Struttura di cristallo del dominio N-terminale del recettore Ryanodine da Plutella xylostella

Riepilogo

In questo articolo, descriviamo i protocolli della determinazione di espressione, purificazione, cristallizzazione e struttura della proteina del dominio N-terminale del recettore rianodinico da diamondback moth (Plutella xylostella).

Abstract

Sviluppo di insetticidi potenti ed efficienti targeting recettori della rianodina insetto (RyRs) è stato di grande interesse nella zona di controllo dei parassiti agricoli. Ad oggi, diversi insetticidi diammide targeting dei parassiti che RyRs sono stati commercializzati, che generano un fatturato annuo di 2 miliardi di dollari. Ma la comprensione del modo di azione degli insetticidi RyR-targeting è limitata dalla mancanza di informazioni strutturali per quanto riguarda insetto RyR. Questo a sua volta limita la comprensione dello sviluppo della resistenza agli insetticidi in parassiti. Il diamondback moth (DBM) è un parassita devastante distruggendo crocifere raccolti in tutto il mondo, che inoltre è stato segnalato per mostrare resistenza agli insetticidi diammide. Pertanto, è di grande importanza pratica per sviluppare nuovi insetticidi il RyR DBM, targeting soprattutto per una regione diversa dal sito di legame tradizionale diammide di targeting. Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare strutturalmente il dominio N-terminale di RyR da DBM. La struttura di cristallo dei raggi x è stato risolto da sostituzione molecolare ad una risoluzione di 2,84 Å, che mostra un motivo di beta-trefoil pieghevole e un accompagnamento alfa elica. Questo protocollo può essere adattato per l'espressione, purificazione e caratterizzazione strutturale di altri domini o proteine in generale.

Introduzione

Recettori della rianodina (RyRs) sono canali ionici specifici, che mediano la permeazione degli ioni Ca^{2 +} attraverso le membrane del reticolo sarcoplasmatico (SR) nelle cellule muscolari. Di conseguenza, giocano un ruolo importante nel processo di accoppiamento eccitazione contrazione. Nella sua forma funzionale, RyR monta come un homo-tetramero con una massa molecolare di > 2 MDa, con ogni unità secondaria che contengono residui dell'amminoacido ~ 5000. Nei mammiferi, ci sono tre isoforme: RyR1 - tipo di muscolo scheletrico, muscolo cardiaco tipo di RyR2 - e RyR3-ubiquitariamente espressa in diversi tessuti¹.

Negli insetti c'è un solo tipo di RyR, che si esprime nel tessuto muscolare e nervoso². Insetto RyR è più simile a mammiferi RyR2 con un'identità di sequenza di circa il 47%³. Insetticidi di diammide targeting RyR di lepidotteri e coleotteri sono stati sviluppati e commercializzati da importanti aziende come Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) e Syngenta (cyantraniliprole). Dal suo lancio relativamente recente, diammide insetticidi sono diventati uno della più rapida crescita classe di insetticidi. Attualmente, le vendite di questi tre insetticidi annualmente hanno attraversato 2 miliardi di dollari con un tasso di crescita di oltre il 50% dal 2009 (Agranova).

Gli studi recenti hanno segnalato lo sviluppo di resistenza negli insetti dopo poche generazioni di utilizzo di questi insetticidi^4,5,6,7,8. Le mutazioni di resistenza nel dominio del transmembrane di RyRs dal diamondback moth (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) e le corrispondenti posizioni in pomodoro minatrice, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) mostrano che la regione potrebbe essere coinvolto nel legame di insetticida diammide come questa regione è conosciuta per essere critico per gating del canale^4,8,9. Nonostante approfondite ricerche in questo settore, i meccanismi molecolari esatti di insetticidi diammide rimangono evasivi. Inoltre, non è chiaro se le mutazioni di resistenza riguardano le interazioni con diamides direttamente o allosterico.

Precedenti studi hanno segnalato la struttura dei diversi domini di RyR da specie di mammiferi e la struttura del full-length dei mammiferi RyR1 e RyR2 di cristallografia a raggi x e microscopia crio-elettronica, rispettivamente^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Ma finora, nessuna struttura di insetto RyR è stata segnalata, che ci impedisce di comprendere le complessità molecolare della funzione del ricevitore come pure i meccanismi molecolari di azione insetticida e lo sviluppo della resistenza agli insetticidi.

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo generalizzato per la caratterizzazione strutturale del dominio β-trifoglio N-terminale del recettore rianodinico dal diamondback moth, un parassita distruttivo infettare crocifere colture in tutto il mondo²². Il costrutto è stato progettato secondo il coniglio pubblicati RyR1 NTD cristallo strutture^23,24e cryo-EM modelli strutturali^{16,17,18,19, 20 , 21}. Questa è la prima struttura ad alta risoluzione segnalata per insetto RyR, che rivela il meccanismo per canale gating e fornisce un modello importante per lo sviluppo di specie-insetticidi utilizzando Progettazione di farmaci basati su struttura. Per delucidazione della struttura, abbiamo impiegato la cristallografia a raggi x, che è considerato come il 'gold standard' per la determinazione della struttura della proteina a vicino a risoluzione atomica. Anche se il processo di cristallizzazione è imprevedibile e alta intensità di manodopera, questo protocollo passo-passo vi aiuterà i ricercatori di esprimere, purificare e caratterizzare altri domini di insetto RyR o qualsiasi altre proteine in generale.

Protocollo

1. clonazione di Gene, l'espressione della proteina e la purificazione

1. PCR amplificare il DNA corrispondente alla proteina di interesse (residui 1-205 di DBM RyR, Genbank ACC. n. AFW97408) e clone in animali-28a-HMT vettore di clonazione di legatura-indipendente (LIC)²⁵. Questo vettore contiene un tag di istidina, MBP tag e un sito di clivaggio della proteasi TEV al N-terminale¹⁵.
   1. Progettazione LIC primer per l'amplificazione del gene bersaglio con LIC-compatibile 5' le estensioni:
      Forward primer LIC:
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      Reverse primer LIC:
      5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'
   2. Combinare i componenti di reazione (50 μL): 1 μL di modelli di DNA (100 ng/μL), 1 μL di forward primer (10 μM), 1 μL di reverse primer (10 μM), 0,5 µ l di DNA polimerasi (NEB), 5 μL di reazione 10X tampone, 1 μL di dNTP (25 mM) , 40,5 μL della RNasi free ddH₂O.
      1. Inserire la miscela di reazione in una macchina PCR ed eseguire il seguente programma.
      2. Incubare a 95 ° C per 3 min, e quindi eseguire 30 cicli di (95 ° C per 30 s, 58 ° C per 15 s, 72 ° C per 1 min). Incubare a 72 ° C per 5 min e quindi tenere a 4 ° C.
      3. Eseguire il mix di reazione intera (50 μL) su un gel di agarosio al 2% ed estrarre con un Kit di estrazione del Gel. Seguire il protocollo del produttore.
   3. Legatura-indipendente clonazione (LIC)
      1. Eseguire SspI digestione (60 µ l): 20 μL di DNA di vettore (50 ng/μL), 6 μL di tampone di reazione, 4 μL di SspI e 30 μL di ddH₂O. Incubare a 37 ° C per 3 h. eseguire l'intera reazione: 10x mescolare su gel di agarosio 1% ed estrarre con un Kit di estrazione del Gel. Seguire il protocollo del produttore.
      2. Eseguire trattamento T4 DNA polimerasi del vettore e inserire il DNA. Combinare i seguenti: 5 μL di DNA vettore o insert (50 ng/μL), 2 μL di tampone di 10 x T4 DNA polimerasi, 1 μL del dGTP (25 mM) per vettore o 1 μL di dCTP (25 mM) per inserimento del DNA, 1 μL di DTT (100 mM), 0,4 μL di T4 DNA polimerasi (LIC-qualificato) e 9.6 μL di reazioni di ddH₂O. Incubare a temperatura ambiente per 40 min. inattivare con il calore enzima a 75 ° C per 20 min.
         Nota: Il vettore LIC e inserimento del DNA devono essere trattati in reazioni separate.
      3. Eseguire la reazione di ricottura di LIC. Combinare i seguenti: 2 µ l di DNA di T4-trattati inserto, 2 μL di LIC T4-trattati di vettore del DNA. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 10 min.
2. Trasformare BL21 (DE3) Escherichia coli cellule con questo plasmide ricombinante.
   1. Scongelare le cellule competenti (50 μL in micro-provetta) sul ghiaccio.
   2. Aggiungere circa 1 μL (50 ng) del plasmide nel tubo. Mescolare le cellule e DNA scorrendo delicatamente il tubo 2 – 3 volte. Porre la provetta in ghiaccio per 20 min.
   3. Riscaldare shock a 42 ° C per 40 s. posto il tubo sul ghiaccio ancora per 2 min. aggiungere 1 mL di LB di temperatura media per il tubo.
   4. Posto il tubo miscela nello shaker 250 giri/min a 37 ° C per 45 min. sviluppa 150 – 200 µ l della miscela nei piatti di selezione. Capovolgere la piastra e incubare per una notte a 37 ° C.
3. Scegli una singola Colonia e cultura le cellule in 100 mL di terreno di 2YT contenente 50 kanamicina µ g/mL a 37 ° C durante la notte. Mattina successiva, inoculare medio 2YT 1 L contenente 50 kanamicina µ g/mL 10 ml di coltura durante la notte e incubare in incubatore a 37 ° C agitatore a 250 giri/min, fino a quando raggiunge il OD₆₀₀ ~ 0.6. Da allora in poi indurre la cultura con IPTG ad una concentrazione finale di 0,4 mM e crescere per un altro 5 h a 30 ° C.
4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C, raccogliere le cellule e risospendere ogni cellule di 10 g in 40 mL di tampone di lisi (10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10mm β-mercaptoetanolo, lisozima di 25 μg/mL, 25 μg/mL dnasi 1 mM PMSF).
   1. Interromperla tramite sonicazione ad ampiezza di 65% per 8 min con 1 s s on e 1 fuori. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 40.000 x g per 30 min a 4 ° C. Filtrare il surnatante passando attraverso il filtro di 0,22 μm e caricarlo nel loop del campione.
5. Purificare la proteina di fusione, fendere il tag e ri-purificare la proteina bersaglio.
   1. Purificare la proteina di fusione utilizzando colonna Ni-NTA (buffer obbligatorio: 10 mM a pH 7.4, 250 mM KCl HEPES; tampone di eluizione: 10 mM a pH 7.4, 250 mM KCl, imidazolo 500 mM HEPES) e purificare da un sistema di depurazione, con una sfumatura lineare di imidazolo 20 – 250 mM.
   2. Fendere la proteina bersaglio eluiti con proteasi TEV (01:50 rapporto) overnight a 4 ° C.
   3. Purificare la miscela di reazione di scissione tramite colonna di resina di amilosio (buffer obbligatorio: 10 mM a pH 7.4, 250 mM KCl HEPES; tampone di eluizione: 10 mM a pH 7.4, 250 mM KCl, maltosio 10 mM HEPES) e colonna Ni-NTA per rimuovere il tag e proteasi TEV. La proteina dell'obiettivo sarà nella frazione del flusso continuo di queste due colonne.
   4. Dializzare il campione contro il buffer di dialisi (10 mM Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 10mm β-mercaptoetanolo per ridurre la concentrazione di sale. Purificare il campione su una colonna di scambio anionico (buffer obbligatorio: 10 mM Tris-HCl a pH 8.8, 10mm β-mercaptoetanolo; tampone di eluizione: 10 mM Tris-HCl a pH 8.8, 1m KCl, 10mm β-mercaptoetanolo) da una sfumatura lineare di 20 – 500 mM KCl nel buffer di eluizione.
   5. Come ultimo passo nel processo di purificazione, concentrare la proteina utilizzando concentratore centrifugo (10 kDa MWCO) e iniettare in una colonna di gel-filtrazione Superdex 200 26/600 per verificare l'omogeneità.
6. Esaminare la purezza della proteina in esecuzione su un 15% SDS pagina.
   Nota: Tutte le colonne sono in esecuzione su un sistema di purificazione della proteina con una portata di associazione di 2 mL/min e un tasso di flusso di eluizione di 4 mL/min ad eccezione di gel-filtrazione a 1 mL/min.

2. proteina preparazione e cristallizzazione

1. Concentrare il campione proteico purificato a 10 mg/mL utilizzando concentratore centrifugo (10 kDa MWCO) e lo scambio di buffer buffer cristallizzazione prima della conservazione a-80 ° C.
2. Eseguire lo screening di cristallizzazione (rapporto 1:1, 200 nL di proteina e 200 nL del buffer serbatoio) di seduta drop metodo di diffusione del vapore a 295 K con diversi kit di cristallizzazione utilizzando un liquido automatico movimentazione robotizzata in un formato a 96 pozzetti.
   Nota: Abbiamo utilizzato i kit da ricerca dimensioni molecolari e Hampton e il Grifone automatizzato sistema di gestione dei liquidi.
3. Sigillare la piastra 96 pozzetti cristallizzazione per evitare l'evaporazione e abilitare l'equilibrazione della proteina goccia con il buffer di serbatoio. Quindi tenere le piastre nell'incubatore cristallo a 18 ° C.
4. Controllare le piastre da 96 pozzetti periodicamente utilizzando un microscopio ottico per monitorare la crescita e la formazione di cristalli.
5. Per distinguere i cristalli della proteina da cristalli di sale, usare un colorante di proteina. Aggiungere 1 µ l di colorante per il drop di destinazione. Attendere circa 1 h e osservare al microscopio. I cristalli della proteina diventerà blu.
6. Utilizzare le condizioni di cristallizzazione positivo (solfato di ammonio di 1,5 M, 0.1 M Tris-HCl pH 8.0) per ottimizzare ulteriormente i cristalli con impiccagione vapor-diffusione metodo drop in piastre da 24 pozzetti.
   1. Ottimizzare pH da 7.0 a 8.5 con intervallo di unità di pH 0,5 ogni passo. Ottimizzare la concentrazione di solfato di ammonio da 1,2 M a 1,7 M con intervallo di 0,1 M ogni passo. (Nel nostro caso la migliore condizione producendo grandi cristalli a forma di piastra era solfato dell'ammonio 0,1 M HEPES pH 7.0 e 1.6 M)

3. Crystal montaggio, raccolta di dati di raggi x e determinazione della struttura

1. Montare i cristalli in un cryoloop e flash-cool in azoto liquido con serbatoio soluzione contenente 20% glicerolo come cryo-protectant. Posizionare i cristalli in unipuck per immagazzinaggio e trasporto.
2. Pre-schermo cristalli della proteina usando un diffractor di raggi x in-House Verian. Scegliere i migliori con le risoluzioni più alte per la raccolta di dati presso sincrotrone (nostro dataset è stato raccolto da BL17U1 presso Shanghai Synchrotron Radiation Facility).
   1. Utilizzare il software di controllo beamline BluIce²⁶ per montare e centrare i cristalli dalla funzione di centraggio automatica o manuale. Eseguire le esposizioni di prova per determinare la strategia di raccolta dei dati, compreso l'avvio di angolo, tempo di esposizione, distanza rivelatore, Larghezza telaio e numeri.
   2. Raccogliere il dataset di conseguenza (abbiamo raccolto 180 telai con 1 tempo di esposizione di s, Larghezza telaio 1° e la distanza di rivelatore di 350 mm).
3. Indice, integrare e scalare il dataset utilizzando HKL2000 suite²⁷. Prima di svolgere la funzione di ricerca di picco per trovare i punti di diffrazione e quindi i punti di indice e selezionare il gruppo giusto spazio. Dopo l'integrazione del picco, scala il dataset con il modello corretto errore e salvare il file di output. SCA.
4. Risolvere il problema di fase di rimontaggio molecolare usando Phaser²⁸ PHENIX²⁹.
   1. Calcolare il numero di possibili copia di molecole proteiche nell'unità asimmetrica di Xtriage³⁰.
   2. Cercare i modelli di struttura adeguata con la somiglianza strutturale e di identità in sequenza ad alta come la proteina dell'obiettivo utilizzando strutture note dalla letteratura o i modelli generati da server di predizione di struttura come Phyre2³¹ (abbiamo usato coniglio RyR1 NTD come un modello di ricerca, PDB ID 2XOA).
   3. Eseguire Phaser utilizzando il file di dati di diffrazione, il file di struttura del modello e il file di sequenza della proteina per trovare la soluzione.
5. Eseguire AutoBuild³² PHENIX²⁹ per generare il modello iniziale utilizzando il file di output da Phaser e il file di sequenza da proteina bersaglio.
6. Costruire la struttura nella densità dell'elettrone sperimentale modificate utilizzando folaga³³ e perfezionare usando phenix.refine³⁴ in cicli iterativi manualmente.
7. Convalidare il modello finale utilizzando gli strumenti di convalida di PHENIX¹⁸.

Risultati

Purificazione

Il dominio N-terminale di RyR DBM è stato espresso come proteina di fusione con un tag di hexahistidine, un tag MBP e un sito di clivaggio della proteasi TEV. Abbiamo seguito una strategia di cinque fasi di purificazione per ottenere una proteina altamente pura, adatta a scopo di cristallizzazione. In un primo momento, la proteina di fusione è stata purificata dalla frazione solubile del lysate delle cellule di colo...

Discussione

In questo articolo, descriviamo la procedura per recombinantly esprimere, purificare, cristallizzare e determinare la struttura di DBM RyR NTD. Per cristallizzazione, un requisito fondamentale è quello di ottenere proteine con omogeneità, purezza e solubilità alta. Nel nostro protocollo, abbiamo scelto di utilizzare animali-28a-HMT vettoriale in quanto contiene un tag hexahistidine e MBP, entrambi i quali potrebbero essere utilizzati per la purificazione ottenere una maggiore purezza di piega. Inoltre, gli aiuti di ta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37