Formato di Acinus ghiandola Hypopharyngeal misurazione in lavoratori ape del miele (mellifera di Apis)

Riepilogo

Dimensione di acinus ghiandole ipofaringee è una misura robusta di nutrizione di ape miele infermiera. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per dissezione, colorazione, imaging e misurazione dei acini infermiera ape hypopharyngeal ghiandola.

Abstract

Le ghiandole ipofaringee infermiera producono la frazione proteica del lavoratore e pappa reale che viene alimentata per lo sviluppo di larve e regine. Queste ghiandole accoppiate che si trovano nella testa dell'ape sono altamente sensibili alla quantità e qualità del polline e polline sostituisce che consuma l'ape infermiera. Le ghiandole diventano più piccole quando gli infermieri sono alimentati le diete carenti e sono grandi quando sono alimentati le diete complete. Perché infermiere hypopharyngeal ghiandola dimensione è un indicatore robusto di nutrizione di infermiera, è essenziale che coloro che studiano miele ape nutrizione sanno come misurare queste ghiandole. Qui, forniamo metodi dettagliati per dissezione, colorazione, imaging e ghiandole ipofaringee delle API di infermiere di misura. Vi presentiamo i confronti del tessuto macchiato e non macchia e dati che sono stati usati per studiare l'impatto di polline sulle dimensioni della ghiandola. Questo metodo è stato utilizzato per testare come dieta impatti dimensioni ghiandole ipofaringee ma ha ulteriore uso per comprendere il ruolo di queste ghiandole nella salute di alveare.

Introduzione

API del miele sono essenziali per l'agricoltura perché impollinano una varietà di colture che sono consumati dagli esseri umani e animali. Molta attenzione è stato pagato al declino delle popolazioni di API del miele come Colonia perdite al passaggio del mouse intorno 30-40% ogni anno negli Stati Uniti d'America¹ e 10 – 15% in Europa^2,3. Molteplici fattori, tra cui accesso limitato all'alta qualità del foraggio, probabile atto insieme a compromettere la salute delle API di miele. Monocoltura, siccità, pratiche di apicoltura insostenibile e altri fattori diminuiscono la diversità e la quantità di Pollini naturale disponibile a colonie^4,5. Poiché le API il miele quasi tutte le loro proteine alimentari e lipidi derivano da polline, accesso ridotto al polline può limitare severamente la salute individuale e Colonia.

Le ghiandole ipofaringee sono secretive strutture situate nella testa dell'ape tra gli occhi e il cervello⁶. In circostanze normali, la traiettoria evolutiva e funzionale delle ghiandole specchio che l'ape si trovano in. A circa 5 – 10 giorni di età, l'ape esegue comportamenti di professione d'infermiera nell'alveare. In questo stesso momento, le ghiandole ipofaringee raggiungono loro dimensioni massime e la capacità secretiva, producendo la frazione di proteina principale dell'alimento di covata o gelatina alimentati per lo sviluppo di larve e altri adulti, come la regina. In questa dimensione di picco le ghiandole assomigliare ad un grappolo d'uva dove ogni acino è una struttura di lobo discreti conosciuta come il acinus (plurale: acini). Come l'ape operaia età e assume diversi compiti nell'alveare, le ghiandole ipofaringee strizzacervelli e assumono funzioni diverse, come abbattere gli zuccheri in nettare^7,8. Le ghiandole ipofaringee pertanto sono correlate con l'età l'ape e il loro compito di età-collegato.

Dimensione della ghiandola infermiera hypopharyngeal è sensibile alla quantità e qualità delle proteine nella loro dieta^9,10,11. Quando le API infermiere sono ben nutrite, le loro ghiandole sono grandi. Considerando che, le ghiandole sono piccole quando l'ape è privata di polline, specialmente nella prima settimana di sviluppo adulto. Al fine di determinare lo stato nutrizionale di un ape di infermiere, i ricercatori in genere misurano le ghiandole ipofaringee, sia misurando direttamente la ghiandola acinus dimensione^11,12,13,14 o proteina contenuto^15,16 o misurando la proteina contenuto¹¹ o peso fresco¹⁷ dell'intera testa in cui si trovano. Ogni metodo ha i suoi pro e contro. Noi preferiamo la risoluzione ottenuta dalla misurazione dei acini della ghiandola, anche se questo metodo può essere impegnativo in due modi principali. La prima sfida è correttamente identificare e sezionare la ghiandola. Il secondo è l'ottenimento di una misura accurata di ogni acinus. Microscopio ottico per dissezione, le ghiandole appaiono chiaro o lattiginoso bianco e i bordi degli acini possono essere difficili da definire. Avere strumenti per meglio definire il bordo degli acini e per aumentare la probabilità di ottenere misurazioni accurate della ghiandola è vantaggioso per chi studia miele ape nutrizione.

Qui, indichiamo i ricercatori interessati come sezionare, macchia, immagine e misurare le ghiandole ipofaringee affinché misure accurate delle dimensioni di acinus possono essere raggiunto. Il metodo che descriviamo offre ai ricercatori un metodo semplice, accurato e replicabile per realizzare misurazioni multiple di ghiandola in un relativamente breve periodo di tempo una volta che lo sperimentatore è sufficientemente praticato. Uno potrebbe misurare con fiducia le ghiandole di quasi 10 individui in poco più di un'ora. Offriamo dettagli sul metodo e materiali necessari per ottenere queste misurazioni. La corretta dissezione e colorazione delle ghiandole sono gli aspetti più importanti dei metodi descritti di seguito. Anche se abbiamo catturare le immagini ingrandite e misurare gli acini con software commerciale, i metodi che vi presentiamo possono essere facilmente adattati per altre piattaforme¹⁸.

Protocollo

1. di dissezione e la macchiatura le ghiandole ipofaringee da infermiera lavoratori

1. Fare un piatto di dissezione di cera per fusione cera ambiente fresco in un piccolo (60 mm x 15 mm) o un bicchiere di grandi dimensioni (100 mm x 15 mm) piastra di Petri. Raffreddare la cera completamente prima di utilizzare la piastra per le dissezioni.
2. Per ogni ape da elaborare, preparare 20 µ l di un 01:20 Giemsa soluzione di lavoro (01:20 v/v di preparati di Giemsa in tampone fosfato salino (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄)).
   Attenzione: La colorazione di Giemsa contiene metanolo ed è infiammabile. È tossico se ingerito, inalato, o se viene a contatto con la pelle. Deve essere smaltito secondo le esigenze dell'ente locale.
   Nota: Assicurarsi sempre una soluzione fresca di lavoro solo per il batch corrente di campioni, perché la macchia di Giemsa degrada rapidamente una volta che esso viene diluito. Eliminare la macchia diluita se si sviluppa un precipitato.
3. Pipettare 20 µ l di Giemsa nei pozzetti dei vetrini da microscopio e soluzione salina di 50 – 100 µ l nella diapositiva adiacente al pozzo.
4. Staccare la testa da un'ape, usando le forbici di micro-primavera di 10 mm e incorporare la piastra di dissezione di cera utilizzando pinze e una penna di cera-intaglio lato anteriore testa fino. Fissare la testa nella piastra della cera per maggiore stabilità con l'inserimento di perni in uno in bocca e gli occhi.
5. Con una lama di rasoio frangibile affilata fissata in una morsa di pin, fare un piccolo (~ 2 – 3 mm) incisione tra gli occhi e mandibole su ciascun lato della mascherina frontale. Delicatamente eseguire le micro forbici sotto la piastra anteriore e tagliare il nervo antennale che corre tra le antenne e il cervello.
6. Utilizzando una pinzetta, afferrare la piastra di faccia per bocca, flip up e aggiungilo alla piastra di cera con pinze a punta fine e un pin. Se necessario, rimuovere il frontalino completamente.
7. Pipettare 20 µ l PBS sul taglio aprire la sezione della testa.
   Nota: Le ghiandole possono galleggiare fino a questo punto o uno deve cercare per loro. Le ghiandole apparire come un filo di perle e si trovano in cima al cervello se intatto.
8. Usare il forcipe punto super multa per rimuovere delicatamente una delle ghiandole ipofaringee (la ghiandola può rompere, che richiedono di essere rimosso in segmenti) e trasferire immediatamente la ghiandola per la colorazione di Giemsa della diapositiva di microscopia.
9. Consentire la ghiandola Incubare nella soluzione Giemsa per 5 min e quindi utilizzare pinze per trasferire la ghiandola al pool di soluzione fisiologica nella stessa diapositiva. Se necessario, tagliare la ghiandola in piccoli pezzi con le forbici micro.
   Nota: Ciò contribuisce a rendere le ghiandole si trovano su un piano più piatto, rendendo così più facile per ottenere immagini chiare dei acini della ghiandola.

2. misurazione hypopharyngeal Acini della ghiandola

1. Accendere il microscopio e aprire il programma di misurazione. Accendere la sorgente di luce per il microscopio se non è già su. Impostare l'ingrandimento del microscopio a 10x.
2. Trovare le ghiandole e concentrarsi l'immagine ingrandita nell'oculare, senza il computer. Aumentare l'ingrandimento a 60 – 80 X e mettere a fuoco l'immagine nell'oculare.
3. Sotto la scheda "Acquire", regolare e le ghiandole di concentrarsi sull'immagine dal vivo sul computer.
4. Digitare immagine esempio di nome descrizione nella casella 'Nome immagine' e clicca 'Acquisire immagine' per prendere un'immagine delle ghiandole per ulteriori misure.
5. Selezionare la scheda 'Analisi' selezionare la 'zona tool' (evidenziato in Figura supplementare 1A) e deseleziona 'valore' sotto 'Visualizza etichette', che sarà anche deselezionare 'unità'. Impostare tutte le altre impostazioni predefinite (Supplemental Figura 1A).
   Nota: Il software calibra automaticamente le misure di zona secondo il livello di ingrandimento affinché l'area ottenuta da un ingrandimento minore è lo stesso di quello ottenuto da un ingrandimento superiore.
6. Misurare ogni acinus continuamente facendo clic o continuamente tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse mentre si traccia il perimetro di acinus attentamente possibile. Misurare almeno 10 acini per ape.
   Nota: Più può essere necessaria a seconda dell'esperimento (veda la discussione). Si possono richiedere più immagini/sezioni della ghiandola per trovare abbastanza chiari, orientati correttamente i acini per misura.
7. Una volta che tutti gli acini da una singola immagine sono stati misurati, selezionare "Crea Report". Accertarsi che le opzioni sono selezionate come mostrato in Figura supplementare 1B e fare clic su 'Export'.
8. Salvare il report come desiderato. Se un file è già stato creato per il set di campioni e vengono aggiunti ulteriori misurazioni, assicurarsi che il file di report non è aperto in modo che i nuovi dati vengono aggiunti al file esistente.
9. Una volta terminato, accendere il microscopio fotocamera e la sorgente di luce. Strofinare il liquido e ghiandole fuori le diapositive di microscopia e smaltire in modo sicuro qualsiasi materiale utilizzato. Sciacquare i vetrini con acqua distillata e pulire con etanolo (70% v/v in acqua) per il riutilizzo.

Risultati

Ghiandole ipofaringee sono stati sezionati da infermiera lavoratori e visualizzati con e senza macchia a 60 – 80 ingrandimenti (Figura 1). Nel tessuto senza macchia, è difficile trovare adeguato contrasto completamente a fuoco e definire i bordi degli acini. Nel tessuto macchiato, i bordi degli acini sono nitide a causa del contrasto migliorato tra il tessuto macchiato e lo sfondo bianco.

Discussione

Hypopharyngeal ghiandola dimensione è sensibile alla quantità di proteina e polline nella dieta ed è un indicatore critico di nutrimento in giovani api adulte. Qui, dimostriamo di sezionare e misurare questo tessuto in modo riproducibile e poco costoso. Questi tessuti possono essere difficili da sezionare, ma con la pratica, si possono ottenere sempre più pulitore dissezioni con il tessuto relativamente intatto. Il vantaggio principale del metodo presentato qui è che il tessuto è macchiato, che consente al ricercat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cool setting wax	Grobet USA	21.450
Glass petri dish, small	VWR	89000-310
Glass petri dish, large	VWR	89000-314
Super Max Wax Pen	Eurotool	PEN-520.00
Breakable razor blades	Electron Microscopy Sciences	72004
pin vise	BioQuip	4845
2A-SA flat/rounded tip forceps	Rubis/BioQuip	4522
Fine point forceps	Rubis/BioQuip	4523
5A-SA super fine point forceps	Rubis/BioQuip	4525
10 mm micro spring scissors	BioQuip	4715
3 mm micro spring Vannas scissors	Roboz	RS-5610
Glass Depression Slides, Single Cavity	GSC International	4-13057-DZ-12
PBS tablets	VWR	97062-730
Giemsa stain, modified solution	Sigma Aldrich	32884
Insect pins	ENTO SPHINX S.R.O.	02.02
Leica Applications Suite measurement software	Leica Microsystems		any measurement software, including free software, can be used