Meccanismi di secrezione dell'ormone intestinale utilizzando l'isolato irrorati intestino tenue del ratto

Riepilogo

Qui, presentiamo un modello fisiologico ed efficace per studiare i meccanismi molecolari sottostanti la secrezione dell'ormone intestinale e l'assorbimento intestinale — piccolo intestino irrorato isolato del ratto.

Abstract

L'intestino è il più grande organo endocrino del corpo, producendo più di 15 ormoni peptidici differenti che regolano l'assunzione di cibo e di appetito, digestione, assorbimento dei nutrienti e distribuzione ed escursioni di glucosio post-prandiale. Comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la secrezione dell'ormone dell'intestino è fondamentale per comprendere e tradurre la fisiologia dell'ormone dell'intestino. Tradizionalmente, i meccanismi di secrezione dell'ormone dell'intestino sono sia studiati in vivo (in animali da esperimento o esseri umani) o utilizzando primaria di disecrezione intestinale mucoso colture cellulari o linee cellulari. Qui, presentiamo un piccolo intestino irrorato isolato del ratto come metodo alternativo per lo studio della secrezione dell'ormone dell'intestino. Le virtù di questo modello sono che essa si basa sull'intestino intatto, significato che ricapitola la maggior parte dei parametri fisiologicamente importanti responsabili della secrezione negli studi in vivo, tra cui polarizzazione della mucosa, paracrine relazioni e percorsi di esposizione di aspersione/stimolo. Inoltre a differenza di studi in vivo, l'intestino tenue irrorato isolato del ratto consente quasi completo controllo sperimentale e la valutazione diretta della secrezione. In contrasto con gli studi in vitro, è possibile studiare sia la grandezza e la dinamica della secrezione e per affrontare le questioni importanti, come ad esempio causano quello che stimoli la secrezione degli ormoni dell'intestino diverse, da che parte dell'intestino (luminal o vascolare) è la secrezione stimolato e analizzare in sensori molecolari dettaglio sottostante la risposta secretiva. Inoltre, la preparazione è un potente modello per lo studio dell'assorbimento intestinale e i dettagli riguardanti le dinamiche di assorbimento intestinale, tra cui i trasportatori responsabili.

Introduzione

L'intestino è il più grande organo endocrino del corpo, producendo più di 15 ormoni peptidici differenti che regolano l'assorbimento dei nutrienti e la disposizione dei nutrienti, la crescita intestinale e modulano l'appetito¹. Ormoni dell'intestino sono, pertanto, coinvolti in molti processi fisiologici fondamentali, e la comprensione di questi pattern di secrezione e i dettagli molecolari che controllano la secrezione degli ormoni rispettivi è così importante per la nostra base fisiologica comprensione e per affrontare aspetti traslazionali delle azioni di ormone intestinale; ma come uno può studiare i meccanismi molecolari rilevamento secrezione dell'ormone dell'intestino? In generale, la secrezione dell'ormone può essere studiata in intatti organismi (esseri umani o animali da esperimento), dalle preparazioni di intestino isolato o da colture cellulari primarie di disecrezione intestinale o immortalato cell culture^{2,3, 4 , 5 , 6}. il nostro modello preferito è il piccolo intestino irrorato isolato del ratto, che è un modello fisiologicamente rilevante che permette la secrezione degli ormoni dell'intestino per essere studiato nei minimi dettagli con risoluzione temporale ottimale (secrezione tariffe possono essere determinate con qualsiasi tempo base giù al secondo), e i risultati sono probabilmente trasferibile a una situazione in vivo⁷. Qui forniamo un protocollo dettagliato su come eseguire questa procedura, ma in primo luogo discuteremo altri metodi per lo studio della secrezione dell'ormone intestinale, compresi i vantaggi e le limitazioni di questi modelli rispetto al piccolo intestino irrorato isolato del ratto.

Se si vuole stabilire se un composto specifico regola la secrezione di alcuni ormoni dell'intestino, gli studi in esseri umani sono l'obiettivo finale. Così, se un composto mostra grandi effetti sulla secrezione di uno o più ormoni dell'intestino nei roditori (in vivo o le aspersioni) o da ormone secernente cellule (linee cellulari o cellule primarie), questo effetto è rilevante solo per medicina e fisiologia umana se può essere confermata in esseri umani. Tuttavia, ci sono dei limiti chiari per il tipo di studi che possono essere eseguite in esseri umani, e studi in vivo su animali da esperimento sono, pertanto, spesso la seconda migliore opzione per tali studi. Topi e ratti sono animali sperimentali utilizzati più di frequente presumibilmente dovuto il loro formato conveniente, basso costo e la possibilità di alterare geneticamente i geni sospettati di essere coinvolti nelle questioni studio specifico (ad es., bussare fuori un certo trasportatore o recettore). In generale, modelli in vivo beneficiano di essere fisiologicamente intatto, ma abbiamo anche diverse limitazioni. La cosa più importante, le piccole dimensioni dei roditori, in particolare topi, sono un fattore limitante, come la maggior parte delle analisi per la quantificazione dell'ormone dell'intestino richiedono almeno 20 µ l di plasma (e spesso molto di più), che significa che almeno 100 µ l di sangue deve essere ritirato per fare un duplicato quantificazione. Pertanto, è solo possibile ottenere pochissimi campioni corrispondenti ai campioni della linea di base e uno o due campioni post-stimolazione (il volume totale del sangue in un topo di 20g è ~1.4 mL). Di conseguenza, potenziali risposte secretive (ad es., rapidamente o ritardo che si verificano risposte) pertanto può essere mancata.

Nel modello di aspersione, è superare questo problema, come campioni di grandi volumi sono ottenuti (tasso di flusso: 7,5 mL/min) e gli intervalli di raccolta possono essere regolati come necessario per garantire che le risposte rapide e di breve durata non sono mancate (abbiamo raccogliere campioni ogni min)⁷ . Un altro problema con in vivo studi nei roditori è che la maggior parte dei ormoni dell'intestino sono ancor più rapidamente eliminato o metabolizzato più esseri umani^8,9,10, che può complicare l'analisi biochimica successiva. Per esempio, abbiamo dimostrato che il GLP-1 è metabolizzato nei topi a un ritmo addirittura superiore a quello in esseri umani (dove T_1/2 è 1-2 min¹¹) e, cosa ancora più importante, che coinvolge la fenditura del GLP-1 nei topi, oltre alla scissione del N-terminale di della dipeptidil-peptidasi-4 (DPP4) (che è il principale enzima degradante di GLP-1 in esseri umani), ulteriore scissione dal enzima endopeptidasi neutrale 24.11¹². Di conseguenza, attuale test commerciali per la quantificazione di GLP-1, che si basano sia sull'isoforma intatto di GLP-1 (7-36amide) o l'isoforma di DPP-4 spaccati (9-39amide), notevolmente sottovalutare la secrezione di GLP-1 nei topi e portare a risultati falsi ¹². nel piccolo intestino irrorato isolato del ratto, la maggior parte del metabolismo degli ormoni secreti è eliminato o ridotto notevolmente, poiché degradazione mediata dal plasma è evitato, e fegato/rene/polmone estrazione/degradazione è impedito perché ( perfusato raccolti come lascia l'intestino).

Naturalmente, comprensione importante può essere generato tramite l'uso di animali geneticamente modificati, ad esempio, sodio-glucosio transporter-1 knockout mice¹³, ma richiede una valutazione dettagliata dei sensori molecolari coinvolti nella secrezione spesso considerazione di più siti molecolari, che vanno da trasportatori molecolari di canali ionici e da diversi ricevitori G-proteina-accoppiati a proteine intracellulari. Per esempio, siamo presi di mira l'attività di nove siti molecolari diversi quando dipanare i sensori molecolari responsabili della glucosio-stimolato di secrezione di GLP-1⁷. Un'indagine simile non sarebbe possibile in vivo come alcuni dei composti utilizzati sono aspecifici o effetti nocivi/letali. Per esempio, quando si utilizza l'intestino irrorato, è stato possibile valutare il ruolo del metabolismo intracellulare del glucosio per la secrezione di GLP-1 e neurotensina bloccando la formazione di ATP con 2-4-dinitrofenolo^7,14 , nonché il ruolo di canali del calcio voltaggio-dipendenti per acidi biliari stimolata di secrezione di GLP-1, NT e PYY³. Infatti, la tetrodotossina di bloccanti del canale sodio altamente tossico può essere applicata con successo negli studi di perfusione. Infine, nel modello di aspersione possa essere direttamente valutato dove nell'intestino un certo composto stimola la secrezione di un ormone di alcuni, come lo sperimentatore può semplicemente scegliere e preparare la regione desiderata per irrorare, e allo stesso tempo possono essere analizzato Se uno stimolo provoca secrezione dall'attivazione dei sensori molecolari dal lato luminal o vascolare dell'intestino^3,15,16.

I meccanismi secretivi sottostante la secrezione dell'ormone dell'intestino può essere studiata anche da usare dei pezzi di tessuto di intestino (compreso il tessuto umano), colture primarie intestinale (di solito da topi), immortalate ormone secernente linee cellulari (di origine umana o mouse), gut Tessuto montato negli alloggiamenti di Ussing o da organoids (entrambi più spesso dai topi)^{2,3,4,5,6,17,18}. Rispetto per le aspersioni intestinale, studi su pezzi di intestino umano, colture primarie e linee cellulari sono tecnicamente più facili da eseguire e sono un modo più veloce e più conveniente di generazione di dati, ma naturalmente lo studio di pezzi di intestino richiede l'accesso a intestino umano fresco esemplari. Tuttavia, in questi modelli la polarizzazione delle cellule normali dell'intestino è intrinsecamente perduta, significato che questi modelli non possono essere utilizzati per valutare la normale attivazione di sensori molecolari, e non possono essere studiati anche i processi di assorbimento. Inoltre, tali studi solitamente impiegano le incubazioni statiche (per fino a diverse ore) che è altamente non-fisiologica e non ha nulla a che fare con dinamiche secretivo normale delle cellule, perché il prodotto secreto non viene rimosso e così il feedback possono influenzare la secrezione di ormoni. Al contrario, nell'intestino irrorato, molecole secrete e assorbite in modo efficiente sono rimosse tramite la microcircolazione mucosa come sono vivo, assicurando che i gradienti transmucosale sono mantenuti così assorbimento e secrezione possono accadere ad un tasso normale. Inoltre, colture cellulari possono avere dedifferenziate dalla loro origine delle cellule enteroendocrine nativo, che significa che non sono più rappresentante delle cellule native in termini di contenuto di peptide e l'espressione di sensori molecolari, anche se essi possono ancora secernono l'ormone in questione. Questo è, per esempio, il caso per GLP-1 che secerne cella linee¹⁹.

Pertanto, è nostra opinione che colture cellulari primarie o cella linea studi sono più adatti ai fini dello screening e per eseguire esperimenti di tipi che non possono essere eseguite in vivo o nell'intestino irrorato isolato. Per esempio, un vero punto di forza delle colture cellulari primarie e colture cellulari linea è quello intra-cellulare secondario messaggeri (ad esempio Ca^{2 +}, cAMP, nad possono essere monitorati in tempo reale, e segnali elettrici dell'ormone che secerne le celle possono essere studiato^20,21,22. Inoltre, può essere fatto siRNA atterramento, che è particolarmente utile se gli inibitori specifici non sono disponibili^{20,21,22,23,24}. Tessuto dell'intestino dai topi montati in alloggiamenti di Ussing recentemente è stato usato per studiare i meccanismi molecolari sottostanti la secrezione di GLP-1 stimolata dell'acido di bile, mentre organoids intestinale (da topi) e pezzi di intestino umano inoltre sono stati usati per studiare il dettagli molecolari di intestino ormone secrezione^17,25. Considerando che l'ex beneficia di essere polarizzati² tutti questi modelli coinvolgono le incubazioni di statiche. Studi su pezzi di intestino umano, tuttavia, trarre vantaggio dall'utilizzo del tessuto umano, piuttosto che del roditore, che è importante poiché la differenza di specie in espressione tissutale dei recettori 7TM e trasportatori molecolari possono comportare diversi percorsi di telerilevamento molecolare tra specie. Infatti, la maggior parte dei dati in questo campo è stata generata dagli studi su maiali, topi o ratti, e rimane inafferrabile se questi risultati possono essere trasferiti agli esseri umani. È, tuttavia, rassicurante che i meccanismi di rilevamento molecolari che sono alla base della secrezione glucosio-stimolata di GLP-1 sembrano essere simili tra mouse, ratto, uomo, e trascrittomica e peptidomica profilatura di mouse e L-cellule umane hanno rivelato forte globale somiglianze tra le due specie^7,18,26,27.

Il piccolo intestino irrorato isolato del ratto, tuttavia, ha anche alcune limitazioni che devono essere considerati. La cosa più importante, è Impossibile determinare se una determinata risposta secretiva risultati da attivazione diretta dalla sostanza in esame delle cellule producono ormoni mirate o piuttosto è causato da un meccanismo indiretto. Per esempio, KCl istantaneamente aumenta la secrezione di GLP-1 dalla dell'intestino irrorato⁷, ma rimane sconosciuto se questa è una conseguenza della depolarizzazione diretta della cellula L o risultati dalla depolarizzazione dei neuroni vicino L-cellule o effetti di rilasciato contemporaneamente paracrine stimolatori/inibitori. Dati derivanti da studi utilizzando l'intestino irrorato che mirano a delucidare i meccanismi molecolari alla base di secrezione pertanto, dovrebbero sempre essere messo in contesto con i dati ottenuti da altri modelli più specifici per aumentare la capacità di stabilire causalità. Per esempio, secrezione di GLP-1 glucosio-stimolata dalla linea cellulare che secerne GLP-1 GLUTag^28,29 e dal primario del mouse L-cellule dipendono dall'attività dei trasportatori del glucosio (SGLT1 e GLUT2). Bloccando questi trasportatori nel piccolo intestino irrorato del ratto inoltre attenua la secrezione²⁰, significa che è probabile che la secrezione di GLP-1 glucosio-stimolata in gran parte è mediata da azioni dirette del glucosio sulla cellula L. Un'altra limitazione importante dell'intestino irrorato isolato è che alcuni dei lipidi sono difficili da studiare a causa della loro idrofobicità. Anche se è possibile indagare i prodotti finali della digestione dei lipidi (acidi grassi, diacil glicerolo, lysophosphatidylglycerols, ecc.) e anche se la preparazione può essere in grado di ri-esterificare i lipidi intra-cellularly e forse imballarli in chilomicroni, il trasporto dei chilomicroni fuori le cellule e il loro successivo assorbimento di lacteals dei villi è interrotto, dato che il flusso della linfa nell'intestino isolato non può essere protetto. Molto probabilmente, di conseguenza, l'assorbimento dei lipidi viene interrotta una volta che i prodotti assorbiti iniziano ad accumularsi nelle cellule. I sistemi cellulari in vitro sono ancor meno adatti per gli studi dei lipidi a causa della loro mancanza di polarizzazione. Ovviamente, questa limitazione è rilevante solo per i lipidi che sono assorbiti e trasportati tramite il lacteals, mentre quelli assorbiti attraverso i vasi sanguigni intestinali sono suscettibili di essere gestite normalmente.

Protocollo

Tutti gli studi sono stati condotti con autorizzazione da parte dell'Ispettorato di esperimenti di animale (2013-15-2934-00833) danese e comitato etico locale, conformemente agli orientamenti della legislazione danese sulla sperimentazione animale (1987) e la nazionale Istituti di salute (numero di pubblicazione 85-23).

1. sperimentali animali

1. Ottenere i ratti maschii di Wistar (250 g) e casa 2 per gabbia, con ad libitum accesso a cibo standard e acqua e mantenere in un 12:12 h ciclo luce-buio. Le nostre strutture di animali utilizza acqua non trattata e Alrtromin roditore chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Danimarca).
   Nota: Gli animali ammessi almeno una settimana di acclimatazione.

2. preoperative preparazioni

1. Rendere l'aspersione buffer: soluzione tampone del bicarbonato della Krebs-soneria completati con 0.1% BSA (frazione V), 5% Destrano T-70, 3,5 mmol/L glucosio e piruvato 5 mmol/L, fumarato e glutammato (se necessario); pH 7,4.
2. Preparare una quantità adeguata di buffer di aspersione filtrandola attraverso una dimensione appropriata del filtro e regolare il pH a ~7.5 da 5 M HCl aggiunta goccia a goccia.
3. Aggiungere 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (se necessario) direttamente al buffer il giorno dello studio a una concentrazione finale di 10 µM.
   Nota: IBMX è un inibitore della fosfodiesterasi che aumenta [cAMP]_io e quindi Ripristina la sensibilità e la reattività dell'intestino in termini che secerne ormoni ad uno stimolo secretivo.
4. Preparare soluzione/i test. Preparare gli stimoli vascolari a una concentrazione più elevata rispetto alla concentrazione finale desiderata nel buffer di aspersione filtrata e pH-regolato di 20x. Preparare test luminal stimoli in soluzione fisiologica alla concentrazione finale.
5. Sciogliere i composti non prontamente solubili in 100% dimetilsolfossido (DMSO) e diluire ulteriormente nel buffer di aspersione o soluzione fisiologica. Per stimoli vascolari, mantenere la concentrazione di DMSO finale a 1% o inferiore, come le concentrazioni sopra ciò danneggiare l'intestino e può portare alla secrezione di ormone intestinale aspecifica. Misurare il pH e se necessario regolare per ~7.5.

3. funzionamento e perfusione

Nota: Un'illustrazione di un setup di perfusione è fornita nella Figura 1.

1. Anestetizzare i ratti dall'uso di un regime anestetico che possa sostenere l'anestesia chirurgica e analgesia per 30-40 min di Hypnorm/Midazolam (peso corporeo di 0,3 ml/100 g, al ml: Hypnorm: 0,08 mg di fentanil, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg metil paraidrossibenzoato, 0,05 mg Propile paraidrossibenzoato, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Danimarca)
2. Verifica per mancanza di riflessi (pizzico di punta), posizionare il topo sul tavolo operatorio riscaldato ed effettuare un'incisione della pelle per esporre l'intestino.
3. Esporre la parte terminale del colon spostando il piccolo intestino da parte quanto possibile. Cravatta di fornitura sistema vascolare per il colon e accise gradualmente a partire dalla parte terminale del colon, muovendo verso l'intestino tenue.
   1. Se solo una certa parte dell'intestino tenue è richiesta per la perfusione (metà superiore), è possibile asportare segmenti non necessari dopo la legatura fuori fornitura sistema vascolare. Per ridurre al minimo i danni ai tessuti, idratare l'intestino con soluzione fisiologica e utilizzare tamponi per rimuovere il tessuto connettivo.
4. Inserire un tubo di plastica (lunghezza: ~ 15 cm, diametro esterno: ~0.4 cm) nel lume intestinale (nella parte prossimale) e cravatta correttamente utilizzando suture. Sciacquare accuratamente con soluzione fisiologica (temperatura ambiente) per svuotare il lume di chimo.
5. Irrorare il lume con soluzione fisiologica a un flusso di 0,25 mL/min, utilizzando una siringa da 10 mL collegata ad una pompa a siringa.
6. Spostare l'intestino da parte quindi l'arteria mesenterica superiore è accessibile e rimuovere il tessuto connettivo e grasso per esporre l'arteria.
7. Posizionare due suture sotto l'arteria mesenterica usando il forcipe punta fine; uno delle suture è per il sollevamento dell'arteria per controllare lo spurgo una volta che è stato tagliato l'arteria e l'altro è per il fissaggio del catetere che deve essere posizionato nell'arteria. Fare attenzione non per perforare l'arteria.
8. Posizionare due suture sotto la vena portale per fissare il catetere in metallo che sta per essere inserito nella vena per la raccolta dell'effluente di aspersione.
9. Prima di tagliare il foro nell'arteria mesenterica, assicurarsi che il catetere che sta andando a inserito nell'arteria è riempito con buffer di perfusione per evitare la formazione di embolo di aria.
10. Tagliare un piccolo foro nell'arteria mesenterica usando un paio di forbici chirurgiche e inserire il catetere di plastica subito dopo.
11. Immediatamente dopo il catetere è stato protetto, avviare la perfusione dell'intestino avviando la pompa roller (portata = 7,5 mL/min).
12. Confermare che i vasi sanguigni nell'intestino impallidire in pochi secondi, e la vena portale impallidisce.
13. Immediatamente dopo adeguata perfusione è stata stabilita, praticare un foro nella vena portale, inserire il catetere in metallo e fissarlo con la sutura.
    Nota: Il catetere può essere difficile a posto ma alzando la vena tirando con cautela l'aiuta di sutura più prossimale.
14. Una volta che i cateteri sono a posto e perfusione output è soddisfacente, è possibile uccidere il ratto da perforazione della membrana, facendo attenzione a non strappare i cateteri.
15. Raccogliere l'output di perfusione per 1 min e misurare il volume. Avviare l'acquisizione/registrazioni di pressione di aspersione di scatto Eseguire esperimento nel programma di registrazione di pressione.
16. Coprire l'intestino con panno inumidito per evitare che si secchino durante l'esperimento.
17. Assicurarsi che l'estremità distale dell'intestino non sia bloccato affinché l'effluente luminal può uscire, altrimenti si gonfia l'intestino, l'edema si svilupperà, aumenterà la pressione di aspersione e cadrà con l'uscita di aspersione.
18. Lasciare la preparazione per circa 30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
    Nota: Le uscite secretive degli ormoni dell'intestino sono molto instabile per i primi 15 min di aspersione, quindi questo passaggio di equilibrazione è necessaria per ottenere una linea di base stabile.

4. esperimento

1. Dopo circa 30 min di aspersione, iniziare l'esperimento di raccolta del primo campione basale usando un collettore di frazione. Raccogliere campioni all'intervallo di tempo desiderato (ad esempio, sono normalmente raccolti ogni min, 6.5-7.5 mL) e metterli su ghiaccio entro pochi minuti.
2. Ispezionare regolarmente il ferma-bolle e, se svuotato, riempirlo con buffer di aspersione.
   1. Raccogliere il buffer attraverso il gallo-valvola a tre vie immediatamente prima che entri l'organo e dal catetere inserito nella vena portale (dopo esso è stato irrorato attraverso l'organo) per confermare che l'organo è metabolicamente attivo. Raccogliere campioni all'inizio e alla fine dell'esperimento per valutare la vitalità in tutto l'esperimento.
   2. Misurare campioni rapidamente, con un analizzatore automatizzato di gas del sangue, come più plastica contiene/siringhe non sono completamente ermetiche, dando luogo per lo scambio con l'aria atmosferica.
3. Dopo 10-15 min di raccolta della linea di base, stimolare con la sostanza in esame prima. Amministrare le stimolazioni intra-arteriose con una pompa a siringa attraverso un rubinetto a tre vie (flusso = 0,350 mL/min).
4. Eseguire stimolazioni luminal di un'iniezione del bolo iniziale (2,5 mL/min oltre i primi 5 min), per sostituire la soluzione fisiologica che è già nel lume, seguito dalla somministrazione della soluzione da analizzare una portata minore (0,5 mL/min).
5. Per garantire che il lume viene rapidamente svuotato della sostanza in esame una volta che il periodo di stimolazione luminal, irrigare il lume intestinale con soluzione salina isotonica applicando tassi di flusso stesso come sopra.
6. Raccogliere campioni di baseline per 15-30 min prima che la sostanza in esame successiva viene somministrata. A seconda del protocollo, stimoli di 2-3 test di solito possono essere inclusi per esperimento. Se il protocollo sperimentale include attivazione/inibizione di un determinato sito molecolare simultaneamente con la somministrazione di un secretagogo determinato, sempre pre-stimolare con l'inibitore dell'attivatore/10-15 min prima dell'amministrazione di secretagogo per Accertarsi che il sito molecolare è bloccato all'inizio dell'infusione di secretagogo.
7. Alla fine del protocollo, è necessario amministrare (5-10 min) un controllo positivo adatto per testare per la reattività della preparazione e raccogliere campioni di riferimento di 10-15 min dopo il periodo di stimolazione.
   Nota: Diversi test sostanze possono essere utilizzati come controllo positivo, per esempio, stimoli per crescente [cAMP]_io (ad es., foskolin o IBMX), [Ca^{2 +}]_i (ad es., bombesina o Neuromedina C), depolarizzanti agenti (per esempio, 30-50 mM KCl) o più stimoli fisiologicamente rilevanti quali macronutrienti: glucosio, peptoni, amminoacidi, ecc. Tuttavia, la scelta di controllo positiva dipende dal risultato sperimentale. Glucosio è per esempio un secretagogo povero colecistochinina (CCK) mentre bombesina non è un robusto secretagogue per insulinotropico glucosio-dipendente del peptide (GIP) secrezione³⁰.
8. Al termine dell'esperimento, asportare l'intestino irrorato, pesare e misurare la sua lunghezza. Metterlo in paraformaldeide e conservarla (4 ° C) per potenziale più tardi analisi istochimica di integrità/danni ai tessuti, per esempio da H & E che macchia.

5. biochimiche misure

1. Quantificare le concentrazioni di peptidi secreti nell'effluente venoso mediante uso di un in-House o commercialmente disponibili metodiche radioimmunologiche (RIA) o analisi di ELISA. Per gli studi che indagano l'assorbimento intestinale, quantificare la molecola di interesse, ad esempio, del glucosio o aminoacidi, nell'effluente venoso.
   Nota: Il perfusato è di solito un buon buffer basale per la maggior parte delle analisi, tra cui le analisi che si basa su reazioni enzimatiche (ad esempio di quantificazione di glucosio dal metodo glucoseoxidase).

6. analisi dei dati

1. Presentare i dati in diversi modi, ad esempio come un grafico di tempo-concentrazione visualizzando l'output effettivo secretiva (flusso x concentrazione) e come trama di colonna raffigurante il totale secretivo uscita durante i periodi della linea di base e la risposta (solitamente punti di tempo di 10-15).
2. Tracciare la concentrazione misurata effettiva dei rispettivi ormoni come unità di concentrazione. (pmol/L),
   Nota: È preferibile invece esprimere dati come output (fmol/min), perché con questo modello, in contrasto con gli studi in vivo, i valori ottenuti sono l'output effettivo secretiva (a causa di costante raccolta di effluente di perfusione).
3. A seconda del numero di gruppi per essere analizzati statisticamente, uso due code accoppiato t-test (due gruppi) o One-way ANOVA per misure ripetute (due o più gruppi) seguita da un test post-hoc appropriato per i confronti multipli.

Risultati

La capacità di determinare se un dato stimolo provoca la secrezione dell'ormone dell'intestino di interesse si basa su una secrezione basale costante. Inoltre, se nessuna risposta allo stimolo è osservata, una robusta risposta secretiva per il controllo positivo deve essere evidente per escludere che la mancanza di risposta allo stimolo test non riflette una generale mancanza di reattività. Figura 2A e 2B Mostra un esempio di dati di buona...

Discussione

Il piccolo intestino irrorato isolato del ratto è un potente strumento di ricerca che permette le dinamiche e i meccanismi molecolari alla base di secrezione dell'ormone dell'intestino per essere studiato nei minimi dettagli. Il punto più critico per il successo della produzione di dati con questo modello è l'intervento chirurgico. Manipolazione dell'intestino causerà inevitabilmente qualche danno all'intestino e dovrà perciò essere mantenuto per un assoluto minimo. Ancora più importante, la velocità di funzionam...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA)	Merck	1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)	Merck	102382
Dextran 70	Pharmacosmos	40014
Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4)	Sigma Aldrich	F9642
Glucose (C6H12O6)	Merck	108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)	Merck	105886
Potasium chloride (KCl)	Merck	104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Merck	104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)	Merck	106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck
Sodium chloride (NaCl)	Merck	106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)	Merck	106445
Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion equitment
Universial perfusion system	Harvard Bioscience, Inc.	732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834	Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channels	Harvard Bioscience, Inc.	730100
Windkessel	Harvard Bioscience, Inc.	732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz	Harvard Bioscience, Inc.	730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873	Harvard Bioscience, Inc.	733776
Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm	Harvard Bioscience, Inc.	733313