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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui abbiamo dettaglio un metodo per l'imaging di cellule vive di esocitosi regolata. Questo metodo utilizza FITC-Destrano, che si accumula in organelli lisosoma-correlati, come reporter. Questo semplice metodo permette anche di distinguere tra diverse modalità di esocitosi regolata in cellule che sono difficili da manipolare geneticamente.

Abstract

Esocitosi regolamentato è un processo mediante il quale carico, che è memorizzato nei granuli secretori (SGs), viene rilasciato in risposta a un trigger secretivo. Esocitosi regolata è fondamentale per la comunicazione intercellulare ed è un meccanismo chiave per la secrezione di neurotrasmettitori, ormoni, mediatori infiammatori e altri composti, da una varietà di cellule. Almeno tre meccanismi distinti sono noti per esocitosi regolata: esocitosi completo, dove un singolo SG si fonde completamente con la membrana plasmatica, bacio-e-faccia funzionare l'esocitosi, dove un singolo SG transitoriamente si fonde con la membrana plasmatica, e composto esocitosi, dove diversi SGs fusibile con a vicenda, prima o dopo la fusione di SG con la membrana plasmatica. Il tipo di esocitosi regolata intrapresa da una cella è dettato spesso dal tipo di trigger secretiva. Tuttavia, in molte cellule, un singolo trigger secretivo può attivare contemporaneamente più modalità di esocitosi regolata. Nonostante la loro abbondanza e importanza attraverso specie e tipi di cellule, i meccanismi che determinano i diversi modi di secrezione sono in gran parte irrisolti. Una delle sfide principali nell'investigare le diverse modalità di esocitosi regolata, è la difficoltà di distinguere tra di loro così come esplorare loro separatamente. Qui descriviamo l'uso di isotiocianato di fluorescina (FITC)-destrano come un reporter di esocitosi e live cell imaging, per distinguere tra le diverse vie di esocitosi regolata, concentrandosi su composto esocitosi, basata sulla solidità e durata degli eventi esocitica.

Introduzione

Regolamentato l'esocitosi è il meccanismo principale da cui prontamente fatta carico viene rilasciato da una cellula secretiva in risposta a un trigger specifico. Il carico è pre-formato e sequestrato in vescicole secretorie, in cui è memorizzato fino a quando un trigger inoltra il segnale per il rilascio di contenuti la SGs. Diversi tipi di segnali possono derivare in diverse modalità di esocitosi regolata, o diverse modalità di esocitosi regolata può verificarsi contemporaneamente. Sono noti tre modalità principali di esocitosi regolata: esocitosi completo, che prevede la fusione completa di un singolo granello secretivo con la membrana plasmatica; bacio-and-run esocitosi, che comporta la fusione transitoria del granulo secretivo con la membrana plasmatica seguita da suo riciclaggio; ed esocitosi composto, che è caratterizzata dalla fusione di homotypic di diversi prima di SGs (cioè, granularità esocitosi) o sequenziale (cioè, esocitosi sequenza) alla fusione con la membrana plasmatica1. Esocitosi composto è considerata la più ampia modalità di carico release2, poiché permette la rapida secrezione di carico, comprese quelle provenienti da SGs che si trovano distale dalla membrana del plasma. Esocitosi composto è stato documentato in sia cellule esocrine ed endocrine3,4,5,6,7,8,9, così come in cellule del sistema immunitario. In cellule immuni, come gli eosinofilo10,11,12 e neutrofili13, esocitosi composto permette il rilascio veloce e robusto di mediatori che sono necessari per uccidere gli agenti patogeni d'invasione come batteri o parassiti. Mastociti (MCs) distribuire esocitosi composto per l'efficiente rilascio dei mediatori infiammatori pre-memorizzati durante la risposta immune innata, anafilassi e altre reazioni allergiche14,15,16 , 17. Poiché le diverse modalità di esocitosi può accadere simultaneamente18,19, è diventato una sfida per distinguere tra loro in tempo reale o per identificare i loro macchinari rispettivi fusione, quindi delucidamento i meccanismi di fondo.

Qui presentiamo un metodo, basato su cellule vive imaging della cella caricato FITC-Destrano, che permette l'inseguimento in tempo reale degli eventi di esocitica e la distinzione fra loro diverse modalità. In particolare, il nostro metodo consente il monitoraggio esclusivo composto esocitosi.

FITC-Destrano è un coniugato del fluoroforo pH sensibili FITC con il destrano del polisaccaride di glucano. Destrani fluorescente identificati sono stati indicati per entrare nella cellula di micropinocytosis20,21 e Macropinocitosi22,23. Come scomparti endocitico maturo lisosomi, è stato dimostrato che FITC-Destrano si accumula nel lisosoma senza apparente degrado. Tuttavia, poiché FITC è un fluoroforo altamente sensibili al pH24, e il lume del lisosoma è acido, fluorescenza FITC-Destrano disseta dopo aver raggiunto il lisosoma24. Così, che istituisce i destrani come lisosoma mirati carico, insieme con la sensibilità di pH del FITC, hanno posto le basi per l'utilizzo di FITC-Destrano negli studi del lisosoma esocitosi25,26,27 , 28 , 29.

In diversi tipi cellulari, MCs, neutrofili, eosinofili, cellule di T citotossiche, melanosomi e altri, la SGs lisosomiali caratteristiche dell'esposizione e sono classificati come organelli lisosoma-correlati (LROs) o secretiva lisosomi30,31 . Poiché LROs hanno un pH acido luminal, FITC-Destrano può essere utilizzato per visualizzare loro esocitosi, come risultato più alto pH connesso con l'esteriorizzazione della LROs. Infatti, FITC-Destrano è stato usato per monitorare esocitosi in MCs18,32,33. In questo metodo, FITC-Destrano è aggiunto alla coltura delle cellule, preso dalle cellule di pinocitosi e ordinato in SGs. Come è nei lisosomi, fluorescenza FITC è spenta in SGs quando sono all'interno della cellula. Tuttavia, sulla fusione di SG con la membrana plasmatica e la conseguente esposizione all'ambiente esterno, il FITC-Destrano riacquista relativa fluorescenza come gli aumenti di pH di SG, permettendo che il semplice rilevamento di eventi esocitica da microscopia di cellule vive. Qui, abbiamo regolato questo metodo per abilitare il rilevamento univoco composto esocitosi.

Due altri metodi sono stati utilizzati in precedenza per tenere traccia di esocitosi composto. La microscopia elettronica è stato il primo metodo per la caratterizzazione di strutture di esocitica che ha suggerito l'avvenimento di diverse modalità di esocitosi. In particolare, le osservazioni di "tunnel secretiva" in cellule acinose pancreatiche34 e MCs35,36,37 ha dato luogo all'ipotesi di esocitosi composto. Tuttavia, mentre l'alta risoluzione di microscopia elettronica ha il potere di rivelare le vescicole fuse, non può tenere traccia le dinamiche della loro fusione e quindi non è possibile definire se essi corrispondono a fusione SG durante esocitosi composto o fusione di granuli riconquistate seguendo il loro endocitosi. Questo ostacolo è stato superato in altri metodi che possono misurare esocitosi in cellule viventi, quali misure del morsetto di toppa della membrana plasmatica capacitanza11,13,38,39 o amperometria 40 di media. Tuttavia, patch di bloccaggio richiede una speciale messa a punto e potrebbe non essere adatto per tutti i tipi di cellule. Amperometria misurazioni sono in grado di monitorare l'esocitosi solo se il carico viene rilasciato nella prossimità molto vicina all'elettrodo. Pertanto, facendo uso di live cell imaging offre un vantaggio rispetto a questi metodi, permette non solo di inseguimento in tempo reale di esocitosi, ma permette anche di semplice e rapida acquisizione di dati da tutta la cella.

Il tracking di FITC-Destrano da microscopia diretta cella offre anche alcuni vantaggi per altre cellule vive metodi basati su formazione immagine. Ad esempio, un metodo ampiamente utilizzato è la microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM) di cellule caricate con una sonda fluorescente di SG o esprimendo una fluorescente proteina-etichetta SG cargo o membrana proteina26,41, 42 , 43. la forza di questo metodo risiede nella sua capacità di monitorare esclusivamente gli eventi che si verificano vicino alla membrana plasmatica (in appresso come ingombro), quindi esocitica eventi. Tuttavia, questo è anche lo svantaggio di questo metodo, perché solo la frazione di cella che è adiacente il coprioggetto e vicino alla lente del microscopio può essere imaged44. Se tali impronte rappresentano infatti la superficie intera membrana delle cellule è ancora discutibile45,46,47. A questo proposito, utilizzando un colorante pH sensibili quali FITC-Destrano e un microscopio a fluorescenza standard o un microscopio confocale con un foro stenopeico aperto permette la formazione immagine della cella intera, catturando così il parete totale eventi che si verificano in quella cella.

Ulteriori reporter di pH sensibili che vengono utilizzati per studiare esocitosi regolata da formazione immagine intera cellula o TIRFM includono carico SG o proteina di membrana di SG fusa a phlourin, una variante GFP sensibili al pH. Gli esempi includono NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin e synapto-phluorin48,49,50,51,52. Mentre l'espressione di queste sonde può rappresentare più da vicino la composizione endogena di SGs, esso comporta la transfezione delle cellule e può quindi essere meno adatto per le celle che sono difficili a transfect. Pertanto, durante lo studio delle celle che sono difficili a transfect o in condizioni sperimentali che richiedono più manipolazioni genomiche, l'uso di un composto che può essere semplicemente integrato nel terreno di coltura cellulare, ad esempio FITC-Destrano, è vantaggioso . FITC-Destrano offre anche un vantaggio sopra arancio di acridina (AO), un altro colorante di pH sensibili che è stato utilizzato per il rilevamento di esocitosi di cellule vive microscopia53,54,55,56 , 57 , 58. AO è stato indicato per indurre la fotolisi di vescicole che risultato in lampi di falsi, che non corrispondono alla secrezione effettiva processi di27. Al contrario, FITC-Destrano riflette meglio eventi di secrezione, probabilmente a causa della sua bassa produzione foto-indotta di ossigeno reattive27.

In particolare, un approccio alternativo per lo studio di esocitosi è monitorando l'afflusso di un colorante, dal supporto esterno in SG attraverso il poro di fusione che si apre durante questo processo. In questo caso, il colorante viene aggiunto al mezzo esterno a fianco il grilletto secretivo. Poi, quando si apre il poro di fusione, la tintura si diffonde in SG59,60. Un chiaro vantaggio di questo metodo è che esso offre anche la possibilità di stimare la dimensione dei pori di fusione, mediante l'uso di coloranti di dimensioni variabili. Ad esempio, destrani di diverso peso molecolare (MW), coniugati a fluorofori diversi, possono essere utilizzati come coloranti extracellulare, per cui la dimensione massima di destrano che possa penetrare la SG corrisponderebbe alla dimensione del poro fusione59, 61 , 62 , 63 , 64. Inoltre, questo approccio non richiede l'uso di una sonda di pH sensibili. Tuttavia, uno svantaggio significativo è che il rapporto segnale-rumore è molto basso, poiché una grande quantità di colorante è presente nei mezzi di comunicazione durante l'acquisizione delle immagini, con conseguente elevato background.

Nel complesso, l'uso di FITC-Destrano come indicatore per esocitosi supera diversi inconvenienti nei metodi precedentemente segnalati, come segnale/rumore rapporto, tossicità, tracciabilità dinamica e complessità.

Qui descriviamo l'uso di FITC-Destrano per monitorare composto esocitosi nella linea RBL - 2H 3 delle cellule di albero (di seguito definita come RBL, principalmente fondata da Eccleston et al. 65 e ulteriormente clonato da Barsumian et al. 66), in risposta all'immunoglobulina E (IgE) / attivazione dell'antigene (Ag).

Protocollo

1. preparati

  1. Preparazione di terreni di coltura RBL
    1. Mix da 500 mL di glucosio basso Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) con 56 mL di siero bovino fetale (FBS), 5,5 mL di soluzione di penicillina-streptomicina-nistatina, 5,5 mL di soluzione di L-glutamina 200 mM. Ciò si traduce in glucosio basso DMEM completati con 10% FBS, 100 µ g/mL di streptomicina, 100 unità/mL di penicillina, 12 unità/mL nistatina e 2 mM L-glutammina.
    2. Filtrare i media utilizzando un filtro alto-vuoto di 0,22 µm diametro dei pori e negozio a 4 ° C.
  2. Manutenzione delle cellule RBL.
    1. Crescere le cellule RBL a un confluency di massima del 90% in un piatto di 10 cm. Se la coltura delle cellule è sana, le cellule dovrebbero avere una forma di mandrino con sporgenze occasionale.
    2. Per cella spaccare, staccare le cellule dal piatto aspirando i media e sostituendo con 2 mL di soluzione di EDTA/antitripsina B. Incubare per 5-10 minuti in atmosfera umidificata di 5% CO2 a 37 ° C.
    3. Una volta che le cellule hanno staccato, neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 mL di terreni di coltura, utilizzando una pipetta e dividere le celle in un 1:2-1:10 ratio.
  3. Preparazione del tampone di Tyrode 20x
    1. Preparare un brodo 20 soluzione di 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl e 8mm NaH2PO4 in doppia acqua distillata (DDW). Mescolare bene e conservare a 4 ° C.

2. coltura di cellule RBL per microscopia di cellule vive

  1. Preparazione della soluzione di FITC-Destrano.
    1. Mescolare 1 mg di polvere di FITC-Destrano (150K) per 1 mL di terreno di coltura (Vedi punto 1.1.1). Per un completo coprioggetto chambered, preparare 3 mL.
    2. Utilizzando un'unità di filtro siringa di acetato di cellulosa con porosità di 0,22 µm, filtrare il disciolto FITC-Destrano.
    3. Aggiungere mouse IgE a una concentrazione di 1 µ g/mL.
  2. Semina di cellule RBL per l'imaging
    1. Il giorno prima di formazione immagine, aspirare i media dalla piastra di coltura e sostituire con 2 mL di soluzione di EDTA/antitripsina B. Incubare per 5-10 minuti in atmosfera umidificata di 5% CO2 a 37 ° C. Una volta che le cellule hanno staccato, neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 mL di terreno di coltura.
    2. RBL conteggio celle utilizzando un emocitometro e regolare di conseguenza il volume con terreni di coltura per ottenere una concentrazione di cellule di 7,5 x 105/ml.
    3. Aggiungere 10 µ l di sospensione cellulare per un coprioggetto chambered pre-riempita con fresco FITC-Destrano completati terreni di coltura (in questo modo semina di 7,5 x 103 celle in una camera).
    4. Crescere le cellule RBL durante la notte in un'atmosfera umificata di 5% CO2 a 37 ° C. Le cellule dovrebbero rimanere a un livello sub-confluente al fine di assicurarsi che le cellule sono separate e che è facile da identificare ogni cella singolarmente sotto il microscopio.
  3. Transfezione di cellule RBL - facoltative.
    1. Per esocitica eventi in combinazione con altre proteine fluorescente contrassegnati di imaging, vedere protocollo di transfezione di cellule RBL in Azouz et al. 67

3. tensione delle cellule microscopia di esocitosi

  1. Preparazione delle soluzioni:
    1. Preparare la soluzione tampone di un finale Tyrode diluendo la soluzione di riserva in DDW in un 01:20 supplemento con 20 mM Hepes a pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA e 5,6 mM glucosio e diluizione.
    2. Appena preparare un reagente secretagogo 20x nel buffer di Tyrode [1 µ g/mL dinitrophenyl coniugata all'albumina sierica umana (DNP-ha (Ag)) nel nostro caso, per una concentrazione di 1 x di 50 ng/mL].
    3. Preparare una soluzione di cloruro di ammonio di 400 mM dalla dissoluzione della polvere nel buffer di Tyrode.
  2. Preparazione delle cellule.
    1. Lavare il coprioggetto chambered 3 volte, aspirando i media dalla camera e riempirlo con 300 µ l di tampone di Tyrode, preriscaldata a 37 ° C. Infine, riempire la camera con 300 µ l di tampone di Tyrode, preriscaldata a 37 ° C.
    2. Porre il coprioggetto chambered nella camera di incubatore del microscopio. Assicurarsi che la camera sia stabile.
  3. Impostazione del microscopio
    1. Per scegliere una regione di interesse per tenere traccia, accendere la sorgente luminosa fluorescente (tradizionalmente una lampada a mercurio) e scegliere il filtro appropriato fluorescenza (scegliere il filtro per fluorofori verde per la visualizzazione di FITC-Destrano). Una volta che la regione di interesse è a fuoco e si trova al centro del campo visivo, spegnere la sorgente di luce per evitare foto-candeggio e tossicità.
      Nota: Alcuni del FITC-Destrano incorporato nelle cellule possono mantenere fluorescenza. Questo è perché FITC-Destrano può anche essere ordinato ai compartimenti non lisosomiali quali gli endosomi.
    2. Accendere l'illuminazione appropriata per l'eccitazione del FITC. Se si usa un microscopio basate su laser, accendere il laser 488 nm. Emissione dovrebbe essere raccolti intorno a 500-550 nm (FITC picchi di emissione a 510-520 nm).
    3. Quando si utilizza un microscopio confocale, aprire il foro stenopeico al massimo. Questo consentirà utilizzando tossicità e bassa potenza del laser per evitare lo sbiancamento e garantirà la cattura di eventi di esocitosi da tutti i piani della cella.
    4. Calibrare l'intervallo di tempo tra acquisizioni di immagine.
      1. Cellule differenti possono variare nella loro cinetica di esocitosi regolata68. Per l'imaging specifiche di esocitosi composto, si consiglia un intervallo di tempo di almeno 5 secondi. Tuttavia, come regola generale, per consentire la formazione immagine veloce, assicurarsi che che il tempo di acquisizione di un singolo fotogramma è veloce.
      2. Quando si utilizza un microscopio confocale a scansione laser, impostare la direzione di scansione di bi-direzionale, non consentono una media e impostato la risoluzione a 512 x 512 (consigliata; queste ultime due disposizioni contribuirà inoltre a ridurre al minimo lo sbiancamento e tossicità).
  4. Formazione immagine di esocitosi.
    1. Celle di immagine per durate desiderate, a seconda del tipo di cellula o secretagogo. In cellule RBL innescate con IgE/Ag, la maggior parte esocitica eventi si verificano entro 15-20 min di attivazione.
    2. Per l'attivazione delle cellule, aggiungere 16 µ l dalla soluzione di secretagogo 20x alla camera.
  5. Confermando la presenza di FITC-Destrano nelle cellule.
    1. Per confermare la presenza e localizzazione di FITC-Destrano a SGs, aggiungere 16 µ l di soluzione di cloruro di ammonio (fare attenzione a non spostare la camera per non perdere la messa a fuoco) alla camera delicatamente (questo farà una concentrazione finale di 20 mM). Questo indurrà alcalinizzazione del SGs e dequenching della fluorescenza di FITC, che avverrà in pochi secondi.

Risultati

Figura 1a rappresenta schematicamente come FITC-Destrano può agire come un reporter per regolato esocitosi e ricapitolare le diverse modalità di esocitica eventi. In primo luogo, le cellule vengono incubate con FITC-Destrano, che è interiorizzato dal pinocitosi e ordinato per la SGs. Poiché il SGs di MCs sono LROs, loro basso pH smorza la fluorescenza del FITC, mostrato qui granuli di colore nero (A-C, I). Quando le cellule sono innescate da un secretagog...

Discussione

Qui descriviamo come tracciatura la fluorescenza di FITC-Destrano caricato in SGs può essere utilizzata in particolare acquisire eventi composto esocitosi. Questo è stato ottenuto impostando il microscopio per acquisire un'immagine ogni 15 secondi, garantendo così che verranno registrati solo gli eventi di lunga durata nel tempo, e pertanto escluse brevi eventi che corrisponderebbero a esocitosi completo o bacio-and-run esocitosi. Per stabilire il metodo, abbiamo mostrato che atterramento delle isoforme Rab5 che sono ...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrenti

Riconoscimenti

Ringraziamo il dottor U. Ashery per il generoso dono di cDNA. Ringraziamo d. ssa G. massa, L. Mittleman, M. Shaharbani e Y.Zilberstein dal centro di Imaging molecolare e Sackler cellulare per la loro preziosa assistenza con microscopia. Quest'opera è stata sostenuta da Stati Uniti d'America-Israele binazionale Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel e S.J.Galli) e concedere 933/15 della Israel Science Foundation, fondata dall'Accademia Israele per le scienze (a R.Sagi-Eisenberg ) e sovvenzioni NIH U19 AI 104209 e AR067145 R01 (a S.J. Galli).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM low glucoseBiological Inductries01-050-1A
Fetal bovine serumGibco12657
Pen-strep-nystatin solutionBiological Inductries03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution Biological Inductries03-020-1A
FITC dextran 150KSigma-Aldrich46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution BBiological Inductries03-052-1AWarm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size Sigma-AldrichCLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore sizeSartorius16534K
Chambered coverglass Thermo scientific155411
Corning tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503
Anti-DNP monoclonal IgESigma-AldrichD8406
DNP-HSA (Ag)Sigma-AldrichA6661 Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4Biological Inductries03-025-1B
CaCl2MERK102382
GlucoseBDH Laboratories284515V
Ammonium chlorideMERK1145
PIPES dipotassium saltSigma-Aldrich108321-27-3
Calcium acetate hydrateSigma-Aldrich114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)Sigma-AldrichG1501
NaH2PO4MERK6346
NaClMERK106404
MgCl2MERK105833
KClMERK104936
Electroporator BTXECM830
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 5 Pascal, Axiovert 200MUsed in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 800, Axio Observer.Z1 /7Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, LeicaLeicaSP5Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cellsRBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

Riferimenti

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