Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare popolazioni di cellule endoteliali linfatiche all'interno del fegato usando gli indicatori descritti. Utilizziamo collagenasi IV e DNasi e una delicata macinazione del tessuto, combinato con citometria a flusso, per identificare una popolazione distinta di cellule endoteliali linfatiche.

Abstract

All'interno del fegato, i vasi linfatici si trovano all'interno della triade portale e loro funzione descritta è per rimuovere il liquido interstiziale dal fegato ai linfonodi dove possono esaminarsi gli antigeni e detriti cellulari. Siamo molto interessati a capire come il sistema vascolare linfatico potrebbe essere coinvolti nell'infiammazione e nella funzione delle cellule immuni all'interno del fegato. Tuttavia, molto poco è stato pubblicato che stabilisce protocolli di digestione per l'isolamento di cellule endoteliali linfatiche (LECs) dal fegato o marcatori specifici che possono essere utilizzati per valutare il fegato LECs su base per cella. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per la digestione e la macchiatura del fegato al fine di valutare la popolazione di LEC nel fegato. Siamo sicuri che il metodo descritto qui sarà utile per l'identificazione e l'isolamento di LECs dal fegato e rafforzerà la nostra comprensione di come LECs rispondere il microambiente del fegato.

Introduzione

Il ruolo dei vasi linfatici e LECs nel fegato non è ben compreso. Mentre i vasi linfatici si trovano all'interno della triade portale del fegato¹ ed espandono durante la malattia², molto poco è capito per quanto riguarda la funzione e il fenotipo di LECs all'interno del fegato. Con la scoperta degli indicatori che si trovano principalmente il LECs³, l'importanza di queste cellule all'interno di nicchie differenti del tessuto nell'omeostasi e nella malattia riempirà una notevole lacuna nella nostra comprensione. LECs hanno un ruolo importante nel mantenimento della tolleranza periferica nel linfonodo ed in tumori metastatici interagendo direttamente con T cellule^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs nel linfonodo può promuovere l'immunità protettiva attraverso le loro interazioni con le cellule dendritiche migratori^14,15,16. Di conseguenza, non ci sono più ruoli per LECs che possono essere specifici per i tessuti e le interazioni in cui sono presenti. Tuttavia, molto poco è capito circa come LECs interagiscono con le cellule immunitarie nel tessuto o funzionamento di LECs in sistemi differenti dell'organo; quindi, valutando LECs su base per cella all'interno del fegato o altri organi può portare a progressi nel come LECs programma immunità tessuto-specifica. Mentre gran parte della letteratura che si concentra sulle LEC nel fegato utilizza la microscopia per visualizzare LECs utilizzando uno o due marcatori e morfologia¹⁷, molto poco è stato fatto per valutare specificamente LECs su base dalla cella mediante citometria a flusso, anche se uno studio ha fatto valutare le differenze tra le cellule endoteliali sinusoidali del fegato (LSECs) e LECs¹⁸. Essendo in grado di analizzare popolazioni LEC nel fegato tramite flusso cytometry consente lo studio approfondito del fenotipo LEC durante la normale omeostasi o malattia.

Per valutare il LECs mediante citometria a flusso, sono necessari più marcatori di superficie. In genere, LECs sono visualizzati dall'espressione di prospero-correlati homeobox 1 (Prox-1), ricevitore 1 (LYVE1) di hyaluronan endoteliale del vaso linfatico o del ricevitore di fattore di crescita endoteliale vascolare 3 (VEGFR3) usando la microscopia. Tuttavia, nel fegato, l'espressione di questi indicatori non è limitato al LECs. Prox-1 è ampiamente espressa dagli epatociti durante lo sviluppo del fegato, rigenerazione e lesioni¹⁹, e LYVE1 e VEGFR3 sono espresse da cellule endoteliali sinusoidali epatiche¹⁸. Nel linfonodo, LECs sono identificati mediante citometria a flusso come cluster di differenziazione (CD) CD45-, CD31 + e podoplanin + (PDPN)¹⁶. Tuttavia, questo approccio è troppo minimal per isolare LECs nel fegato, poiché le cellule CD45 - CD31 + catturerà le cellule endoteliali, e la popolazione predominante delle cellule endoteliali vascolari nel fegato è LSECs. Così, altri indicatori sono necessari per distinguere la popolazione di LEC rara da abbondante popolazione di LSEC. CD16/32 (espresso da maturo LSECs¹⁸) sia CD146 (un cellula endoteliale vascolare marcatore comune che è prevalentemente espresso entro i sinusoids del fegato da cellule endoteliali sinusoidali epatiche²⁰ con poca o nessuna espressione di linfatico cellule endoteliali²¹) erano marcatori candidati.

Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per isolare e visualizzazione LECs nel fegato utilizzando tali marcatori, CD45, CD31, CD146, CD16/32 e linfatico per citometria a flusso. Descriviamo l'uso della collagenasi IV, DNasi 1 e separazione meccanica per la digestione del tessuto del fegato in una sospensione unicellulare. Inoltre descriviamo l'uso di gradienti di densità di iodixanol per l'isolamento di cellule non parenchimali (NPC) e per eliminare i detriti cellulari. Infine, utilizzando più marcatori, determinare la strategia di gating di citometria a flusso ottimale per identificare LECs dal fegato con PDPN come il marcatore predominante.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Colorado Anschutz Medical Campus.

1. preparazione dei materiali

1. Fare una soluzione di 5 mg/mL di dnasi I in tampone fosfato salino (PBS).
2. Fai una miscela di digestione aggiungendo 5.000 U/mL di collagenasi IV ai media EHAA di clic.
3. Riscaldare la miscela di digestione a 37 ° C per 30 min prima dell'uso.
4. Fai un buffer di isolamento aggiungendo 4,8% albumina di siero bovino (BSA) e acido etilendiamminotetracetico 2mm (ed) a Hanks' soluzione salina (HBSS) equilibrata.
5. Fare un tampone di lisi di globuli rossi (RBC) con l'aggiunta di cloruro di ammonio di 100 mM, 10 mM KHCO₃e 0,1 mM EDTA a distillata H₂O.

2. preparazione di una sospensione di singola cellula da un fegato di topo

1. Eutanasia il mouse con CO₂ e dislocazione cervicale.
2. Spray giù il mouse con etanolo al 70% per bagnare la sua pelliccia. Perno del mouse piedi a un tavolo di dissezione.
3. Con dissezione le forbici per tagliare la pelle di circa 1 cm sopra l'ano, facendo attenzione a tagliare solo attraverso la pelle (circa 1 mm). Tirare la pelle dal corpo con il forcipe dentato e inserire le forbici tra la pelle e il peritoneo. Aprire le forbici per separare la pelle dal peritoneum e, quindi, tagliare la pelle dall'incisione al collo.
4. Pin la pelle alla scheda di dissezione utilizzando un pin sotto ogni braccio e sopra ogni gamba. Tirare il sac peritoneale e tagliare verso l'alto verso il collo. Afferrare i lobi del fegato e tagliare appena sotto lo sterno.
   Nota: Cura dovrebbe essere presa se qualsiasi del fegato verrà utilizzato per l'immunoistochimica (IHC).
5. Tagliare intorno al fegato e rimuovere il fegato dal mouse e posizionarlo in 4 mL di media EHAA di clic.
6. Usando un bisturi, tagliare il fegato in ~ 1 mm diametro pezzi.
7. Aggiungere 500 µ l di miscela la digestione e 500 µ l della dnasi I (2 mg/mL) per il fegato.
8. Incubare il fegato per 30 min a 37 ° C. Dopo 15 min, miscelare il liquido utilizzando una pipetta da 5 mL.
9. Dopo 30 minuti di incubazione, è necessario trasferire il campione digerito attraverso un colino di 100 µm a una provetta conica da 50 mL.
10. Spingere delicatamente i pezzi rimanenti attraverso il filtro con lo stantuffo della siringa 1 mL.
11. Lavare il filtro con 5 mL di buffer di isolamento e spingere delicatamente il tessuto con il colino con il dorso di uno stantuffo da una siringa da 1 mL. Ripetere questa operazione fino a quando il filtro viene lavato con 25 mL di buffer di isolamento.
12. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min. Aspirare accuratamente il sovranatante.
13. Risospendere il pellet con 4 mL di tampone di lisi RBC. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 min.
14. Lavare le cellule con 10 mL di buffer di isolamento e centrifugare a 400 x g per 5 min.
15. Contare le celle su un emocitometro per determinare il conteggio completo del fegato.
16. Risospendere le cellule in 5 mL di 20% iodixanol e strato di loro con 1 mL di PBS.
17. Centrifugare le cellule a 300 x g per 15 min senza freno.
18. Rimuovere lo strato tra il PBS e il iodixanol e inserirli, attraverso un filtro a 100 µm, in una nuova provetta conica 50 mL.
19. Lavare le cellule con 10 mL di buffer di isolamento e centrifugare a 400 x g per 5 min.
20. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 500 µ l di PBS con 2% siero bovino fetale (FBS).

3. analisi citofluorimetrica delle cellule singole dal fegato

1. Contare le celle con un emocitometro e microscopio, utilizzando l'esclusione del blu di trypan per misurare cellule vitali. Aggiungere 10 µ l di cellule a 10 µ l di blu di trypan e immediatamente li posto su un emocitometro e contare le cellule vive (non blu) sotto un microscopio. Quindi, calcolare il numero di cellule per microlitro.
2. Circa 5 milioni di aliquota delle cellule restanti parenchimale in un unico pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
3. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min.
4. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 90 µ l di PBS con 2% FBS.
5. Aggiungere anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) e PDPN (1: 200) diluito in 10 µ l di 10 x 2.4G2 o anti-CD16/32 (1: 200).
   Nota: Nessun blocco Fc (2.4G2) è stato utilizzato quando è stato utilizzato l'anticorpo anti-CD16/32-labeled.
6. Per determinare dove devono essere impostati cancelli positivi e negativi, includere una fluorescenza meno una macchia (FMO) per ogni colore e un controllo di isotipo dell'anticorpo.
7. Per determinare diretta contro le cellule morte, macchia con un indicatore di redditività (ad es., fantasma rosso 780). Incubare le cellule a 4 ° C per 30 min.
8. Lavare le cellule con 100 µ l di PBS con 2% FBS.
9. Utilizzare una piccola aliquota di cellule per regolare le impostazioni di compensazione e laser il citometro a flusso. Macchia le celle con un anticorpo per ogni fluoroforo individuo e uno senza alcun anticorpo.
   Nota: A seconda il citometro a flusso utilizzato, si dovrebbe istituire una matrice di incremento retributivo per rimuovere la sovrapposizione spettrale.
10. Posizionare la provetta con il campione sulla sonda citometro e raccogliere e registrare tutti gli eventi.

4. analisi dei dati

1. Guardando a dispersione laterale zona vs forward-scatter area, cancello sulle cellule "dal vivo" basato su dimensioni e granularità e attuabilità colorante indicatore.
2. Successivamente, utilizzando CD45 brillante viola 510 e CD31 PerCp CY 5.5, cancello sulle cellule CD45 - CD31 + utilizzo dei controlli di isotipo e FMO per determinare popolazioni positivi e negativi.
3. Infine, utilizzando CD146 v450 o CD16/32 FITC e PDPN APC, prendere il CD146 - PDPN + o CD16/32-PDPN + celle, nuovamente utilizzando controlli di isotipo e FMO, per determinare le popolazioni positivi e negativi. Queste cellule sono il LECs.

Risultati

Studi analisi dei vasi linfatici del fegato hanno utilizzato principalmente immunohistochemistry per quantificare la frequenza e il diametro dei vasi linfatici nel fegato. Tuttavia, questo metodo non consente per la valutazione di LECs su una base di cella o per l'espressione di più marcatori, citochine, chemochine o fattori di trascrizione. Pertanto, abbiamo chiesto se fegato LECs potrebbero essere isolate dal fegato e valutato mediante citometria a flusso. Lavoro precedente isolando LE...

Discussione

L'importanza complessiva di LECs in omeostasi immunitaria e regolamento è venuta recentemente alla luce²⁵. Gran parte della letteratura pubblicata linfatica si concentra sulla pelle e nei linfonodi; Tuttavia, vasi linfatici si trovano in tutto il corpo²⁶ e, così, è necessaria la nostra comprensione della loro importanza in diversi organi. Qui vi mostriamo un metodo in cui LECs nel fegato può essere studiata su una base di cella per capire meglio la loro espressione simu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clicks/EHAA media	Irvine Scientific	9195
Collagenase IV	Worthington Biochemical corporation	LS004188
DNase I	Worthington Biochemical corporation	LS002145	Deoxyribonuclease 1
OptiPrep	Sigma Aldrich	D1556	Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)	BD biosciences	562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)	Biolegend	134706	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102420	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)	Biolegend	127410	Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)	Biolegend	101306	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)	Biolegend	101324	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye	TONBO biosceinces	3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)	Biolegened	402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)	Biolegend	400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)	ebioscience	1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)	R&D systems	FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)	abcam	ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)	Bio-rad	MCA497
BSA (fraction V)	Fischer	BP1600-100	Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Donkey Serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EDTA	VWR	E177	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride	Fischer	A687-500	for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate	Fischer	P184-500	for RBC Lysis buffer
Scalpel	Feather	2975#21
100 μm cell strainer	Fischer	22363549
2.4G2	in house/ATCC	ATCC HB-197	FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta biologicals	S11550
96 well plate	Corning	3788
6 well plate	Corning	3506
50 mL conical	Truline	TR2004
15 mL conical	Falcon	352196
1 mL Pipete tip	USA scientific	1111-2721
200 µL pipete tip	USA scientific	1110-1700
10 µL pipete tip	USA scientific	1111-3700
seriological 10 mL pipete	greiner bio-one	607107
seriological 5 mL pipete	greiner bio-one	606107
Cell incubator	Fischer		Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer	BD biosciences
Clinical Centrifuge	Beckman coulter		model X-14R