L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

Abstract

Proteine in vivo sono spesso parte di grandi complessi macromolecolari dove specificità di legame e dinamiche in definitiva dettare uscite funzionale. In questo lavoro, la tossina antrace pre-endosomal è assemblata e transizione nel complesso endosomal. In primo luogo, il dominio N-terminale di un fattore letale mutante di cisteina (LF_N) è collegato a un biosensore di interferometria (BLI) biolayer attraverso il bisolfuro di accoppiamento in un orientamento Ottimo, permettendo prepore antigene protettivo (PA) associare (K_d 1 nM). Il LF_N-PA orientati in maniera ottimale_prepore complesso associa quindi a capillare morfogenetico gene-2 (CMG2) delle cellule superficiale recettore solubile (K_d 170 pM), risultante in un complesso di pre-endosomal rappresentante antrace, stabile a pH 7.5. Questo complesso assemblato viene sottoposta a rappresentante di acidificazione (pH 5.0) dell'ambiente endosoma tardivo per la PA_prepore di transizione allo stato dei pori della membrana inserita. Questo stato di_poro di PA si traduce in un'associazione indebolita tra il recettore CMG2 e il LF_N-PA del_poro e una sostanza dissociazione di CMG2 dal poro di transizione. Il thio-pignoramento di LF_N alla superficie del biosensore è facilmente invertito da ditiotreitolo. Riduzione sulla superficie del biosensore BLI rilascia il LF_N-PA_prepore-complesso ternario CMG2 o l'acido transizione complessi_poro LF_N-PA in microlitro volumi. Rilasciato complessi sono poi visualizzati e identificati usando la microscopia elettronica e spettrometria di massa. Questi esperimenti dimostrano come il montaggio/smontaggio cinetico di complessi proteici specifici utilizzando metodologie BLI privo di etichetta di monitorare e valutare la struttura e l'identità di questi BLI assemblati complessi da microscopia elettronica e massa spettrometria di, rispettivamente, utilizzando procedure sequenziale di facile--replicare.

Introduzione

Identificare e comprendere la specificità che disciplinano assiemi complessi della proteina in vivo è di estremo interesse per i ricercatori biochimici. Grande proteina eterogenea assembly sono la norma piuttosto che l'eccezione. Questa nozione è sostenuta tramite monitoraggio spettroscopico di in vivo assieme, isolando complessi utilizzando tecniche di rottura cellulare più delicati, valutazione dei prodotti da metodi di purificazione basato su affinità e visualizzazione di loro utilizzando ad alta risoluzione microscopia elettronica criogenica (cryo-EM). Per comprendere il controllo della specificità di montaggio all'interno della cellula, i ricercatori devono ordinariamente isolare, identificare e caratterizzare, in definitiva, queste strutture dinamiche di montaggio/smontaggio. Lo strumento maggiormente utilizzato molecolare per identificare i componenti di queste assemblee frequentemente richiede immunoprecipitazione anticorpo-basato, che si basa sul mantenimento della stabilità dei complessi durante la distruzione cellulare. Varie tecniche analitiche accoppiati sono stati recentemente sviluppati per catturare complessi da campioni di cellule utilizzando approcci di microfluidica basato, come risonanza plasmonica di superficie (SPR). A seguito di rimozione dalle superfici di SPR, questi campioni sono stati analizzati da tempo di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice di volo (MALDI-TOF)^1,2. Avanzando questa metodologia utilizzando protocolli più facile permetterà ai ricercatori di visualizzare e convalidare il predetti complessi che si verificano nell'ambiente cellulare. Poiché SPR è un sistema basato su microfluidica, problemi derivano spesso dalla formazione di aggregati. Eludere questo problema richiede diluizione del campione, che a sua volta, può fare diminuire l'integrità dei complessi biologici responsabili di concentrazione.

Un relativamente recente progresso nelle tecnologie privo di etichetta è lo sviluppo del biolayer interferometria (BLI) system³. Questi particolare riflettanza basati sulla luce, sistemi di replica, o meglio emulano, associazione SPR e cinetiche risultati ad una frazione del costo^3,4 specialmente se vengono utilizzate le unità a singolo canale. BLI misura i cambiamenti nei modelli di interferenza della luce riflessa tra un livello di riferimento (controllo) e la superficie di biolayer (sperimentale). Della variazione di fase è misurata in tempo reale una lettura quantitativa e cinetica⁵. La superficie di biosensore, contenente composizioni chimiche specifiche immobilizzazione, è fisicamente trasferita tra soluzioni, in contrasto con le modifiche di buffer di microfluidica approcci in SPR, per la misurazione tramite deviazioni di fase di lunghezza d'onda. Effetti del trasferimento di massa sono impediti agitando la soluzione. A differenza di SPR, questi sistemi sono molto utili nella valutazione dei complessi da campioni biologici grezzi. Il parametro fisico misurato durante gli esperimenti BLI principalmente dipende da un cambiamento in massa o spessore sulla superficie di biosensore che deriva dalla proteina complessa montaggio o smontaggio.

Questi biosensori ottici della fibra sono relativamente poco costoso e facile da usare. Uno degli aspetti emergenti utili di BLI è la facile rimozione dei complessi della proteina appena assemblato dalla superficie. Una recente applicazione di questo metodo ha permesso il nostro laboratorio per osservare la cinetica di tempo reale di pH su larga scala ha indotto la riorganizzazione struttura proteica del componente antigene protettivo (PA) tossina antrace come prepore (PA_prepore) la transizione al suo forma di poro (PA_poro). Questa transizione sulla punta biosensore è stata verificata mediante microscopia elettronica (EM)⁶. Rimozione dei complessi da superfici di biosensore evita effetti di diluizione volume più grandi incontrati frequentemente rilasciando complessi da superfici di chip quando si utilizzano sistemi microfluidici.

Nel lavoro attuale, complessi di tossina antrace sono montati e smontati sulla superficie del biosensore e quindi rilasciate microliter volumi. I componenti complessi risultanti vengono convalidati utilizzando ortogonalmente EM e spettrometria di massa (MS).

Protocollo

1. assemblaggio di complessi macromolecolari definiti su superfici di biosensore interferometria Biolayer (BLI)

1. Assemblea della tossina antrace prepore complessa su una superficie di biosensore reattiva per volta PDEA ammina
   1. Idrato di un'ammina reattiva secondo suggerimento di biosensore BLI generazione (AR2G) a 250 µ l di acqua per dieci minuti.
   2. Programmare tempi di passaggio, elencati nella tabella 1, il software di controllo dell'unità BLI (Vedi Tabella materiali).
   3. Avviare la BLI esegue immergendo la punta di biosensore in 250 µ l acqua per 30 s per misurare una previsione iniziale di biosensore spessore e densità.
   4. Attivare il biosensore immergendo la punta in 250 µ l 50 NHS (N-Idrossisuccinimide) e 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) per 7 minuti.
   5. Immergere il biosensore attivato in 50mm PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) disciolto in tampone borato 0.1 M (pH 8.5) per 5 minuti per generare una superficie attivata tiolo-reattive.
   6. Immergere il biosensore tiolo-reattive attivato in 250 µ l di soluzione contenente 100 nM E126C LF_N in 10 mM sodio acetato pH 5.0, NaCl 100 mM, buffer per 5 minuti.
   7. Immergere la punta di LF_N in 50mm L-cisteina, 1 M di NaCl, acetato di sodio 0,1 M, pH 5.0, per 4 minuti, per placare i gruppi tiolo-reattive gratis reattivi rimanenti.
   8. Immergere la punta di LF_N estiguuta in 50 mM Tris, 50 mM NaCl per 2 minuti per stabilire la linea di base di buffer.
   9. Immergere la punta di LF_N estiguuta in prepore di 0,5 µM antigene protettivo (PA_prepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl per 5 minuti per creare il LF_N-PA_prepore complesso.
   10. Una volta PA_prepore è associato, rimuovere il puntale dalla soluzione_prepore PA e immergere la punta in 50 mM Tris, 50 mM NaCl per 30 secondi per lavare via qualsiasi non specifico associato PA_prepore.
   11. Immergere il LF_N-PA_prepore complesso in ricevitore CMG2 a 0,5 µM (senza il dominio transmembrana), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, per 5 minuti.
   12. Immergere il LF_N-PA_{prepore -}CMG2 complesso in 50 mM Tris, 50 mM NaCl per 30 secondi per lavare via qualsiasi CMG2 non associato al modulo pre-endosomal complesso.
   13. Per l'analisi di EM, rilasciare il LF_N-PA_prepore-CMG2 complesso dalla punta biosensore immergendo la punta in 5 µ l di 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, all'interno di un tubo PCR.
   14. Per l'analisi di MS tandem dei peptidi dal complesso, rilasciare il LF_N-PA_prepore-CMG2 complesso dalla punta biosensore immergendo il biosensore in 5 µ l 50 mM DTT, 6m GuHCl (cheratina-free), 25 mM bicarbonato di ammonio a pH 8.0 all'interno di una PCR tubo . Questo viene eseguito su un biosensore diverso rispetto a quello utilizzato per l'analisi di EM.
2. Assemblea del poro tossina antrace complessa sulla superficie reattiva biosensore per volta PDEA ammina
   1. Per visualizzare il complesso dopo la transizione di pH, è necessario eseguire passaggi 1.1.1-1.1.12 nella sezione precedente per generare il LF_N-PA_prepore-CMG2 complesso.
   2. Immergere la punta del biosensore in un pH di acetato 10 mM 5.0 per 5 minuti per avviare la transizione della PA_prepore alla transizione_{del poro} di PA. Questa transizione è indicata aumentando l'ampiezza (circa 0,2 nm) seguita da un declino di ampiezza più grande che è supposto per essere dissociazione completa o sostanziale del recettore causa di diminuita affinità di legame.
   3. Immergere la punta_{del poro} di LF_N-PA in 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, per 30 secondi lavare via tampone acide.
   4. Per l'esempio di analisi di EM, immergere la punta del biosensore in una soluzione contenente micelle 1,25 mM (2,5 mM MSP1D1, 25mm Na-colato, 162,5 mM POPC) per 5 minuti per impedire l'aggregazione in soluzione dopo la pubblicazione di bisolfuro.
   5. Per l'analisi di EM, rilasciare il LF_N-PA_{poro -}micella complesso dalla punta biosensore immergendo la punta in 5 µ l di 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl all'interno di un tubo PCR.
   6. Per analisi MS tandem dei peptidi dal complesso, rilasciare il LF_N-PA_poore complesse (nessun micella) da biosensore suggerimento immergendo il biosensore in 5 µ l 50 mM DTT, 6 M GuHCl (cheratina-free), 25 mM bicarbonato di ammonio a pH 8.0 all'interno di una PCR tubo. Questo viene eseguito su un biosensore diverso rispetto a quello utilizzato per l'analisi di EM.

2. visualizzazione e convalida rilasciato macromolecolari assembly da BLI biosensori mediante microscopia elettronica macchia negativa

1. Bagliore di scarico una griglia di Cu 300 rivestita di carbonio. Bagliore tipico scarico impostazioni sono 0,38 mBar atmosfera stabile pressione, negativo 15 MAMP, 20 secondi, quindi di ventilazione con aria.
2. Griglia di sicuro tra un paio di pinzette pulite.
3. 4 µ l di campione complesso rilasciato in provetta PCR sulla griglia e consentire l'adsorbimento per 60s.
4. Stoppino distanza rimanente liquido con un cuneo di carta da filtro.
5. Macchia la griglia di pipettaggio 5 µ l di 0,75% 0,02 micron filtrata uranile formiato e wicking via macchia in eccesso dopo 5 secondi. Consentire la griglia ad asciugare a temperatura ambiente.
6. Mostra griglie macchiato campione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione.

3. identificazione di completa Pre-endosomal antrace tossina complesse (LF_N-Pa_prepore-CMG2) e spettrometria di massa utilizzando la transizione complessa (LF_N-Pa_poro senza CMG2).

1. Diluire i campioni rilasciati a 20 µ l e incubare per 1 ora.
2. Aggiungere 2 µ l di 55mm iodoacetamide, bicarbonato di ammonio di 25 mM, pH 8.0 e incubare per 1 ora a temperatura ambiente buio (coperto con carta stagnola).
3. Diluire il campione con 100 µ l di bicarbonato di ammonio di 25 mM, pH 8.0, per ridurre la concentrazione di cloridrato di guanidina sotto 1 M.
4. Aggiungere 5 µ l di sequenziamento della tripsina di grado per volta a 20 ng / µ l e incubare a 37 ° C durante la notte.
5. Aggiungere acido acetico glaciale a una concentrazione finale del 5% per ridurre il pH a < 3, allora ridurre il volume a 10 µ l in concentratore a vuoto.
6. Trasferire la soluzione del peptide in piatto del campione sull'autocampionatore della nLC 1200 uHPLC.
7. Caricare 5 µ l della soluzione di peptide su una colonna a fase inversa uHPLC montata sul palco ionizzazione del MS.
8. Lavare la colonna con 15 µ l di acido formico 0.1% a una velocità massima di 5 µL/min e/o pressione massima di 800 psi.
9. Eluire peptidi dalla colonna C18 controfase con una portata di 350 nL/min in un periodo di 90 min utilizzando un gradiente lineare del 5% al 40% di solvente B in A + B (acido formico di solvente a: 0,1%; solvente b: 95% acetonitrile con 0,1% di acido formico).
10. Analizzare medicati peptidi on line utilizzando tandem MS.
    1. Impostare la sorgente di ionizzazione a 2500 volt e temperatura di trasferimento di ioni a 250 ° C.
    2. Lo spettrometro di massa sotto controllo automatico di eseguire continuamente una scansione di MS seguita da altrettanti tandem MSMS possibili in un periodo di 3 s, di operare utilizzando CID e un'energia di collisione normalizzato di 35.
11. Identificare i componenti di peptidi e proteine usando i metodi standard. Per questo lavoro, sono state eseguite due serie di analisi di peptidi e proteine.

Risultati

La capacità di monitorare e convalidare l'Assemblea dei grandi complessi macromolecolari è un passo cruciale per comprendere la specificità e la funzionalità degli assembly grande biomolecolari. I risultati dei metodi presentati qui dimostrano la facilità con cui complessi proteici grande (> 150 kDa massa) può essere assemblato usando biolayer interferometria, tutto mentre monitoraggio la cinetica e l'ampiezza dell'Assemblea. La natura unica e compatta della superficie del biosensore consente l'analisi di montaggio sia esteso da rilasciando complessi montati in microvolumi piccolo. Questi microvolumi possono essere utilizzati per visualizzare la struttura fisica iniziale dei complessi utilizzando EM e per verificare l'identità dei componenti complessi utilizzando MS. Una descrizione schematica di questo intero processo è illustrata nella Figura 1.

Un elemento chiave per il corretto montaggio e la verifica del complesso macromolecolare sulla superficie del biosensore coinvolge il corretto orientamento della proteina seme iniziale. Questo assicura che i siti di interazione proteina-proteina sono accessibili, non stericamente bloccato e ottimamente posizionato lontano dalla superficie del biosensore. Come illustrato nella Figura 2, l'orientamento corretto della tossina antrace complessa è realizzato usando un frammento N-terminale specificamente progettato del fattore letale (LF_N) così il sito di legame del_prepore LF_N-PA è sempre posizionato opposto del biosensore covalente sito^6,7. L'accumulazione successiva del complesso con l'associazione di PA per il biosensore LF_N BLI seguito da solubile CMG2 associazione alla PA crea in definitiva una tossina antrace competente di traslocazione complesse.

La traccia di sensogram BLI è una lettura in tempo reale fuori i cambiamenti di ampiezza a causa dell'aggiunta specifico dei componenti di tossina antrace come vengono aggiunti sul biosensore. Figura 3 Mostra una traccia rappresentanza accoppiata con un modello del complesso preveduto per forma a quella fase del processo. Il primo aumento è LF_N carico sulla punta. Dopo tempra e della linea di base, PA_prepore associa quindi a LF_N seguita dall'aggiunta del recettore solubile CMG2 risultanti nel complesso assemblato pre-endosomal di LF_N-PA_prepore-CMG2. Per progredire verso l'ambiente endosoma tardivo, l'intero complesso è sottoposto ad un impulso di basso pH (pH 5.0) che indebolisce il recettore vincolante, permettendo la prepore alla transizione alla sua conformazione del poro della membrana estesa inserita. ⁶ Sensogram tracce del passaggio dell'acidificazione sono mostrate in Figura 4. Il poro estensione⁶ che devono verificarsi prima del grippaggio del ricevitore di CMG2 la diminuzione è probabilmente l'aumento iniziale o un 'spike' in ampiezza. Il più grande calo di ampiezza è più probabile dissociazione completa o sostanziale del ricevitore a causa della diminuita affinità. Il lavoro precedente in questo laboratorio indicato CMG2 vincolante per la PA completamente estesa_{del poro} è trascurabile rispetto al CMG2-PA_prepore interazione⁶. Inoltre, l'analisi cinetica di sensogram, osservata in tutte le sensograms di LF_N-PA_prepore-CMG2 transizioni a LF_N-PA_{dei pori} con una goccia di pH, è riproducibile su esecuzioni multiple.

Prima e dopo l'acidificazione, i complessi di biosensore attaccato facilmente vengono rilasciati per la visualizzazione di macchia negativa EM e identificazione di MS (Figura 5). Rappresentativi complessi dai risultati EM sono illustrati nella Figura 6. Griglie di campione pre-endosomal, mostrano densità coerente con complessi ternari intatti costituito da LF_N-PA_prepore-CMG2. Visualizza le reti complesse post-acidificazione, PA la transizione per poro e solubilizzato dall'inclusione di micella con nessuna densità CMG2 ovvia.

L'identità di pre- e post-acidificazione complessi sono stati verificati da MS. Un database dove le sequenze di PA, P13423; LF_N, P15917; e CMG2, P58335 sono stati inclusi in uno sfondo di un database di proteine di topo derivato dal repository NCBInr. Solo le proteine di interesse sono state ottenute da questa prima ricerca nel database, con la seguente copertura dell'amminoacido per i complessi binari e ternari: 54% e 22% per PA, 36% e 6% per LF e 43% per CMG2, rispettivamente (CMG2 non è stata rilevata sul complesso binario). Al fine di massimizzare la copertura dell'amminoacido della proteina, una seconda identificazione di peptidi/proteine è stata realizzata utilizzando un database di proteine contenenti solo le tre proteine di interesse. Pre-endosomal MS campioni contenevano peptidi da tutti i componenti di tre tossina con 60,46%, 67,97% e copertura 54.15% per LF_N, PA e CMG2, rispettivamente (Figura 7). Risultati post-endosomal, illustrati nella Figura 8, conteneva solo peptidi da LF_N e PA (copertura 57,41% e 67,79%, rispettivamente). La mancanza di CMG2 nei campioni post-endosomal sono coerenti con la diminuzione di nm BLI osservata durante la formazione del poro.

Figura 1. Schema generale per l'analisi dei complessi della proteina assemblati su e isolato da biosensore BLI utilizzando EM e MS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Attivazione di biosensore: primo passo in assembly specifico orientamento su biosensore BLI. Il dominio N-terminale del fattore letale E126C, (LF_N) è collegato tramite un thio-sollevatore creazione dell'interfaccia di associazione_prepore PA correttamente orientata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Monitoraggio dell'antrace tossina montaggio e smontaggio con BLI: il sensogram Mostra cambiamenti di ampiezza in funzione del tempo a causa di specifica aggiunta dell'antrace tossina componenti che vengono aggiunti sul biosensore a partire con il caricamento di LF_N (passaggio 4 in Tabella 1). PA_prepore viene quindi caricato sulla superficie seguita dall'aggiunta del recettore solubile CMG2. Il complesso di pre-endosomal assemblato è costituito da un LF-PA_prepore- CMG2. Per progredire verso l'ambiente endosoma tardivo, l'intero assemblaggio funzionale antrace tossina viene sottoposto ad un impulso di basso pH (pH 5.0) che indebolisce il recettore vincolante, permettendo la prepore alla transizione alla sua conformazione del poro della membrana estesa inserita. L'esposizione della membrana che attraversa il poro è confermata e solubilizzato con aggiunta di micelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. BLI sensogram della CMG2 release: le tracce del passaggio dell'acidificazione mostrano un aumento iniziale o 'spike' in ampiezza seguita da un declino di ampiezza più grande che sono probabili poro formazione e dissociazione del ricevitore, rispettivamente. Linee verticali rosse punteggiate indicano inizio di un nuovo passo. Sensograms sono allineati alla grassetto rosso linea punteggiata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Analisi dei complessi della proteina assemblati su e isolato da biosensore BLI utilizzando EM e MS: Biosensor allegate complessi sono facilmente rilasciate da 5 µ l di tampone contenente DTT per visualizzazione di macchia negativa EM e identificazione di MS. Clicca qui per Mostra una versione più grande di questa figura.

Nella figura 6. Visualizzazione dei complessi della proteina con EM: griglie di campione Pre-endosomal, mostrano densità coerente con complessi ternari intatti costituito da LF_N-PA_prepore-CMG2. Visualizza post-endosomal complesse griglie, PA la transizione per poro e solubilizzato di micella con nessuna densità CMG2 ovvia. Modelli di complessi predetti (lato sinistro) sono alla stessa scala come singole particelle mostrato. Particelle di colorized con proteina preveduta (basata su dimensione di densità EM) sono indicate sotto ogni particella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Verifica dei complessi della proteina con MS: Pre-endosomal MS campioni contenevano peptidi da tutti i componenti di tre tossina con 60,46%, 67,97% e copertura 54.15% per LF_N, PA e CMG2, rispettivamente. Peptidi rilevati ad un tasso di falsi scoperta (FDR) uguale o supera al 5% in giallo, FDR pari o superiori a 1% in verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8. Verifica dei complessi della proteina con MS: peptidi campioni contenuti Post-endosomal da LF_N e PA (copertura 57,41% e 67,79%, rispettivamente), ma non CMG2. FDR uguale o superiore al 5% in giallo, FDR pari o superiori a 1% in verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Passo	Tempo (s)	Descrizione
1	30	Previsione iniziale
2	420	Attivazione
3	300	Attivazione
4	300	CaricoN LF
5	240	Cisteina quench
6	120	Linea di base
7	300	Associazioneprepore PA
8	30	Linea di base
9	300	CMG2 associazione
10	30	Linea di base
11	300	Acido transizione
12	30	Linea di base
13	300	Associazione di micella

Tabella 1. Tempi di passaggio per singolo BLI eseguire di tossina antrace di assemblaggio complessa. Si noti che le linee di base vengono utilizzati per lavare via proteina non associata dal passaggio precedente e/o stabilire una nuova base di buffer.

Discussione

Questa dimostrazione viene illustrato come formazione di complessi macromolecolare possa essere facilmente monitorata utilizzando biolayer interferometria, visualizzato usando EM e verificati con MS, tutte con microvolumi in un breve lasso di tempo. Montaggio strutturale e osservati complessi seguire le previsioni biologicamente rilevanti, ulteriore convalida questa metodologia combinata. Come accennato nella sezione risultati, l'elemento chiave per il successo di assemblaggio richiede mutagenesi di cisteina razionalmente progettati per assicurare che le interfacce di complessi proteina-proteina sono correttamente orientate dalla superficie del biosensore.

Sistemi precedenti hanno utilizzato tecniche di BLI e MS per valutare il legame proteico di sistemi a due e tre componenti nonché l'integrità del grippaggio del ricevitore della proteina espressa, ma, in entrambi i casi, i metodi non sono stati sviluppati per sfruttare il tandem EM/MS ^8,9si avvicinano. Il solo altro interferometria sistema che MS analisi consentono di caratterizzare le interazioni combinata era un interferometria a doppia polarizzazione¹⁰. Purtroppo, questo sistema non è più disponibile per uso generale. Come accennato nell'introduzione, ci sono stati una serie di studi completato dove campioni erano formati sulle superfici SPR-come biosensore e rimosso da analisi MS. Nessuno di questi esempi è provocato da complessi visualizzati utilizzando EM.

Le limitazioni di questo metodo sequenza possono essere molteplici, ma sono risolvibili. Per l'immobilizzazione iniziale e quindi il passaggio di fondazione dell'Assemblea, una mancanza di conoscenza delle superfici strutturali interazione sarebbe certamente ostacolare il progresso connesso con monitoraggio fasi di montaggio iniziale. La mancanza di informazioni sulla struttura possa essere affrontata con la progettazione di un derivati dal fondamento costruire dove chimiche allegato (ad esempio solfidrilici frazione per legami disolfuro / His-Tag posizionamento) può essere spostato in diverse regioni all'interno del nucleo sistema di assemblaggio. Nel caso la tossina antrace complessa, è stata una fortuna che la struttura di LF_N associato a PA_prepore è disponibili¹¹. Posizionamento razionale della cisteina ingegnerizzata è stata localizzata alle regioni lontano dal viso di associazione_prepore PA. Con i prodotti chimici per sollevatore di cisteina, è preferibile che nessun altre cisteine reattivi sono presenti sulla superficie della proteina.

Ci sono vari processi chimici di attaccamento che possono essere utilizzati per progettare il sito allegato specifico sulle superfici di una proteina. Uno degli allegati specifici più popolari coinvolge posizionare una molecola di biotina in una posizione specificamente definita sulla superficie della proteina¹². Purtroppo, associazione di biotina streptavidina o avidina rivestito superfici è piuttosto stretto. Inversione dell'interazione associazione non è semplice. L'uso di un ingegnerizzati His-tag a N - o C-terminale e la conseguente facilità di allegato alle superfici Ni-NTA è un'applicazione più universale di immobilizzazione di affinità. Naturalmente, uno delle avvertenze per i siti di allegato Assemblea ingegneria con sistemi His-tag è il requisito che la N - e C-termini della proteina core Assemblea rimangono esposti e separati in modo che l'allegato è facile. Come con tutti i processi di assemblaggio, l'interfaccia di interazione della proteina core Assemblea deve rimanere disponibile il progredire di assiemi complessi.

Forse la preoccupazione più comune dell'utilizzo di composizioni chimiche superficiali biosensore è legame non specifico. Consigli di streptavidina sono spesso una fonte di effetti significativi legami aspecifici. Disolfuro collegato biotina può essere utilizzata per rilasciare complessi molto specifici, lasciando dietro di sé il collegamento S-biotina ridotto strettamente legato alla streptavidina immobilizzato biosensori¹³. Ci sono altre chimiche reversibili diventando disponibili come iminoboronates e a una minore misura ketoamide¹⁴. Questo campo è attualmente sottosviluppato, ma c'è grande interesse nell'ulteriore sviluppo di protocolli di covalenti reversibili per evitare effetti di tossicità della droga fuori bersaglio che comunemente accompagnano l'uso dello sviluppo di farmaci mirati covalente.

Una limitazione dell'utilizzo di EM di visualizzare complessi è interpretazione, soprattutto nel caso in cui le strutture dei complessi montati non sono inizialmente noti. La posizione spaziale dei componenti all'interno di un complesso macromolecolare assemblato non definito può essere identificata utilizzando anticorpi monoclonali (mAb) come marcatori specifici di cinetici e strutturali. Ad esempio, dopo aver formato un complesso, gli anticorpi monoclonali possono aggiungersi che si legano a componenti specifici. Questo metodo è spesso utilizzato in EM per identificare specifici componenti all'interno di grandi assiemi¹⁵. Un'altra limitazione è correlata alla dimensione del complesso, sebbene ci siano stati istanze dove definito assembly simmetrico piccolo come 70 kDa (GroES heptamer) sono facilmente risolto utilizzando negativo macchia EM. Assemblati complessi che vengono analizzati da EM sono tipicamente nell'intervallo di dimensioni di ~ 100 Å di diametro o superiore. Recentemente tuttavia, proteine piccoli come 20 kDa sono stati risolti e strutture di bassa risoluzione sono stati ottenuti quando si utilizza superior macchiatura metodologie¹⁶.

Per l'analisi di MS, la sensibilità aumentata della corrente MS strumentazione fino al livello di femtomolar (attomoles) può, in alcuni casi, aumentare la sensibilità del rilevamento di BLI. È altamente ipotizzabile che segnali di proteina che mostrano un aumento minimo ma ripetibile in ampiezze si tradurrà nell'identificazione della proteina in questione. Inoltre, interazioni proteina-proteina con uno dei partner attaccato il biosensore e l'altro in un ambiente cellulare di sondaggio in vigore si tradurrà in una purificazione e successivamente più facile individuazione del complesso appena formato. Una limitazione che può essere osservata con gli attuali sistemi MS altamente sensibili è che la proteina di interesse potrebbe non essere nel database, ma questa osservazione è rara (ad es., proteomi da specie rare). Se le sequenze delle proteine di interesse sono noti, questo problema è facilmente risolvibile inserendo la sequenza dell'amminoacido di proteine in un database di proteina di sfondo (come descritto in questo lavoro nella sezione protocollo). Un'altra limitazione potenziale della metodologia risultati dalla resistenza di una proteina a trypsinolysis. Digestione della tripsina è in genere il metodo predefinito per bottom-up identificazione della proteina. Tuttavia, le proteine possono essere resistenti a tripsina se mancano residui Arg e Lys o l'accesso a questi residui sono limitato dalla struttura piegata. Queste limitazioni sono stati risolti, rispettivamente, utilizzando alternativa o una combinazione delle proteasi o incluso un dispiegarsi del reagente (urea o guanidina HCl, come indicato in 1.1.14 e 1.2.6) prima digestione enzimatica.

Possibili espansioni di questa metodologia sono permettendo all'utente di seguire e identificare complessi cellulari Assemblea da lisati cellulari grezza. Si scopre test per componenti di assieme in estratti cellulari concentrati è facile da eseguire utilizzando le procedure di interferometria di biolayer. A differenza delle metodologie più comunemente usate microfluidici basato che sono inclini a intasamento e sensibili all'aggregazione, l'approccio BLI può essere utilizzato per immergere direttamente punte del sensore biolayer in estratti grezzi potenzialmente assemblare complessi specifici direttamente da questi campioni concentrati impuri. Una volta assemblato, è tutto fattibile utilizzare sonde di anticorpo specifico come un follow-up del sistema BLI per identificare ulteriormente e anche quantificare componenti sospetti negli estratti cellulari che sono stati identificati usando il metodo di microvolume MS. Ancora una volta, la chiave qui è di utilizzare proteine di nucleo definito, orientato correttamente come sonde specifiche affinità.

La possibilità di visualizzare il prepore per poro processo di transizione cineticamente con BLI sarà estremamente utile per identificare potenziali "anti-tossina" piccole molecole inibitrici di transizioni di proteine in particolare funzionano sotto tardi endosomal, basso pH (5.0) condizioni. Questo prepore pH indotta a poro di transizione è inibita in presenza di pieghevole stabilizzatore (osmoliti) come glicerolo o saccarosio e così presta forte sostegno per lo sviluppo di specifici mirati stabilizzatori pieghevoli che impediscono PA formazione_{dei pori} . Questo approccio specifico evita e sostituisce greggi saggi basati su aggregazione dove il pH scende portano alla precipitazione della proteina. Quest'ultimo metodo, anche se buono per metodi primari di preselezione, spesso porta a risultati falsi positivi dove specifici composti inibiscono l'aggregazione piuttosto che le transizioni molecolari effettive.

Le osservazioni a valle della struttura e l'identificazione dei singoli componenti assemblati all'interno di microvolume piccoli campioni può essere anche utile nella convalida potenziali composti di piombo. Questo può essere applicato in casi dove la stabilizzazione dell'assembly specifico o destabilizzazione è il risultato di destinazione. Questo approccio parallelo cinetica/struttura/identificazione è utile per la conferma direttamente la validità di piombo sospetta composto effettori dell'Assemblea e serve come un passo ragionevole selezione secondaria o approccio medie velocità effettiva.

Cryo-EM è una tecnica utile per studiare i dettagli atomici dei complessi della macromolecola in vari Stati dell'Assemblea. Prima di preparare campioni di cryo-EM, è importante verificare innanzitutto che una preparazione contiene complessi ragionevolmente puri omogenei con macchia negativa EM. Il lavoro presentato qui dimostra assemblaggio dei complessi della proteina sulle superfici di biosensore BLI, rilascio di questi complessi per la visualizzazione di EM e l'identificazione di questi componenti utilizzando MS. Questa particolare metodologia di assemblaggio controllato e rilascio può essere utile per generare protocolli molto specifici che migliorano la preparazione dei campioni sequenziali omogeneo per macchia negativa EM, un passo necessario che deve essere dimostrato prima di passare alla Cryo-EM. Per ottenere la struttura 3D di bassa risoluzione, solo il 30-50 particelle del complesso sarebbero necessario eseguire una serie di inclinazione conico (70 visualizzazioni di diverse immagini 2D per particella) in dotazione c'è diversità di orientamento (più diversi punti di vista).

Per quanto riguarda migliorare metodi MS, progressi nella sensibilità e riduzione del volume del campione continuano a migliorare. Flussi di nano e la cromatografia liquida ultra-alta pressione insieme allo sviluppo di spettrometri di massa con un dazio veloce ciclo, maggiore sensibilità e potere risolutivo. Recente introduzione dello spettrometro orbitrap, in particolare l'ultima versione (orbitrap Fusion Lumos ed il relativo successore previsto il Orbitrap Fusion Lumos 1m) così come gli algoritmi di ricerca notevolmente facilitano questo processo.

La metodologia attuale monitora la cinetica montaggio e smontaggio di componenti di tossina antrace utilizzando metodologie BLI privo di etichetta e valuta la struttura e l'identità di questi componenti utilizzando EM e MS, rispettivamente. L'uso di un semplice singolo canale sistema BLI accoppiato con analisi EM la macchiatura negativa di routine e tecniche elementari di MS sono più che sufficienti per caratterizzare un processo di assemblaggio.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0.5 mL black microtubes	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å	ThermoFisher Scientific	164561
Acetic acid glacial	Fisher	A38SL-212
Acetonitrile	Fisher	A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips	Forte Bio	18-5092
Ammonium bicarbonate	Fisher	A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
Boric acid	Fisher Scientific	10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2			Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid	Electron Microscopy Sciences	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
Formic acids	JT Baker	0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Iodoacetamide	MP-BioMedicals,LLC	100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain			Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system	Ted Pella, Inc	91000
Protective Antigen prepore			Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles	Fisher Scientific	09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sequest HT search engine	ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	BP334-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Sodium cholate	Sigma-Aldrich	C1254-100G
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Uranyl formate (UF)	Electron Microscopy Sciences	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487