opzioni per immagini migliorate senza giunte di smussatura. Immagini composite sono rapidamente e facilmente preparati utilizzando la funzione di cucitura, per formare un'immagine su una vasta area.
  13. Per c-fos e colorazione di Notch1, eseguire un'analisi quantitativa di nuclei positivi del immunofluorescente densità21 delle immagini cucite. In modo casuale selezionare 3 aree nelle sottoregioni DG hippocampal rostrale dorsale e ventrale e misurare la densità immunofluorescente in modo doppio cieco utilizzando Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. Per un BrdU etichettatura, analizzare le fette attorno al punto di perforazione attraverso l'ippocampo dorsale (-1,70 mm a-2,70 mm rispetto il bregma) in un modo doppio accecato.
  15. Contano solo i neuroni di BrdU-positivi nella DG. Comprendono le cellule che si trovano all'interno di diametri 2-cellulari della cellula del granello nel conteggio.
    Nota: Qui, conteggio è stato effettuato usando un 40 X obiettivo di aria. Casualmente, 3-5 sezioni per animale sono stati contati, e i conteggi sono stati in media ed espresso come mezzi per DG19.

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Risultati

Dopo la stimolazione di HF-DBS per la sottoregione hippocampal di DG direttamente o la sottoregione PP per attivare il DG indirettamente tramite inserito elettrodi utilizzando le regolazioni stereotassica, i roditori sono stati anestetizzati con pentobarbital e campionate 3h dopo l'ultima stimolazione di HF-DBS per il c-fos e Notch1 immunostaining. Per la colorazione di BrdU, 36 h dopo l'ultima iniezione di BrdU dopo 1 o 5 giorni di stimolazione HF-DBS, i roditori sono s...

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Discussione

La tecnica di HF-DBS è stato ampiamente utilizzata come un potente strumento per il trattamento di molti disturbi neurologici dal 1990. Finora, il lavoro di pietra miliare di HF-DBS è per il trattamento della malattia di Parkinson e tremore essenziale, che ha attirato molta attenzione e interesse sia nella comunità scientifica e clinica. Ci sono vari tipi di studi di HF-DBS in corso da molti gruppi per applicazione terapeutica di HF-DBS in alcuni disturbi neurologici e psichiatrici32,

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Riconoscimenti

Supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali di sovvenzioni Cina 31522029, 31770929 e 31371149 (a Haitao Wu), programma 973 (2014CB542203) dal programma di sviluppo chiave dello stato per la ricerca di base della Cina (a Haitao Wu) e Grant Z161100000216154 dalla Beijing Municipal scienza e tecnologia della Commissione (a Haitao Wu). Gli autori ringraziano tutti i membri del laboratorio Haitao Wu per il loro incoraggiamento e discussioni. Gli autori sono estremamente grati al Zhenwei Liu per il suo aiuto con l'apparato di debug.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Brain stereotaxic instrumentStoelting51730DStereotactic intracranial implantation for mouse
StimulatorA-M systemsModel 3800MultiStim 8-Channel programmable stimulator
Dental drillerSaeshin Precision Co., LtdSTRONG 90For drilling and crainiotomy 
BurrMeisingerHM1 005#For drilling and crainiotomy 
Digidata 1550 DigitizerMolecular DevicesAXON 1550High-resolution data acquisition
CryotomeThermo Fisher ScientificThermo Cryotome FSECutting frozen sections of specimens
Confocal microscopeOlympusFV-1200Japan, with 20x Objective (NA 0.45)
Mouse surgery toolsF.S.T.14084-08,11254-20,16109-14Scissors, forceps, bone cutter, holders etc.
Pentobarbital sodiumR&D systems457920-50mg/kg for i.p. injection
Penicillin G Sigma-AldrichP303275,000 U for i.m. injection
CarprofenSigma-AldrichSML17135-10mg/kg, for s.c. injection
4% Paraformaldehyde (PFA)Beijing Solarbio Sci-Tech Co. P1110stocking solution for tissue fixation
Phosphate buffer (PBS)Invitrogen10010023pH7.4, 500ml in stocking
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura4583Formulation of water-soluble glycols and resins
anti-BrdU antibodyAbcamab6326Dilutions:1/800
anti-c-fos antibodyAbcamab209794Dilutions:1/500
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568)Thermo Fisher ScientificA11036Dilutions:1/500
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488)Jackson ImmunoResearch712-546-150Dilutions:1/500
Antifade mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Counterstaining with DAPI
anti-Notch1 antibody (C-20)Santa Cruz Biotechsc-6014Dilutions:1/50
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488)Abcamab150073Dilutions:1/1000

Riferimenti

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