In Vivo Sonde di microdialysis metodo di raccogliere grandi proteine extracellulari dal cervello liquido interstiziale con cut-off di alto peso molecolare

Riepilogo

Microdialisi in vivo ha permesso la raccolta di molecole presenti nel fluido interstiziale cerebrale (ISF) da animali svegli, comportarsi liberamente. Al fine di analizzare molecole relativamente grandi in ISF, l'attuale articolo si concentra in particolare sul protocollo microdialysis utilizzando sonde ad alto peso molecolare, tagliata le membrane.

Abstract

Microdialisi in vivo sono una tecnica potente per raccogliere ISF da animali svegli, comportarsi liberamente basati su un principio di dialisi. Mentre microdialisi sono un metodo collaudato che misura relativamente piccole molecole, tra cui gli aminoacidi o neurotrasmettitori, è stato recentemente utilizzato per valutare anche dinamiche di più grandi molecole in ISF utilizzando sonde ad alto peso molecolare, tagliato fuori membrane. Al momento utilizzando tali sonde, microdialisi deve essere eseguito in una modalità push-pull per evitare pressione accumulata all'interno delle sonde. Questo articolo fornisce dettagliate protocolli tra cui chirurgia stereotassica e come impostare linee di microdialysis per raccogliere proteine da ISF. Durante microdialisi, i farmaci possono essere somministrati sistemica o mediante infusione diretta in ISF. Microdialisi inversa sono una tecnica per infondere direttamente composti in ISF. L'inclusione di farmaci nel buffer di aspersione di microdialysis permette loro di diffondere in ISF attraverso le sonde mentre simultaneamente raccolta ISF. Misurando la proteina tau come un esempio, l'autore Mostra come i suoi livelli sono alterati all'attività di stimolazione di un neurone di microdialysis inverso di picrotoxin. Vantaggi e limiti di microdialysis sono descritte con l'applicazione estesa combinando altri metodi in vivo .

Introduzione

ISF comprende 15-20% del volume totale del cervello e offre un microambiente critico per la trasduzione del segnale, il substrato trasporto e sdoganamento dei rifiuti¹. Quindi, la capacità di raccolta ISF da animali viventi fornirà maggiori implicazioni per vari processi biologici come pure il meccanismo di malattia. Microdialisi in vivo sono uno dei pochi metodi quel campione e quantificare molecole extracellulari da ISF da sveglio, animali liberi di muoversi e servono quindi come uno strumento utile nel campo di ricerca neuroscienze^2,3. In questo metodo, sonde di microdialisi con membrane semipermeabili sono inseriti nel cervello e irrorati con buffer di perfusione alla portata relativamente lento (0.1-5 µ l/min). Durante la perfusione, molecole extracellulari in ISF passivamente diffondono la sonda secondo il gradiente di concentrazione e raccolgono un dializzato. Sebbene questo articolo si concentra sul metodo a campione ISF nel cervello, sia il principio che il metodo può essere applicati ad altri organi di modifica appropriata se necessario.

Microdialisi in primo luogo è stato impiegato nel 1960 e da allora è stato ampiamente utilizzato per raccogliere piccole molecole, tra cui gli aminoacidi o neurotrasmettitori nel cervello. Tuttavia, recenti disponibilità commerciale di microdialysis sonde con alto peso molecolare tagliato membrane (100 kDa-3 MDa) ha esteso la sua applicazione alle proteine relativamente più grandi in ISF come pure^{4,5,6 ,7}. Gli studi utilizzando queste sonde ha portato all'individuazione quello proteine tau o α-synuclein che a lungo sono stati pensati per essere esclusivo citoplasmico presentano anche come fisiologicamente in ISF^4,5,8.

Una delle difficoltà usando le sonde microdialisi con grande tagliata membrane (in genere oltre 1.000 kDa) è che sono più suscettibili alla perdita di liquidi dovuta alla pressione interna accumulata nelle sonde ultrafiltrazione. Microdialisi sonde utilizzate qui hanno una struttura unica per evitare questo problema. La pressione non sarà costruita a causa di questa struttura, così microdialisi con queste sonde devono essere operati in modalità "push-pull" utilizzando una pompa a siringa per irrorare le sonde (= push) e una pompa a rulli/peristaltica per raccogliere la venuta del dializzato dalla presa sonda (= pull) ⁹ (anche se ha bisogno di pompe sia push e pull, a causa della pressione annullando i fori di sfiato presenti le sonde, il sistema è tecnicamente solo guidato dalla pompa pull). Questo articolo inizia con la chirurgia stereotassica di un impianto di cannula guida e viene descritto come impostare le linee di microdialysis al fine di raccogliere ISF tramite sonde di microdialisi con 1.000 membrane di cut-off di kDa.

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali erano esaminati e approvati dal comitato di uso della Graduate School of Medicine presso l'Università di Tokyo e istituzionali Animal Care.

1. pre-chirurgico

1. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, pulire tutto con etanolo al 70% per mantenere condizioni di sterilità. Supporto termico utilizzando un termoforo è raccomandato.
2. Anestetizzare i topi tramite l'iniezione intraperitoneale di cloralio idrato (400 mg/kg). Confermare amputate eseguendo un pizzico di punta. Uso di meloxicam SR a induzione e buprenorfina al momento del ripristino BID per almeno 24 h è raccomandato.
3. Radersi i capelli con un clipper chirurgico. Difficoltà un mouse con il mouse e adattatore neonatale del ratto utilizzando barre di orecchio e un morsetto di naso.
   Nota: È fondamentale per assicurarsi che la testa del mouse è assicurata in questa fase e non si muove by-side.
4. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.

2. stereotassica chirurgia per l'impianto di Cannula Guida

1. Impostare il mouse e adattatore neonatale del ratto sull'apparato stereotassica. Fare un'incisione sagittally sulla pelle sopra il cranio usando un bisturi.　Pulire il sangue ed il tessuto connettivo sul cranio usando un batuffolo di cotone umido.
2. Determinare le coordinate per la regione del cervello di interesse utilizzando Atlante del cervello. Prima di iniziare le misurazioni, assicurarsi che tale linea mediana è dritta in modo che la punta del trapano può essere spostato A-P e rimanere sulla sutura mediana tutto il tempo.
   Nota: Questo articolo utilizza la coordinata (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm, D/v:-1,20 mm, 12 gradi) per indirizzare ippocampo posteriore.
3. Cranio di livello A-P
   1. Allegare un trapano su un manipolatore della cornice stereotassica. Abbassare il trapano fino a toccare delicatamente lambda e registrare le coordinate ventrale. Ripetere questa procedura per bregma.
      Nota: Quando il cranio è livellato, la misura verticale di bregma è uguale a quello di lambda. Se non, modificare di conseguenza l'altezza del morsetto di naso. Dopo il cranio ottiene livellato, registrare la coordinata antero/posteriore, laterale di bregma.
4. Livello cranio sinistra-destra
   1. Spostare il trapano dal bregma alla coordinata (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), abbassare il trapano al cranio e registrare la coordinata verticale. Quindi ripetere questa procedura per la coordinata (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm).
      Nota: Se il cranio è livellato, queste misurazioni verticali di due punti equidistanti dalla linea mediana sono uguali. In caso contrario, regolare l'altezza delle barre dell'orecchio.
5. Praticare un foro della bava con attenzione all'altezza delle coordinate di destinazione (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm) per impiantare una cannula di guida. Se il diametro di un foro della bava non è abbastanza grande per un impianto di cannula guida, praticare un altro foro che si sovrappone con quello primo. Praticare un altro foro sull'osso parietale di destra (lato controlaterale) e inserire una vite ossea, che aiuta a proteggere il cemento dentale in 1.10 (Vedi Figura 1B).
6. Tagliare un pezzo di chiusura circolare dal lato posteriore del coperchio di una provetta da centrifuga da 1,5 mL di una lama di rasoio e fare una 'corona '. Questa corona è utilizzata per impedire la diffusione alla pelle di cemento dentale. Posizionarlo sul cranio in modo che i fori della bava effettuati nel passaggio 2.5 soggiorno all'interno del cerchio (Vedi Figura 1).
7. Impostare un assembly stereotassica mettendo una cannula di guida sul braccio più corto di un adattatore stereotassica e fissarlo con un dado. Impostare il braccio più lungo dell'adattatore stereotassica sul morsetto elettrodo. Allegare il manipolatore dell'apparato stereotassica (Vedi Figura 1A).
8. Ruotare il gruppo di stereotax D-V sul braccio manipolatore di 12 gradi (Vedi Figura 1B). Spostare la cannula guida il foro della bava fatto in 1.6. Inserire la cannula di guida lentamente nel cervello di abbassandola di 1,2 mm.
   Nota: L'angolo della sonda è specifico dell'ippocampo; altre regioni possono richiedere altri angoli o nessun angolo a tutti. Consultare un Atlante del cervello per coordinate precise. Asciugare la superficie del cranio, perché se non il cemento non attaccherà e tappo di cemento può diventare sloggiato
9. Aggiungere il cemento dentale all'interno la corona per coprire integralmente sia la parte metallica della cannula di guida e la vite dell'osso abbastanza per fissarli. Applicare il cemento dentale aggiuntiva se c'è una parte del cranio esposto.
10. Attendere fino a quando il cemento dentale è completamente asciugato (~ 12-20 min). Rimuovere l'adattatore stereotassica dal morsetto elettrodo. Rimuovere il dado e sostituire l'adattatore stereotassica con una sonda testimone e fissare il dado.
11. Rilasciare il mouse dall'apparato stereotassica e ospitano il mouse da solo in una gabbia individuale.
    Nota: Il mouse non deve essere lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Controllare il mouse ogni giorno fino al giorno di microdialysis. Il mouse riceve NSAIDs quali carprofen, se sembra essere nel dolore. 2 settimane di attesa è necessario per gli studi di sonno-veglia quindi il mouse habituates per il nuovo ambiente¹⁰, ma altri tipi di studi possono richiedere periodi di recupero più brevi (ad es., 1-2 giorni).

3. Microdialysis Setup

1. Controllo di qualità delle sonde: riempire una siringa monouso da 1ml con acqua distillata waterand collegarlo alla presa (più breve porta) di una sonda utilizzando un tubo di Chester. Coprire i fori di sfiato con le dita e premere lo stantuffo della siringa delicatamente per infondere acqua alla sonda. Controllare che l'acqua appare dall'entrata della sonda e non vi siano perdite sulla superficie di una membrana di microdialysis.
   1. Attivazione delle sonde: immergere le membrane di una sonda in etanolo (70-100%) per due secondi. Quindi, infondere acqua distillata nella sonda nuovamente con una siringa nuovamente.
2. Preparazione del tampone di aspersione di: al fine di evitare l'adesione delle molecole bersaglio per i tubi, aggiungere BSA di diluire la soluzione di BSA 30% al 4% con artificiale CSF (1,3 mM CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 25mm NaHCO₃ , 122 mM NaCl, pH = 7,35), concentrazione di elettroliti nel CSF, immediatamente prima dell'uso che si avvicina. Il buffer di perfusione attraverso un'unità filtro siringa con 0,1 µm dei pori del filtro.
   Nota: 4% BSA migliora il recupero per attaccare le proteine ma può limitare severamente la consegna di composti, soprattutto per i composti che hanno alta BSA-associazione. Si tratta di un vantaggio di usare la concentrazione più bassa di BSA (ad esempio 0,15%) in taluni casi³. Si noti che BSA può aggregare molto facilmente quando agitato da piastra vortice o mescolare. Questi aggregati possono ostruire sonde o pori di membrana. Usare cautela quando si prepara una soluzione di BSA per limitare questa aggregazione
3. Preparare due linee separate per ingresso e uscita (Vedi Figura 1) e collegare entrambe le linee con un ago di connessione. Riempire una siringa monouso da 3 mL riempita con buffer di aspersione e collegarlo con il fine di ingresso del tubo utilizzando un ago smussato-fine. Riempire il tubo intero con buffer di aspersione eseguendo la pompa a siringa.
4. Arrestare la pompa a siringa e sostituire l'ago di connessione tra ingresso e uscita linea con una sonda per microdialisi attivato dal punto 3.3 (Vedi Figura 1). Prima di questa sostituzione, inserire il dado la sonda.
5. Montare il rullo di avvolgimento nel tubo di uscita della pompa a rulli. Avviare la pompa a siringa a 10 µ l/min e quindi la pompa roller alla portata leggermente più lenta (9.5-9.8 µ l/min). Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria nel tubo intero, che può influenzare il recupero quando entrano la sonda.
6. Anestetizzare il mouse dal punto 1.12 nello stesso modo come descritto al punto 1.2. Mettere il collare del mouse intorno al collo. Rimuovere il dado e la sonda testimone e lentamente inserire una sonda per microdialisi da 3,4 attraverso la cannula di guida e fissare il dado.
7. Posto il mouse nella gabbia collegato ad un sistema di movimento libero e di legare il mouse con il collare. Continuare a correre sia pompa a siringa e pompa roller alla portata indicata nel passaggio 3.5 per almeno 1 h.
   Nota: Per raggiungere collezione ISF da animali svegli, questo articolo utilizza un sistema di movimento libero, dove la gabbia stessa risponde al movimento di un animale per mantenere i tubings di torsione. In alternativa, il liquide girelle disponibile da varie aziende possono essere utilizzate anche.
8. Fermata del rullo pompa prima e poi la pompa a siringa. Impostare la portata desiderata. Eseguire la siringa pompa 20% più veloce rispetto alla pompa a rulli.
   Nota: per esempio, se si esegue a 1 µ l/min, azionare la pompa a siringa a 1.2 µ l/min portata ottimale dovrebbe essere determinata empiricamente per ogni molecola.
9. Raccolta dei campioni ISF: inserire l'estremità libera del tubo di uscita sul collettore frazione refrigerati.
   Nota: Volume di campione appropriato varia a seconda di analisi utilizzate per l'analisi.
10. Dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere la sonda. (Anestetizzare il mouse come necessario).  Gestire il recupero del mouse allo stesso modo come descritto al punto 2.11. Analizzare l'ISF raccolti da metodi quali HPLC o ELISA.
11. Per lavare il tubo intero dopo microdialisi, collegare ingresso e presa tubi nuovo sostituendo la sonda con la connessione dell'ago ed eseguire la candeggina diluita nel tubo intero e poi lavare con acqua. Asciugare e conservarla per un uso ripetuto.
    Nota: Altri tipi di tubi sono accettabili, tuttavia, BSA nel buffer di perfusione possa ostruire i tubi di piccolo diametro, così questi tubi sono considerati come monouso. I tubi possono essere logorati o intasato dopo molteplici usi, quindi assicuratevi di che la portata sia coerenza ogni volta prima dell'uso.

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Risultati

Per stimolare o inibire l'attività neuronale in inversa microdialysis^11,12,13, picrotoxin, antagonista del recettore GABA_A o tetrodotossina, antagonista di Na⁺ sono stati usati. È stato dimostrato che rilascio di tau è stimolato dall'aumento dell'attività neuronale^13,14. Coerente con queste osservazioni precedent...

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Discussione

Microdialisi con alto peso molecolare, tagliata le membrane deve essere operati da una modalità push-pull, pertanto è fondamentale che la portata è accurata e costante. L'imprecisione nei tassi di flusso può essere la causa della generazione di bolla di aria e incoerenza nella concentrazione del campione. Se il flusso è incoerente, controllare tutti i collegamenti per perdite. Se il problema persiste, potrebbe essere necessario ri-iniziare con tubi e nuove sonde.

Microdilaysis sonde sono ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Univentor 820 Microsampler	Univentor	8303002	Refrigerated fraction collector
Syringe pump	KD scientific	KDS-101
Roller pump	Eicom microdialysis	ERP-10
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1409	Free-moving system
Dual species cage kit	BASi	CX-1600
AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm)	Eicom microdialysis	PEP-8-02	Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical.
Microdialysis guide (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PEG-8
Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PED-8
Bone screw	BASi	MD-1310
Super bond C&B set	Sunmedical		Dental cement
Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console	Kopf	Model 940	Stereotaxic apparatus
Mouse and neonatal rat adaptor	Stoelting	51625
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting	51648
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A7284-50ML	30% BSA solution
FEP tubing (70 cm)	Eicom microdialysis	JF-10-70	Internal volume = 0.5 µL/cm
Teflon tubing (50 cm)	Eicom microdialysis	JT-10-50	Internal volume = 0.08 µL/cm
Byton tube	Eicom microdialysis	JB-30
Intramedic luer stab adaptor 23G	BD	427565	Blunt end needle
Roller tube	Eicom microdialysis	RT-5S	Internal volume = 4 µL
Cap nut	Eicom microdialysis	AC-5
0.25 mL microcentrifuge tube with cap	QSP	503-Q	Tubes for fraction collector
Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PESG-8
Connection needle	Eicom microdialysis	RTJ
Mouse animal collar	BASi	MD-1365
High Speed Rotary Micromotor kit	FOREDOM	K.1070	Drill
Picrotoxin	Sigma	P1675
Screw driver for bone screws
Scalpel
Cotton swab
Surgical clipper