Esplorare l'effetti del volo spaziale sulla fisiologia del Mouse utilizzando la piattaforma aperta di accesso NASA GeneLab

Riepilogo

La piattaforma di NASA GeneLab fornisce accesso libero ai dati preziosi omics da esperimenti biologici spaceflight. Descriviamo come un esperimento di mouse tipico è condotta nello spazio e come possono essere consultati e analizzati i dati da tali esperimenti.

Abstract

L'esecuzione di esperimenti biologici nello spazio richiede sistemazioni speciali e procedure per garantire che queste indagini vengono eseguite in modo efficace ed efficiente. Inoltre, data la rarità di questi esperimenti è imperativo che il loro impatto essere ingrandita. Il rapido progresso delle tecnologie omiche offre l'opportunità di aumentare notevolmente il volume dei dati prodotti da spaceflight preziosi esemplari. Per capitalizzare su questo, la NASA ha sviluppato la piattaforma GeneLab per fornire accesso illimitato ai dati di volo spaziale omics e incoraggiare la sua analisi diffusa. Roditori (ratti e topi) sono organismi di modello comune usati dagli scienziati per studiare il deterioramento biologico connesse allo spazio. Il recinto che roditori di casa durante il volo spaziale sono chiamati roditore habitat (precedentemente moduli di recinzione animale) e sono sostanzialmente diverse dalle gabbie standard vivarium nelle loro dimensioni, flusso d'aria e l'accesso all'acqua e cibo. Inoltre, a causa di condizioni ambientali e atmosferiche sulla stazione spaziale internazionale (ISS), gli animali sono esposti a una maggiore concentrazione di CO₂ . Recentemente abbiamo riferito che topi negli habitat roditore interessata da grandi cambiamenti in loro transcriptome indipendentemente dal fatto se gli animali erano a terra o nello spazio. Inoltre, questi cambiamenti erano costanti con una risposta ipossica, potenzialmente guidata da più alte concentrazioni di CO₂ . Qui descriviamo come un tipico esperimento roditore viene eseguito nello spazio, come omics dati da questi esperimenti sono accessibili attraverso la piattaforma di GeneLab e come identificare fattori chiave in questi dati. Utilizzando questo processo, ogni individuo può fare scoperte critici che potrebbero cambiare il design delle missioni spaziali futuri e attività.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo manoscritto è quello di fornire una chiara metodologia di utilizzo della NASA GeneLab piattaforma¹ e come roditori esperimenti fatti nello spazio vengono convertiti in omics dati per l'analisi. Spacefaring esseri umani sono esposti a numerosi rischi per la salute da campi di gravità alterata, radiazione spaziale, isolamento rispetto a terra e altri fattori ambientali ostili^{2,3,4,5, 6}. esperimenti biologici effettuati nello spazio e sulla terra hanno contribuito a definire e quantificare questi rischi^{7,8,9,10,11, 12 , 13 , 14}. nello spazio, questi esperimenti sono stati condotti su altre piattaforme orbitale, lo Space Shuttle e la stazione spaziale internazionale (ISS). Questi esperimenti richiede hardware specializzato e metodologia date le uniche preoccupazioni di eseguire esperimenti nello spazio tra cui tempo limitato della squadra e l'ambiente di microgravità. Varie piattaforme ora esistono per l'esecuzione di esperimenti nello spazio usando la pianta, l'animale e modelli microbici¹⁵.

Modelli del roditore sono stati particolarmente importanti per avanzare la nostra comprensione di come i mammiferi, compreso gli esseri umani, rispondono al volo spaziale. Questi includono l'impatto del volo spaziale sul muscolo struttura^16,17,18 e funzioni immuni^19,20,21. Le gabbie di vivarium standard utilizzate per i roditori di alloggiamento sulla terra non sono adatte per gli esperimenti spaceflight^22,23. Pertanto, sopra gli anni topi e ratti sono stati volati e alloggiati in gabbie diverse, tra cui il giapponese Aerospace Exploration Agency (JAXA) Habitat gabbia²⁴, animale che trasportano capsule spaziali utilizzati su BION-M1 snervato satellite russo^{25 ,26,27}, il sistema cassetto di topi (MDS) progettato dall'Agenzia spaziale italiana^28,29,30, il modulo di recinzione animale NASA (AEM) e ora la NASA Roditore Transporter e habitat²³. Esperimenti di roditore iniziato a bordo dello Space Shuttle utilizzando gabbie di cui al come modulo di recinzione animale (AEM). Questo hardware è stato utilizzato nel roditore 27 esperimenti sulla navetta spaziale²³. L'AEM è stato originariamente sviluppato per relativamente brevi esperimenti a bordo della navetta (< 20 giorni). Poiché lo sviluppo della stazione spaziale, le MAA è state modificate per gli esperimenti di durata più a lungo e è ora indicati come roditore habitat^22,23. I nuovi habitat di roditore sono progettati per sostenere le missioni di lunga durata nella ISS utilizzando accelerare l'elaborazione di esperimenti per interfaccia Rack Space Station (EXPRESS). Habitat del roditore sono sostanzialmente diverse dalle gabbie standard vivarium nelle loro dimensioni, flusso d'aria, filtro e sistema di scarico e l'accesso a cibo e acqua (Figura 1). Tuttavia, questo hardware ha dimostrato di essere una piattaforma di ricerca efficace, consentendo di spunti preziosi per i cambiamenti indotti sul volo spaziale a fisiologia dei mammiferi^{19,31,32,33 ,34,35,36}.

Grandi volumi di dati omics ora possono essere generati da esperimenti biologici spaceflight comprese quelle eseguite con i roditori. Recentemente, dati da questi esperimenti omics sono stati messi pubblicamente disponibili attraverso la piattaforma di analisi che permette a chiunque di sviluppare ipotesi da esperimenti di volo spaziale e NASA GeneLab piattaforma¹ che è un repository di dati completi. GeneLab fornisce strumenti per la scoperta, accesso, condivisione e analisi dei dati. Abbiamo utilizzato GeneLab DataSet per mostrare che differenze tra le gabbie standard Vivario e habitat di roditore specializzati utilizzati nello spazio causano enormi differenze di trascrittoma di topi³⁶. Abbiamo analizzato quattro diversi dataset pubblicamente disponibili, confrontando diversi tessuti dai roditori alloggiati in gabbie standard vivarium o habitat di roditore. Utilizzando un'analisi di biologia di sistemi imparziali, abbiamo determinato che il driver principale e vie che sono state modificate erano costanti con una risposta hypoxic dovuto i livelli elevati di CO₂ causata da più alte concentrazioni di CO₂ sulla ISS, che conduce alla più alta CO ₂ concentrazioni nell'Habitat roditore dato che essi sono sistemi passivi che portano nell'aria ambiente. Questo dimostra come gli scienziati possono utilizzare strumenti open source e dati per generare risultati novelli con implicazioni su come l'ambiente della ISS impatti salute astronauta.

Qui descriviamo come roditore gli esperimenti vengono eseguiti nello spazio e come dati da questi esperimenti sono accessibili attraverso un open-source, omic piattaforma legate alla biologia di spazio. Discutiamo la configurazione degli habitat roditore usato per missioni spaziali, e come vengono elaborati i tessuti di volo spaziale. Inoltre descriviamo come spaceflight omics dati possono essere scoperto e letta su GeneLab e fattori come chiave la risposta globale al volo spaziale di guida può essere identificato³⁶. Nell'esempio specifico saremo presenti sulle modalità di implementazione di questo protocollo sarà il confronto delle differenze biologiche che si verificano nei roditori ospitati in roditore Habitat e i controlli di vivarium che sono stati pubblicati da Beheshti et al.³⁶. È importante notare che i controlli di terreno sono essenziali per gli esperimenti di volo spaziale del roditore. Come descritto in questo protocollo, questi controlli sono fatte con entrambe condizioni identiche (cioè, CO₂ condizioni, umidità, temperatura, dimensioni gabbia, ecc.) negli habitat roditore sulla ISS e in gabbie di vivarium standard che hanno lo standard ambientali (cioè, CO₂ condizioni, umidità e temperatura) condizioni sulla terra. I roditori ospitati nei roditori Habitat terra controlli consentono il confronto diretto ai roditori nello spazio. Mentre roditori alloggiati in gabbie di vivarium consentono il confronto biologico tra l'alloggiamento diverso (ad es., gabbie di vivarium vs hardware roditore). L'Habitat di roditore è diverso da quello di vivarium gabbie in quanto ha flusso d'aria costante (0,1 – 0,3 m/s), una lunga durata e un filtro di scarico secondario che cattura e assorbe i rifiuti di origine animale guidato per il filtro di scarico di flusso continuo di aria in condizioni di microgravità. Inoltre, roditore habitat hanno sistemi passivi e aspirazione aria ambiente; Pertanto, essi hanno anche più alte concentrazioni di CO₂ a causa di livelli elevati in cabina ISS (~ 5.000 ppm).

Protocollo

I protocolli animali per alloggiamento e processazione dei tessuti seguono linee guida standard per la cura degli animali di laboratorio e sono stati approvati dalla NASA volo e a terra istituzionale Animal Care e uso comitati (IACUC).

1. configurazione degli habitat del roditore

Nota: Gli habitat di roditore NASA (precedentemente MAA) hanno caratteristiche diverse dalle gabbie vivarium di ospitare per operazioni nello spazio (Figura 1).

1. Casa 10 topi in ogni Habitat di roditore (fino a 30 g per topo). House 5 topi per vano quando l'habitat è configurato in due scomparti o 10 topi se c'è un unico vano.
   Nota: NASA roditore habitat hanno una maggiore area superficiale accessibile al roditore rispetto le gabbie standard vivarium.
2. Per terra i controlli animali, casa topi nel roditore Habitat all'interno il simulatore ambientale ISS (ISSES) in condizioni ambientali identiche come gli animali di volo compresi CO₂ concentrazioni, temperatura e umidità relativa.
3. Fornire gli animali ad libitum accesso a custom made NASA nutriente aggiornato roditore Foodbars (NuRFB) conformemente ai requisiti nutrizionali National Research Council (NRC) per topi³⁷, e per l'acqua attraverso pressione attivato lixits.
4. Monitorare la salute degli animali e il comportamento che verrà abilitata negli habitat roditore con i 12:12 h ciclo di luce simile a vivarium gabbie in servizi standard con illuminazione a LED durante il giorno e illuminazione a infrarossi durante i controlli di salute dei video che si svolgono durante il ciclo scuro.
5. Inserire quattro telecamere nelle gabbie roditori Habitat per il monitoraggio quotidiano di salute e comportamento e raccogliere video degli animali durante la notte con illuminazione a infrarossi.
6. Consegnare i roditori verso la ISS in un trasportatore (Figura 2B) a bordo della capsula Dragon o simile veicolo di lancio.
7. Garantire che i roditori sono osservati ed esaminati dal veterinario volo NASA prima di essere caricati nel trasportatore per il lancio e dai membri del equipaggio addestrato all'arrivo a ISS e prima del trasferimento a habitat di roditore.
8. Per questo periodo di transizione, la casa fino a 20 topi (10 su ogni lato) o 12 ratti il Transporter.
   Nota: Simile all'Habitat di roditore, il trasportatore è un'unità passiva per condizioni ambientali. Durante questo periodo di transizione corto, questa singola unità può ospitare fino a 20 topi.

2. roditore gestione per esperimenti di volo spaziale

1. Procurano roditori da fornitori standard.
   Nota: A seguito della consegna, roditori all'interno di gabbie standard vivarium di gruppo e avere gli animali raggiunga la NASA NuRFB, lixits e pavimenti sopraelevati filo fino a quando gli animali vengono caricati nel trasportatore. Lasciando i roditori nelle gabbie permetterà agli animali di adattarsi naturalmente. Il trattamento dei topi dentro e fuori sia il roditore habitat e gabbie di vivarium segue protocolli comunemente utilizzati per tutti gli esperimenti del roditore^12,27,28. Il sistema di roditore Habitat (Figura 1A) sarà utilizzato per entrambi missione spaziale STS e ISS, rispettivamente e per controlli di terreno simulando condizioni ambientali ISS o STS.
2. Per alcune missioni utilizzare gabbie standard Vivario (Figura 1B) per il controllo di vivarium. Utilizzare 5 o 10 topi per gabbia standard vivarium.
3. Per gli habitat di roditore, posto 10 topi in due diversi compartimenti con 5 topi per vano. Rimuovere il divisore di gabbia per ospitare 10 topi per Habitat in un unico vano.
4. Utilizzare tre componenti dell'hardware roditore durante le missioni di volo spaziale come descritto di seguito (Figura 2).
   1. Posto roditori in un trasportatore (Figura 2B) per il viaggio tra la terra e la ISS o viceversa a doppia densità (10 topi per lato, 20 topi per Transporter).
   2. Una volta sulla ISS, collegare l'unità di accesso animale (AAU) (Figura 2) al trasportatore. Trasferire gli habitat utilizzando Mouse trasferimento caselle (MTB) roditori dal Transporter (5 topi per MTB) (Figura 2D).
      Nota: The AAU viene utilizzato per contenere prodotti di origine animale (ad esempio, feci, urina, pelliccia) da sempre per la cabina ISS.
   3. Il AAU da trasportatore di scollegamento e collegamento per l'Habitat di roditore. Quindi trasferire gli animali da MTB per l'Habitat di roditore (Figura 2A) dove risiedono per tutta la durata della missione.
      Nota: La concentrazione di CO₂ a causa di livelli elevati in cabina ISS per tutti gli habitat di roditore è a 5.000 ppm.
5. Monitorare la temperatura e l'umidità degli habitat roditore, ma non sono presenti controlli attivi termici. Garantire che il team di ricerca roditore lavora con ISS per mantenere e controllare la temperatura della cabina, che determina la temperatura nell'Habitat roditore.
   Nota: Il ciclo di luce e buio negli habitat roditore si verifica ogni 12 h (ad es., 05:00 – 17:00 GMT, luci) e l'equipaggio della ISS svolge regolare e frequente cambiamento fuori il cibo (settimanale o bisettimanale) e ricariche l'acqua (ogni ~ 28 giorni).

3. l'eutanasia dei roditori e lavorazione tessuto

1. Per l'eutanasia, dare roditore un sovradosaggio di un anestetico generale (chetamina/xilazina fino a 150/45 mg/kg corpo massa diluito in tampone fosfato salino per un volume totale di 0,3 mL) tramite l'iniezione intraperitoneale (IP) accoppiato con un metodo secondario di eutanasia ( dislocazione cervicale o toracotomia).
2. Per esperimenti condotti sulla ISS:
   1. Ritorno roditori sia live, o
   2. Eutanasia su ISS.
      1. Congelare il roditore carcasse a-95 ± 2 ° C nel congelatore sulla ISS e torna a terra il veicolo di ritorno disponibile (attualmente capsula SpaceX Dragon).
      2. Una volta che i roditori sono tornati sulla terra, sezionare tutti gli organi e tessuti (cioè, fegato, rene, pelle, muscoli, cuore, milza, occhi, ghiandole surrenali, polmoni e cervello) e conservare a-80 ° C o in soluzione di stabilizzazione del RNA.
3. Seguire le stesse procedure e tempi per tutti gli esperimenti di controllo di terra come l'esperimento di volo con un offset di 3 – 5 giorni affinché corrispondano ai dati di telemetria ISS.
4. Dai tessuti conservati isolare RNA, proteine e l'isolamento di DNA utilizzando protocolli standard che sono descritte in dettaglio associato con ogni set di dati sulla piattaforma GeneLab (genelab.nasa.gov).
   Nota: Roditore tessuti non utilizzati dallo sperimentatore principale diventano parte della collezione scientifica istituzionale della NASA. Questi campioni sono conservati in Ames Research Center (ARC) Non-umane biobanca dove essi sono catalogati e resi disponibili per la richiesta da parte della comunità di scienza. Tessuti disponibili si possono trovare sul sito pubblica the Life Sciences dati Archive presso: https://Lsda.jsc.nasa.gov/Biospecimen.

4. generazione Omics dati da proteina, DNA e RNA estratti

1. Dalle macromolecole estratte (RNA, DNA, proteine) utilizzare protocolli standard per generare dati di omics. Questi sono descritti in dettaglio nei metadati del rispettivo studio su GeneLab.

5. GeneLab Repository e invio dati

Nota: Spazio biologia relativi omics dati sono presentati nel repository di dati GeneLab. GeneLab accetta e ospita dati spaziali omics finanziati da più agenzie spaziali del mondo.

1. Omics di generare dati che possono essere ospitati sul repository GeneLab correlati.
   1. Inviare dati generati a GeneLab, neanche quando l'analisi è completa o basate su discrezione del ricercatore.
      Nota: Dati presentati ad altri database pubblici omics vengono importati e pubblicati nel repository GeneLab. GeneLab generato dati sono a cura e pubblicati senza un periodo di embargo. GeneLab, in particolare il campione Processing Lab, genera dati da vari esperimenti di volo spaziale usando protocolli di estrazione ottimizzata e tecniche per aumentare i dati di omics dagli esperimenti di volo spaziale.
2. Quando i dati sono pronti per essere presentati, formattare e trasferire dati e metadati di GeneLab con il seguente metodo (Supplemental figura 1):
   1. Utilizzare gli strumenti di ISAcreator per definire uno studio sperimentale e memorizzare i metadati.
      Nota: The ISAcreator strumento è disponibile per il download con una visita guidata di tutorial qui³⁸.
   2. Consultare i dati elencati qui³⁹ per comprendere i tipi di dati accettati e formati per i file di dati grezzi e lavorati.
      1. Per ottimizzare il caricamento e archiviazione, comprimere i file di dati.
   3. Trasferire i metadati e i dati non elaborati e/o trasformati a GeneLab curatori di dati attraverso l' area di lavoro⁴⁰.
   4. Creare un nome utente e una password e caricare i dati.
3. Una volta che i dati sono stati caricati nell'area di lavoro, condividere i dati di un curatore di GeneLab.
   Nota: Procedura dettagliata su come caricare e condividere i file si trovano nel manuale di presentazione dati⁴¹.
4. Ogni presentazione è verificata da un curatore e pubblicato nel repository GeneLab⁴².

6. trovare i set di dati per analisi usando le funzionalità di ricerca GeneLab

1. Ricerca di set di dati diversi su GeneLab andando al link (Supplemental figura 2)³⁸.
   1. Specificamente legate a una precedente pubblicazione³⁶, cercare i seguenti termini: GLDS 21, GLDS-111, GLDS-25 e GLDS-63.
2. Accedere alla homepage di GeneLab cliccando sul "GeneLab Data System" sul lato sinistro dello schermo.
3. Immettere le parole chiave nella casella "dati di ricerca" per la ricerca di specifiche aree di interesse. In questo caso inserire ciascuno dei seguenti identificatori di set di dati separatamente: GLDS 21, GLDS-111, GLDS-25 e GLDS-63.
4. Oltre che la ricerca del repository GeneLab, ricerca in altri database inclusi NIH GEO, EBI orgoglio e ANL MG-RAST selezionando le caselle di controllo desiderate sotto la barra di ricerca.
   Nota: Attualmente solo per il repository di GeneLab, un utente può eseguire una ricerca utilizzando le seguenti categorie di filtro: organismi, tipo di analisi, fattori e tipo di progetto.

7. memorizzazione e trasferimento file di interesse per l'analisi

Nota: L'area di lavoro di GeneLab è progettato per memorizzare e trasferire i file direttamente dal database di GeneLab (Supplemental figura 3).

1. Parte superiore del menu di sistemi di dati, fare clic su "Workspace".
2. Se nuovo utente, registrati per un nuovo account.
   Nota: L'area di lavoro di GeneLab è alimentato da GenomeSpace⁴³.
3. Accedere a dettagliate istruzioni su come utilizzare l'area di lavoro selezionando "Help" sul menu in alto e facendo clic su guida per l'utente.
4. Per ogni utente, è possibile accedere tutti i set di dati nel repository GeneLab selezionando la cartella "Pubblico/genelab" nel menu a sinistra.
5. Copiare i set di dati di interesse per un'area di lavoro directory locale accedendo alla cartella con i dati di interesse. Fare clic con il pulsante destro sul file specifico, selezionare "copia/sposta" nel menu che appare, selezionare la cartella da copiare il file e quindi fare clic su "copia".
   1. Trovare i seguenti set di dati relazionati a una precedente pubblicazione³⁶ come indicato sopra e copiare sopra l'area di lavoro locale: GLDS-21, GLDS-111, GLDS-25 e GLDS-63.

8. l'accesso ai metadati e la descrizione di ogni studio

Nota: File di metadati per ogni set di dati nel repository GeneLab si trovano nella sottocartella "Pubblico/genelab" dataset dal menu di sinistra.

1. Trovare le informazioni sui metadati per il set di dati di interesse accedendo a uno o più file di metadati contenuti in una sottocartella di "metadati" di ogni set di dati. Ad esempio, per GLDS-100, ci sono 2 file nella sottocartella "Pubblico/genelab/GLDS-100/metadati": "GLDS-100_metadata_RR1_BIOBANK-occhio-ISA.zip" e "GLDS-100_metadata_RR1ExpDesign.pdf".
   1. Assicurarsi che ogni set di dati disponga di un unico file zippato che fornisce i metadati in base alla specifica di ISATab (che sussume l'Andrea, MIAPE e altri standard di framework MIBBI per requisiti minimi dei metadati). Finiscono sempre questo tipo di nome di file in "ISA.zip". Ad esempio, per GLDS-100, questo file è "GLDS-100_metadata_RR1_BIOBANK-occhio-ISA.zip".
2. Utilizzare lo strumento di ISACreator⁴⁴ o un editor di testo per visualizzare e accedere ai metadati di ISATab, che contiene la descrizione di testo per i metadati di studio e di analisi per ogni set di dati.
   Nota: All'interno i metadati ISATab, campioni sono descritti e connesso con le analisi biologiche, e le analisi biologiche sono descritti e associate con i file di dati di output.
3. Verificare la presenza dei file di dati di test di uscita che si trovano all'interno di ogni set di dati nelle sottocartelle dal tipo di test. Ad esempio, per GLDS-100, RNA-Seq uscita test file si trovano nel "pubblico/genelab/GLDS-100/trascrittomica /" cartella.

9. analisi dei dati di GeneLab

Nota: Gasdotti vari possono essere implementati per vari omics dati. Qui, l'esempio specifico si concentra su una pipeline di trascrittomica biologia di sistemi imparziale che viene utilizzata per determinare i "fattori chiave" del sistema in fase di studio.

1. Check in precedenza pubblicato literatures^{36,45,46,47,48,49,50} per comprendere questa pipeline.
2. Una volta selezionato un set di dati specifici di interesse per l'analisi, è possibile scaricare i dati ad una macchina locale con il seguente metodo:
   1. Fare clic su set di dati specifico.
   2. Fare clic sulla scheda "File di studio" all'estrema sinistra delle intestazioni.
   3. Assicurarsi che tutti i file di dati e metadati siano disponibili in questo menu.
   4. Per scaricare ogni file, fare clic sui nomi dei file specifici.
3. Per i set di dati di microarray che verrà scaricato da GeneLab, attenersi alla seguente procedura di pre-elaborazione.
   1. Processo i dati grezzi per ogni set di dati separatamente utilizzando la sottrazione di sfondo e Quantile normalizzata utilizzando RMAExpress⁵¹ per i microarrays commerciali.
   2. Creare principio component analysis (PCA) trame utilizzando R per determinare quanto strettamente biologico replica raggruppati insieme.
   3. Importare dati in Visualizzatore MultiExperiment⁵² e calcolare geni significativi prima usando le statistiche di tasso (FDR) falsi scoperta a partire con FDR < 0.05. Se nessun geni significativi apparsi con statistiche FDR, quindi di utilizzare il t-test standard a partire con un valore p < 0,05 per determinare i geni significativi.
   4. Una volta che i geni regolati statisticamente significativi sono stati determinati, implementare un cut-off di piega-cambiamento di ≥ 1.2 o ≤ -1,2 per confrontare i campioni sperimentali con i controlli.
4. Utilizzare Gene impostare arricchimento analisi (GSEA)⁵³ per via e previsioni funzionali.
   1. Utilizzare GSEA sia attraverso GenePattern^54,55, direttamente attraverso GSEA, o utilizzando l'ambiente di programmazione R.
   2. Determinare le vie significativamente regolamentate utilizzando i seguenti set di gene: C2, C5 e tratti distintivi.
   3. Eseguire analisi all'avanguardia sui set di geni significativamente e determinare la leading edge geni associati a ogni confronto sperimentale e Gene Set.
   4. Trovare i geni di avanguardia che si sovrappongono tra tutti il gene set per ogni condizione sperimentale.
5. Utilizzare un'altra piattaforma per determinare le funzioni previste e vie che sono essere regolamentate significativamente. In questo caso è possibile utilizzare analisi dei percorsi Ingegno (IPA) per determinare il significativi regolatori a Monte, biofunctions e vie canoniche.
   1. Caricare l'elenco dei geni con piega-modificare i valori per i geni statisticamente determinati nel passaggio 9.4.4.
   2. Seguire le istruzioni di IPA per generare regolatori a Monte, biofunctions e le vie canoniche per ogni confronto sperimentale.
   3. Determinare che il gene associato per regolatori a Monte, biofunctions e vie canoniche che hanno un'attivazione z-punteggio ≥ 2 (attivazione indicato) o ≤ -2 (che indica l'inibizione).
   4. Trovare i geni sovrapposti relazionati a tutte le previsioni di cui sopra.
6. Determinare i geni comuni/sovrapposizione tra i passaggi 9.4 e 9.5.
   Nota: Questi geni sono considerati come i geni chiave/driver che controllano la maggior parte delle funzioni previste e attività con le condizioni sperimentali analizzate. Gli studi precedenti hanno dimostrato che buttando giù o promuovere questi geni renderà la condizione sperimentale o sistema oggetto di studio non funzionali^45,46,49.
   1. Costruire reti attraverso IPA (o qualsiasi software di montaggio di rete) per determinare la connettività dei geni.
   2. Considera il gene più connesso come hub centrale guida i geni chiave.
   3. Per determinare la connettività tra i set di dati, raggruppare tutti i geni chiavi in una rete e connettività ripetere test per determinare l'hub centrale che si sta verificando tra tutti i geni chiave da tutti i set di dati analizzati.

10. usare Galaxy⁵⁶ interfaccia su GeneLab per analizzare dati di trascrittomica

Nota: Qui è descritto un protocollo per utilizzare l'interfaccia di GeneLab Galaxy (disponibile caduta 2018) per analizzare i dati di trascrittomica da GeneLab. Tutorial di Galaxy abbondano. Tutorial di esempio su come utilizzare Galaxy sono in generale disponibili squisitezza^57,58.

1. Gli utenti possono accedere a GeneLab utilizzando le credenziali Google o NASA. Strumenti di GeneLab Galaxy si trovano sotto il menu "Analizza".
2. Seguire questi tre modi per portare i dati nella piattaforma GeneLab Galaxy.
   1. Caricare i dati dal file system locale utilizzando la funzione "Carica dati".
   2. Importare dati da GeneLab GenomeSpace utilizzando l'utilità di importazione di GenomeSpace nella sezione "Dati".
      Nota: Tutti i file di dati di GeneLab sono disponibili nella cartella "pubblica", organizzata dal numero di adesione di dataset (Vedi sopra).
   3. Importazione dati visualizzati nella "storia" della sezione di analisi sul lato destro. Gli utenti possono avere molteplici storie, che vengono gestite mediante i pulsanti "Opzioni cronologia" o "Visualizza tutte le storie" nella parte superiore del riquadro cronologia.
3. Strumenti per l'analisi sono elencati e ricercabili sul lato sinistro dell'interfaccia.
4. Controllare l'aspetto del set di dati che sono stati importati sulla storia attuale.
   Nota: Molti dettagli per quanto riguarda i dati sono disponibili per l'ispezione per ogni set di dati.
5. Selezionare uno strumento sul lato sinistro per compilare un modulo nel pannello centrale, con opzioni per l'analisi e la specificazione dei dati di input. Creare posti di lavoro per l'esecuzione di analisi compilando il modulo e premendo "Execute".
6. Verifica per i lavori presentati che sono rappresentate nella storia e color-coded per indicare lo stato di esecuzione (in coda, in esecuzione, completati con o senza errori).
7. Collegare gli strumenti in flussi di lavoro complessi. Gestire i flussi di lavoro attraverso strumenti che si trova nel menu "Flussi di lavoro". La figura 3 Mostra un esempio di flusso di lavoro creato per l'elaborazione dei dati RNA-seq.
8. Condividere i set di dati, flussi di lavoro e storie con gli altri utilizzando il menu "Dati condivisi".

Risultati

Determinazione chiave driver dai dati di trascrittomica spaceflight assisterà NASA con determinare rischi per la salute e lo sviluppo di contromisure potenziali per combattere gli effetti negativi sulla salute di astronauta. Nella nostra recente pubblicazione, abbiamo seguito i passaggi precedenti e utilizzate GeneLab DataSet per visualizzare correttamente un romanzo che trova che le concentrazioni di CO₂ sulla ISS possono avere un impatto di salute³⁶. Abbiamo anche usato la tecnica sopra in altri studi per determinare correttamente i fattori chiave che guida il sistema essendo studiato^{45,46,47,48,49,50} . Qui vi mostriamo come i risultati utilizzando questo protocollo possono essere usati con successo per determinare i fattori trainanti.

In questo studio, ci siamo concentrati principalmente sulle differenze biologiche che si verificano nei roditori all'interno di controlli di terreno il roditore abitudini e i controlli di vivarium. Come descritto sopra, è la chiave per comprendere meglio questi due ambienti, che ci forniscono informazioni su possibili fattori di confusione che possono influire sulla salute a causa dell'ambiente sulla ISS. Per tutti gli esperimenti di volo spaziale del roditore, questi controlli di terreno sono anche essenziali per determinare quali fattori biologici sono associati direttamente con volo spaziale o a causa delle condizioni ambientali sulla ISS. Come indicato nel protocollo, la condizione ambientale per l'habitat di vivarium non viene esposto al livello superiore CO₂ che è presente per l'Habitat di roditore. L'habitat di Vivario ha livello₂ CO normale che è presente sulla terra (attualmente in fase di 300 a 380 ppm). La temperatura e l'umidità per entrambi gli habitat sono simili.

Abbiamo usato i seguenti set di dati dalla piattaforma GeneLab per determinare i geni chiave tra i roditori ospitati nel roditore Habitat terra controlli e controlli di terreno vivaio che sono responsabili per guidare le differenze tra i due habitat: GLDS-21, GLDS-111, GLDS-25 e GLDS-63. Analisi per determinare i geni significativi è stata effettuata come descritto in precedenza tra il roditore Habitat (precedentemente AEM) e i controlli di Vivario in modo indipendente per ogni set di dati. Raggruppamento di trame ha mostrati PCA del biologico replica (illustratonella figura 4 che la PCA trame per GLDS-21). Dai dati pre-elaborati, abbiamo determinato i geni di avanguardia dai diversi insiemi di gene GSEA. Utilizzando i geni con 1.2 volte-cambiamento (log₂), siamo stati in grado di prevedere i geni coinvolti con le previsioni per regolatori a Monte, le vie canoniche e biofunctions. Per ogni set di dati abbiamo poi trovato comune/sovrapposizione geni coinvolti per tutti i geni (Figura 5). Questi geni sono ora creduti di dover guidare la risposta tra i roditori nel roditore habitat (o AEM) e controlli di vivarium. Rete rappresentazione di come collegare questi geni chiave Mostra che l'hub centrale per ogni set di dati da analizzare (Figura 6). Ad esempio, MAPK1 è il fulcro centrale per STS-108 tessuti del muscolo scheletrico di topi (Figura 6A). Questo verrebbe interpretato come il gene che sta guidando i geni chiave e molto probabilmente il giocatore centrale per causare differenze biologiche per topi ospitati in roditore habitat contro le gabbie di vivarium. Nel nostro lavoro precedente, discutiamo come questi geni chiave sono associati con CO₂ risposta dalla letteratura scientifica esistente e come questi geni possono essere responsabili di cambiamenti biologici osservati nel topi³⁶.

Adottando un approccio di biologia di sistemi, abbiamo successivamente determinato un "regolatore matrice" che collega tutti i set di dati/tessuti ed è potenzialmente responsabile di effetti biologici universali nei roditori ospitati in Maa rispetto alle gabbie di vivarium. Questo è stato fatto attraverso la determinazione del gene da tutti i set di dati che è il più collegato quando si costruisce una rete da tutti i geni chiave. Siamo stati in grado di dimostrare che MAPK1 è il gene più connessi e mozzo centrale da tutti i geni chiavi (Figura 7). Per confermare che se MAPK1 potrebbe essere responsabile di cambiamenti biologici in topi da CO₂ livelli superiori nella Maa, abbiamo guardato attraverso la letteratura scientifica per prove a sostegno. Abbiamo trovato parecchi studi che indicano la correlazione di MAPK1 con CO₂⁵⁹ e ipossia^19,60,61.

Figura 1 : The Habitat roditore (precedentemente AEM) rispetto alle gabbie vivarium. (A) immagine della gabbia AEM fornita dalla NASA (crediti: NASA/Dominic Hart). (B) la gabbia standard vivaio che è attualmente utilizzato (foto scattata dal nostro laboratorio). Questa figura è stata modificata da Beheshti et al.³⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Il sistema Hardware di Habitat di roditore con i tre diversi moduli coinvolti durante il trasporto da e per le missioni spaziali. Il modulo sinistro (A) è il modulo di roditore Habitat (precedentemente AEM), il modulo di centro (B) è il trasportatore e il modulo di destra (C) è l'unità di accesso animale (AAU). (D) La casella di trasferimento del Mouse (MTB). (Crediti: NASA/Dominic Hart). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Flusso di lavoro analisi di esempio che può essere utilizzato nell'interfaccia GeneLab Galaxy per elaborare i dati RNA-seq. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 4 : Principali analisi dei componenti (PCA) del rappresentante dataset dopo passaggi di pre-elaborazione. GLDS-21 dataset per gabbia di AEM vs vivarium è mostrato per il muscolo scheletrico murino dalla missione STS-118. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Diagramma di Venn che rappresenta quali geni chiave sono determinati utilizzando strumenti di previsione di diversi pathway. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 6 : I geni chiave determinati per tutte le condizioni e tessuti murini tra l'AEM vs . gabbie vivarium. (A-E) Rappresentazione della rete di geni chiave per ogni tessuto di dataset/roditore. Log₂ fold-modifiche (con un taglio di 1.2-fold-cambio) per l'espressione genica sono state utilizzate per ottenere diverse tonalità di verde per piega-cambiamento nei geni downregulated, mentre diverse sfumature di rosso raffigurano piega-cambiamento nei geni sovraregolati. Più scuro all'ombra di verde o rosso, maggiore è il fold-cambiamento. Questa figura è stata modificata da Beheshti et al.³⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : Determinare il "regolatore matrice" per roditori in casa di roditore Habitat rispetto alle gabbie di vivarium. Connessioni tra tutti i singoli geni chiave (Figura 6) sono state determinate e visualizzate come una rete attraverso IPA. Rete è rappresentato come un diagramma radiale con il gene chiave più connesso, MAPK1, nel centro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare Figura 1: integrazione di GeneLab-GenomeSpace con ISACreator per semplificare le operazioni di elaborazione dei dati. Per favore clicca qui per scaricare questa figura. 

Supplementare nella figura 2: schermata di GeneLab ricerche utilizzando Federazione/integrazione con database esterni bioinformatica eterogenei (GEO, orgoglio, MG-RAST). Per favore clicca qui per scaricare questa figura

Supplemental Figura 3: Screenshot dell'area di lavoro collaborativo GeneLab mostrando l'utente Gestione account e accedere ai controlli (ad esempio, private, condivise e pubbliche cartelle).  Per favore clicca qui per scaricare questa figura

Discussione

La piattaforma di NASA GeneLab è una piattaforma di database e analisi completa omiche che consentirà alla comunità scientifica di generare nuove ipotesi legate alla biologia di spazio. Qui abbiamo presentato una procedura completa per esperimenti roditore dall'inizio del volo spaziale per la generazione di ipotesi novella da analisi dei dati che utilizza una piattaforma pubblicamente disponibile spazio biologia. Inoltre, abbiamo anche fornito un esteso protocollo su un'analisi di biologia di sistemi imparziale per l'identificazione di geni chiave che guida il sistema oggetto di studio. Abbiamo utilizzato il nostro recente studio³⁶ come un esempio di come questo protocollo è efficacemente utilizzato per generare un'ipotesi novella per la biologia di spazio. Speriamo che questo aiuta gli investigatori comprendere meglio come vengono eseguiti esperimenti di volo spaziale e come dati da loro conducono ai dati disponibili su GeneLab e, infine, consentono più chiara interpretazione dei dati omics pubblicamente disponibile spazio biologia.

Ci sono diversi passaggi critici all'interno del nostro protocollo in materia di analisi dei dati prodotti ed esperimenti di volo spaziale del roditore. Comprendere l'Habitat di roditore installazione è fondamentale per sviluppare e progettare l'esperimento ottimo per il volo spaziale. Ciò comporterebbe in particolare il protocollo e la descrizione che abbiamo fornito nel passaggio 1 del nostro protocollo. Una volta che un investigatore capisce pienamente le diverse condizioni esistenti negli habitat roditore rispetto alle gabbie di vivarium, i risultati biologici interpretati possono essere correlati correttamente alle condizioni ambientali nello spazio. In aggiunta, modifiche all'Habitat roditore non possono essere fatto, poiché l'Habitat di roditore è stato ottimamente progettato e approvato dalla NASA per l'uso del volo spaziale.

Per interpretare i risultati biologici, abbiamo fornito un protocollo approfondito su ogni passo coinvolto da caricare i dati di GeneLab per l'analisi dei dati per generare ipotesi romanzo spazio biologia. Anche se tutti i passaggi sono importanti nella comprensione di come generare dati, i passaggi più critici per l'analisi dei dati sono passaggi 9 e 10. Passaggio 9 fornisce un protocollo per analizzare i dati di trascrittomica utilizzando un metodo di biologia di sistemi imparziali per determinare i geni/pathways che veramente stanno guidando la condizione sperimentale analizzata. Passaggio 10 è critica come esso fornisce agli utenti con una metodologia facile analizzare omics GeneLab DataSet utilizzando la piattaforma di GeneLab. Modifiche al protocollo di cui possono essere fatto per alcuni passi per quanto riguarda l'analisi dei dati. In particolare, possono essere fatto passi 9.4 – 9,6 utilizzando R programmazione o qualsiasi altri strumenti preferiti che l'utente preferisce. A seconda del set di dati, statistiche diverse e piega-cambiamento tagli utilizzabile per determinare i geni significativamente regolamentati. Inoltre, per determinare i geni chiave nei passaggi 9.5 e 9.6, l'utente può modificare il presente protocollo e utilizzare qualsiasi strumento che utilizza i geni significativamente regolamentati per prevedere funzioni. Il concetto importante è che utilizzando più strumenti predittivi omics funzionale permette per la determinazione dei geni coinvolto con la maggior parte delle funzioni è regolata nel sistema in fase di studio.

La piattaforma di GeneLab continua a sviluppare e mentre le analisi qui descritte sono state eseguite dopo il download dei dati, la fase successiva di GeneLab permetterà per analisi di omics dati direttamente sulla piattaforma di GeneLab, che fornirà un flusso di lavoro facile per generare dati trattati per analisi di ordine superiore. Inoltre, considerando che ci siamo concentrati su un protocollo per l'interpretazione dei dati di trascrittomica, GeneLab contiene una grande varietà di dati omics compresi proteomica, genomica, metabolomica ed epigenomic dati. La piattaforma finale conterrà condutture e linee guida per l'analisi di questi diversi tipi di omics. L'ultima fase della GeneLab implementerà anche un'interfaccia di visualizzazione livello di sistema per consentire all'utente di base generare facilmente spazio biologia ipotesi.

Infine, i nostri sistemi di analisi di biologia fornisce un metodo unico ed imparziale per determinare la chiave di geni/pathways di guida in qualsiasi sistema in fase di studio utilizzo dei DataSet omics. Abbiamo utilizzato questa metodologia in vari studi indipendenti con grande successo per determinare il driver chiave coinvolti^{36,45,46,47,48,49 ,50}. In un cancro omics studi, utilizzando questa metodologia abbiamo validato sperimentalmente che i nostri geni/vie chiave previste in realtà stavano guidando la risposta di trattamento della droga battendo fuori i geni chiave in vitro⁴⁵correlati. Abbiamo osservato, come avevamo previsto attraverso questo protocollo, che il trattamento non è efficace più a causa dell'assenza dei geni chiavi. Crediamo che questo protocollo di biologia di sistemi imparziale può essere uno strumento utile per determinare le vie chiave per qualsiasi studio omiche.

Questo protocollo fornisce un metodo rapido ed efficiente per la generazione delle ipotesi romanzo spazio biologia. I dati generati da GeneLab possono essere sfruttati dagli investigatori per future opportunità di finanziamento, validazione sperimentale e potenziali bersagli per lo sviluppo di contromisure contro le radiazioni di microgravità e spazio. Il protocollo fornito qui permetterà per le indagini future space biologia si verifica con un'efficienza ottimale per consentire sicuro missioni spaziali a lungo termine.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mice	The Jackson Laboratoy	C57BL/6J	C57BL/6 mice were used for datasets related to Rodent Research-1 experiments
BALB/C Mice	Taconic	BALB	BALB/C mice were used for datasets related to Rodent Research-3 experiments
Vivarium Cages	Charles River Laboratory		Standard murine cages purchased from Charles River Laboratory
Rodent Habitat	NASA		This cage and all components are built internally at NASA
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	RNAlater is used to store the tissue for further RNA isolation