Raccolta rapida di volatili di fragranze floreali utilizzando una tecnica di raccolta volatile Headspace per il campionamento della postura termica GC-MS

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per raccogliere la fragranza floreale volatile dai fiori in fiore, utilizzando una procedura di campionamento non distruttivo.

Abstract

Sono state campionate le fragranze di molte famiglie di fiori e sono stati analizzati i volatili. Conoscere i composti che compongono le fragranze può essere un passo importante per la conservazione dei fiori che sono minacciati o in via di estinzione. Poiché la fragranza floreale è fondamentale per attirare gli impollinatori, questo metodo potrebbe essere utilizzato per comprendere meglio o addirittura migliorare l'impollinazione. Vi presentiamo un protocollo utilizzando un filtro ad aria a carbone portatile e un vuoto per raccogliere le sostanze volatili delle fragranze floreali, che vengono poi analizzate da un GC-MS. Utilizzando questo metodo, i volatili delle fragranze possono essere campionati utilizzando un metodo non distruttivo con una macchina che viene facilmente trasportata. Questa metodologia utilizza una procedura di campionamento rapido, riducendo il tempo di campionamento da 2-3 ore a circa 10 minuti. Utilizzando GC-MS, i composti della fragranza possono essere identificati singolarmente, sulla base di standard autentici. Vengono presentati i passaggi utilizzati per la raccolta dei dati relativi alle fragranze e al controllo, dall'impostazione del materiale alla raccolta dell'output dei dati.

Introduzione

I fiori producono tipicamente una fragranza utilizzata per attirare gli impollinatori. Queste fragranze sono costituite da molti composti chimici che agiscono tutti insieme come una miscela floreale^1,2,3. Senza queste fragranze, i fiori sarebbero meno propensi a trasmettere le loro informazioni genetiche utilizzando impollinatori. La fragranza floreale è stata documentata in molte famiglie di piante da fiore, con Orchidaceae che è una delle famiglie più comuni studiate⁴. Per comprendere il ruolo della fragranza floreale nell'impollinazione, è importante raccogliere e analizzare in modo non distruttivo i composti chimici emessi dai fiori in diversi momenti della giornata e durante i diversi giorni o settimane le fioriture dei fiori sono aperte, in quanto la fragranza può variare nel tempo^{5 .}

Un protocollo precoce per questo tipo di campionamento è stato sviluppato da Heath e Manukian⁶. L'obiettivo dei loro metodi di campionamento era quello di ridurre lo stress sul campione (ad esempio, piante, insetti) studiato. I documenti precedenti documentavano che erano necessarie procedure distruttive per la pianta, come la rimozione dei fiori in fiore al fine di raccogliere la fragranza. Più recenti pubblicazioni di fragranze floreali di Cancino e Damon^7,8 utilizzato metodi simili. Questo studio mise i fiori in camere di vetro e passò l'aria purificata su di loro; poi composti profumati dalla camera sono stati assorbiti su adsorbenti polimerici porose in pipette Pasteur chiare. Le fragranze sono state raccolte per almeno due ore durante questo studio. Sadler et al.⁹ ha effettuato studi sulle fragranze floreali su un'orchidea epifita nel sud della Florida, proprio come lo studio originale¹⁰. Anche in questo caso, questo studio ha richiesto che i fiori siano campionati per oltre due ore per raccogliere le sostanze volatili della fragranza, con profumo raccolto sull'adsorbente polimerico poroso. Il documento qui presenta un metodo non distruttivo che consente un campionamento molto più veloce, della durata di soli 10 minuti. Inoltre, invece di utilizzare una camera di vetro forno borse da forno, che consentono un movimento più flessibile della camera e ridurre le probabilità di danni ai fiori. Questi sacchetti sono disponibili in diverse dimensioni permettendo la possibilità di selezionare la dimensione del sacchetto che si adatta facilmente singoli campioni senza danneggiare il campione o il materiale circostante. L'adsorbente utilizzato in questo studio è stato Tenax Porous Polymer Adsorbent. Questo è diverso da Porapak, perché il campione può essere riscaldato sulla colonna GC-MS per l'analisi, eliminando l'uso di un solvente chimico.

I metodi in questo studio forniscono un modo per campionare rapidamente le sostanze volatili delle fragranze prodotte dai fiori e potrebbero essere utilizzati anche per campionare sostanze volatili da altri esemplari, come feromoni di insetti o volatili di funghi. Il tempo ridotto per il campionamento significa che c'è meno stress sul campione e la capacità di raccogliere molti campioni in un breve periodo di tempo. Ad esempio, in Sadler et al.⁹, il fiore era solo profumato di notte, quindi solo due o tre campioni potevano essere raccolti ogni notte. Con il metodo qui, i campioni potrebbero essere prelevati tutta la notte a intervalli di 15-20 minuti dallo stesso fiore. Inoltre, utilizzando sacchetti al posto delle camere di vetro, lo spazio della testa può essere sospeso più facilmente per il campionamento sul campo per la raccolta in situ su specie vegetali in via di estinzione o minacciate. Utilizzando il metodo qui presentato, siamo stati in grado di assaggiare i fiori a 1,5 a 2 metri da terra. Questi metodi sono incredibilmente utili per la raccolta di fragranze in laboratorio e sul campo e forniscono ai ricercatori una tecnica di campionamento che è veloce e non distruttiva per il campione.

Protocollo

NOTA: I profumi o le lozioni profumate e i prodotti non devono essere indossati durante nessuna di queste procedure.

1. Selezione dei fiori

NOTA: I fiori utilizzati possono essere naturalmente in crescita nell'ambiente o tenuti in condizioni ambientali artificiali. Temperatura, umidità e livello di luce durante la raccolta possono variare in base alle specie di fiori specifici utilizzate e al tipo di dati raccolti. Ad esempio, i dati sono stati raccolti durante il giorno e di notte per lo stesso fiore per determinare se la fragranza varia nel tempo del giorno e raccolti sia da in situ che da fiori in serra.

1. Selezionare un fiore inizialmente non aperto, per standardizzare il tempo di raccolta dei campioni. Questo controlla per una fragranza che cambia fiori nel tempo.
2. A seconda della durata del tempo di fioritura, se possibile, attendere almeno 24 ore dopo la fioritura per raccogliere il campione, impostando un'ora standard per tutti i campioni.
3. Se ci sono più fiori in fiore su una pianta, segnare quello che verrà utilizzato con nastro di segnalazione o qualcosa di simile per garantire il campionamento ripetuto dello stesso fiore.

2. Preparazione del materiale

1. Utilizzare sacchetti da forno (circa 40,5 cm e 44,5 cm) e tubi PTFE ondulati.
2. Inizialmente, far bollire i sacchetti del forno in acqua per 30 min per rimuovere i composti di plastica residui. Per asciugare, cuocere in forno a 175 gradi centigradi.
3. Una volta asciugati i sacchetti, aggiungere un'unione di paratie in polipropilene ad ogni angolo dell'estremità chiusa dei sacchetti del forno. Questi accessori consentono il collegamento dei tubi per spingere l'aria filtrata a carbone e tirare la fragranza fuori dallo spazio della testa.
4. Sciacquare tutte le borse e i tubi con il 75% di etanolo. Lasciare asciugare entrambe le ore dopo il risciacquo.
5. Dopo che i sacchetti del forno si sono asciugati, cuocere sacchetti e tubi in forno a fuoco basso, circa 74-85 gradi centigradi per 30 minuti.

3. Raccolta volatile

NOTA: durante questo processo devono essere indossati guanti sterili in neoprene, poiché il contatto con il sacchetto o le cartucce filtranti può contaminare i campioni.

1. Coprire il fiore selezionato con un sacchetto per forno al forno al forno. Stringi il sacchetto saldamente con una cravatta a cerniera di plastica sotto il fiore per evitare il flusso d'aria indesiderato nel sacchetto.
2. Attaccare un tubo dalla presa d'aria dell'attrezzatura di raccolta e collegarlo a una delle unioni di paratia sulla borsa del forno.
3. Nell'altra unione delle paratie, attaccare una cartuccia di filtro di vetro contenente adsorbenti polimerici potri.
4. Attaccare un secondo tubo all'apparecchiatura di raccolta sull'ingresso a vuoto. Collegare l'estremità del secondo tubo sulla cartuccia del filtro di raccolta volatile in vetro.
5. Accendere sia la pompa dell'aria che il vuoto allo stesso tempo fissati a 0,05 l/min. Lo spazio sulla testa intorno al fiore si riempirà di aria, ma non diventerà eccessivamente gonfiato. Il sistema estrarrà l'aria dalla borsa attraverso il filtro, intrappolando i volatili floreali.
6. Lasciare la macchina a funzionare per 10 min e quindi spegnere sia la pompa dell'aria che il vuoto.
   NOTA: Potrebbe essere necessario campionare le specie floreali che producono/emettono una quantità minore di profumo per un periodo di tempo più lungo.
7. Smontare i tubi e la cartuccia del filtro di vetro. Mettere il filtro in una fiala di vetro con un tappo a vite. Una volta acceso il tappo, sigillare la fiala con il nastro adesivo del tubo PTFE.
8. Conservare i campioni in un congelatore fino a quando non vengono analizzati utilizzando GC-MS.
9. Ripetere questo processo con un sacchetto da forno pulito e un filtro di vetro, questa volta con un sacchetto vuoto, per raccogliere un campione di aria bianca come controllo. In questo modo è possibile identificare eventuali volatili in background raccolti.
   NOTA: La raccolta di campioni ripetuti deve essere eseguita approssimativamente alla stessa ora ogni giorno, poiché alcuni fiori producono diversi livelli di fragranza nel corso di una giornata.

4. GC-MS

1. Rimuovere la cartuccia del filtro di vetro dal congelatore e metterla in un GC-MS nella porta dell'iniettore.
2. Rilascio delle sostanze volatili dello spazio di testa raccolti su polimeri porosi adsorbente dall'adsorbente riscaldando nella trappola di raccolta termica (TCT) a 220 s per 8 min all'interno di un flusso di gas elio (tasso: 1,2 mL/min).
3. Raccogliere i composti desorbed nell'unità trappola a freddo TCT a -130 gradi centigradi. La temperatura della trappola a freddo è regolata dal programma GC-MS.
4. Flash riscalda l'unità trappola fredda TCT per iniettare i composti nella colonna capillare del cromatografo a gas a cui era collegata l'unità trappola a freddo TCT. Il metodo per il TCT inizia a -20 gradi centigradi e termina a 150 gradi centigradi.
5. Programmare il GC-MS per salire da 40 a 280 gradi centigradi a 15 gradi centigradi, con una tenuta di 5 min a 40 gradi centigradi.

5. Analisi dei dati

1. Per l'identificazione, confrontare gli spettri di massa del campione con quelli delle librerie di spettri di massa (NIST e Department of Chemical Ecology, Università di Goteborg, Svezia¹¹), così come i tempi di ritenzione delle sostanze volatili ai tempi di autentici standard composti¹².
2. Confrontare i cromatogrammi delle sostanze volatili raccolte per identificare picchi ricorrenti comuni.
3. Dopo aver identificato i volatili di picco, utilizzare Pherobase (database online di semiochimici e feromoni) per determinare se sono stati precedentemente descritti in fragranze floreali¹⁰.

Risultati

I dati rappresentativi del GC-MS sono mostrati come un cromatogramma nella figura 1. Oltre al cromatogramma, viene fornito anche un file di dati dei risultati (Supplementary File 1). Questo file di dati fornisce il tempo di conservazione per ogni picco (RT) e un'identificazione di quale composto è tale picco (Libreria/ID). I picchi tra le 10:00 e le 15:00 minuti sono volatili floreali, a causa del peso molecolare dei composti¹⁰. I numeri al di sopra ...

Discussione

Anche se questa tecnica è incredibilmente preziosa per la sua velocità di campionamento e portabilità, una limitazione è usarla per le specie epifite, o per quelle che crescono sugli alberi e non da terra. Nello studio originale¹⁰, uno dei fiori campionati era epifita. Poiché la macchina è troppo pesante per essere appesa liberamente, per il campionamento deve essere fatta una base stabile ed elevata. Inoltre, la macchina può essere collegata a una presa elettrica o a una batteria alimentat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bulkhead Union	Cole-Palmer	UX-06390-10
FEP tubing	Cole-Palmer	UX-06407-60
Gas Chromatography	Hewlett Packard	6890
Glass Wool, Silanized	Sigma-Aldrich	20411
Inlet liner	Agilent	5062-3587
Mass Spectrometer	Hewlett Packard	5973
Reynolds oven bag	Reynolds Consumer Products	Turkey size
Tenax Porous Polymer Adsorbent	Sigma-Aldrich	11982