Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Riepilogo

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Abstract

La modifica post-traduzionale delle proteine da parte della piccola ubiquitina proteica è coinvolta in molti eventi cellulari. Dopo la digestione trittica delle proteine ubiquitinate, i peptidi con un residuo di diglycine coniugato al gruppo di amminomido epsilon della lisina ('K-z-diglycine' o semplicemente 'diGly') possono essere utilizzati per rintracciare il sito di modifica originale. L'immunopurificazione efficiente dei peptidi diGly combinata con il rilevamento sensibile mediante spettrometria di massa ha portato a un enorme aumento del numero di siti di ubiquitinazione identificati fino ad oggi. Abbiamo apportato diversi miglioramenti a questo flusso di lavoro, tra cui la frazione offline ad alta fase inversa di peptidi prima della procedura di arricchimento e l'inclusione di impostazioni di frammentazione peptide più avanzate nel multipolo di routing io. Inoltre, la pulizia più efficiente del campione utilizzando un tappo basato su filtro al fine di mantenere le perline anticorpali si traduce in una maggiore specificità per i peptidi diGly. Questi miglioramenti si traducono nella rilevazione di routine di più di 23.000 peptidi diGly da cellule tumorali cervicali umane (HeLa) lismi cellulari su inibizione proteasoso nella cellula. Mostriamo l'efficacia di questa strategia per un'analisi approfondita dei profili ubiquitinomi di diversi tipi di cellule e di campioni in vivo, come il tessuto cerebrale. Questo studio presenta un'originale aggiunta alla cassetta degli attrezzi per l'analisi dell'ubiquitinazione delle proteine per scoprire l'ubiquitimo cellulare profondo.

Introduzione

La coniugazione dell'ubiquitina alle proteine le segna per la degradazione da parte del proteasome ed è un processo cruciale nella proteostasi. Il gruppo carboxyl c-terminale di ubiquitina forma un legame isopeptide con la lisina-aminogruppo della proteina bersaglio^1,2. Inoltre, l'ubiquitina può essere collegata ad altri moduli di ubiquitina, con conseguente formazione di strutture omogenee (cioè, K48 o K11) o ramificate (cioè strutture di polianiquitina eterogenee o miste)^1,3. La funzione più nota dell'ubiquitina è il suo ruolo nella degradazione proteasomica, mediato dalla poliubiquitina legata al K48. Tuttavia, è diventato chiaro che sia la mono- che la poliubiquitinazione svolgono anche ruoli in molti processi che sono indipendenti dalla degradazione da parte del proteasome. Per esempio, le catene legate al K63 hanno ruoli non degradanti nel traffico intracellulare, nella degradazione lsosomica, nella segnalazione della chinasi e nella risposta al danno del DNA^4,5. Gli altri sei tipi di collegamento sono meno abbondanti e i loro ruoli sono ancora in gran parte enigmatici, anche se stanno emergendo le prime indicazioni sulle loro funzioni nella cellula, in gran parte a causa dello sviluppo di nuovi strumenti per consentire il rilevamento specifico del collegamento^6,7.

La spettrometria di massa è diventata uno strumento indispensabile per le analisi del proteoma e al giorno d'oggi migliaia di proteine diverse da praticamente qualsiasi fonte biologica possono essere identificate in un singolo esperimento. Un ulteriore strato di complessità è presentato da modifiche post-traduzionali (PTM) di proteine (ad esempio, fosforolalazione, metilazione, acetilazione e ubiquitinazione) che possono modulare l'attività delle proteine. L'identificazione su larga scala delle proteine che portano il PTM è stata resa possibile anche dagli sviluppi nel campo della spettrometria di massa. La stoichiometria relativamente bassa dei peptidi con PTM rispetto alle loro controparti non modificate presenta una sfida tecnica e le fasi di arricchimento biochimico sono generalmente necessarie prima dell'analisi della spettrometria di massa. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati diversi metodi di arricchimento specifici per l'analisi dei PTM.

A causa dei molteplici ruoli dell'ubiquitinazione proteica nella cellula, c'è una grande domanda per lo sviluppo di metodi analitici per il rilevamento di siti di ubiquitinazione sulle proteine⁸. L'applicazione di metodi spettrometrici di massa ha portato ad un'esplosione del numero di siti di ubiquitinazione identificati nelle proteine della mosca della frutta, del topo, dell'uomo e del lievito^{9,10,11,12,13,14}. Un passo importante è stato rappresentato dallo sviluppo di strategie di arricchimento basate sull'immunoprecipitazioni a livello di peptide utilizzando anticorpi diretti contro il motivo residuo di K-e-GG (chiamato anche 'diglycine' o 'diGly'). Questi peptidi diGly sono prodotti sulla digestione di proteine ubiquitinate utilizzando la trypsina come proteasi^15,16.

Qui, presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato per arricchire per peptidi diGly utilizzando l'immunopurificazione e la successiva rilevazione da parte della spettrometria di massa Orbitrap. Utilizzando una combinazione di diverse modifiche dei flussi di lavoro esistenti, specialmente nelle fasi di preparazione del campione e spettrometria di massa, ora possiamo identificare regolarmente più di 23.000 peptidi diGly da un singolo campione di cellule HeLa trattate con un proteasome inibitore e 10.000 dollari da cellule HeLa non trattate. Abbiamo applicato questo protocollo a lisati sia da etichettatura isotoma sia non etichettata che stabile con aminoacidi nella coltura cellulare (SILAC) etichettati cellule HeLa così come a campioni endogeni come il tessuto cerebrale.

Questo flusso di lavoro presenta una preziosa aggiunta al repertorio di strumenti per l'analisi dei siti di ubiquitinazione al fine di scoprire il profondo ubiquitinome. Il protocollo seguente descrive in dettaglio tutti i passaggi del flusso di lavoro.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) di Erasmus MC.

1. Preparazione del campione

1. Cellule coltivate
   1. Selezionare una linea di interesse cellulare (ad esempio, cellule HeLa o osteosarcoma [U2OS]) e far crescere le cellule nel Minimal Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e 100 unità/mL penicillina/streptomica.
   2. Per gli esperimenti di proteomica quantitativa, le cellule di coltura nel DMEM mancano di arginina e lisina. Il mezzo deve essere integrato con 10% siero bovino fetale dial (FBS), 100 unità/mL penicillina/streptomicina e alanina-glutamina. Fare due tipi di supporti aggiungendo lisina convenzionale e arginina ('Medio leggero' o lisina-8 (¹³C₆; ¹⁵N₂) e arginina-10 (¹³C₆; ¹⁵N₄) ('Pesante' Medio), rispettivamente.
   3. Gruppi di colture di cellule in Medium chiaro (cioè senza etichetta) e Medium pesante (cioè, etichettato, SILAC) per almeno sei raddoppi prima dell'espansione e del trattamento per assicurarsi che tutte le proteine nella coltura di Medium pesante siano etichettate con isotopo stabile pesante contenenti Aminoacidi.
   4. Trattare le cellule per 8 h con 10 m dell'inibitore proteasoso bortezomib o un volume equivalente di DMSO come trattamento fittizio. Lavare le cellule con PBS, dissociarle utilizzando l'1% di trypsin/EDTA e pellet le cellule.
   5. Lyse il pellet cellulare da una piastra di coltura 150 cm² per condizione testata in 2 mL di ghiaccio-freddo 50 mM Tris-HCl (pH - 8,2) con 0.5% deoxycholate di sodio (DOC). Far bollire il lisato a 95 gradi centigradi per 5 min e sonicare per 10 min (impostando "H" per il sonicatore elencato nella Tabella dei Materiali) a 4 gradi centigradi. Non raccomandiamo l'uso di inibitori della deubiquitinasi come N-ethylmaleimide (NEM), perché questo può introdurre modifiche proteiche indesiderate che possono complicare l'identificazione dei peptidi.
2. Tessuto cerebrale del topo in vivo
   1. Quando si utilizza tessuto in vivo, lisciviare il tessuto in un tampone ghiacciato contenente 100 mM Tris-HCl (pH - 8,5), 12 mM di sodio DOC e 12 mM di sodio N-lauroylsarcosinate¹⁷. Sonicare il lisato per 10 min (impostando "H" per il sonicatore elencato nella tabella dei materiali) a 4 gradi centigradi e far bollire il lisato per 5 min a 95 gradi centigradi.
3. Quantifica la quantità totale di proteine utilizzando un kit di saggio proteico BCA a assorbimento colorimetrico. La quantità totale di proteine dovrebbe essere di almeno diversi milligrammi per un'immunoprecipitazioni peptide diGly di successo (IP). Per gli esperimenti SILAC si mescolano le proteine etichettate leggere e pesanti in un rapporto 1:1 in base alla quantità totale di proteine.
4. Ridurre tutte le proteine utilizzando 5 mM 1,4-dithiothreitol per 30 min a 50 gradi centigradi e successivamente alchilarle con 10 mM di iodoacetamide per 15 min al buio. Eseguire la digestione proteica con Illys-C (rapporto 1:200 enzima-substrato) per 4 h seguita da digestione notturna con trypsina (1:50 rapporto enzima-substrato) a 30 gradi centigradi o a temperatura ambiente (RT).
5. Aggiungere l'acido trifluoroacetico (TFA) al campione digerito ad una concentrazione finale dello 0,5% e centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 min al fine di precipitare e rimuovere tutto il detersivo. Raccogliere il supernatante contenente i peptidi per la frazione successiva.

2. Frazione di peptidi offline

1. Utilizzare la cromatografia C18 del pH (Rp) alta con materiale polimerico di fase stazionaria (300 , 50 m; vedi Tabella dei materiali) caricato in una cartuccia a colonna vuota per frazionare i peptidi tryptici. La dimensione del letto della fase stazionaria deve essere regolata in base alla quantità di proteina digerire da frazionare. Preparare una cartuccia vuota a colonna da 6 mL (vedi Tabella dei materiali)riempita con 0,5 g di materiale di fase stazionario per 10 mg di digestione proteica. Il rapporto tra proteina e ditore di fase stazionaria dovrebbe essere di circa 1:50 (w/w).
2. Caricare i peptidi sulla colonna preparata e lavare la colonna con circa 10 volumi di colonna dello 0,1% TFA, seguiti da circa 10 volumi di colonna di H₂O.
3. Elutare i peptidi in tre frazioni con 10 volumi di colonna di 10 mM di soluzione di formato di ammonio (pH - 10) con 7%, 13.5% e 50% acetonitrile (AcN), rispettivamente. Lyophilize tutte le frazioni alla completezza.
4. Usa gli anticorpi del motivo residuo dell'ubiquitina (K-z-GG) coniugati alle proteine A agarose per l'immunoarricchimento dei peptidi diGly. Poiché l'esatta quantità di anticorpo per lotto di perline è informazioni proprietarie e non divulgate dal produttore, si consiglia di utilizzare la stessa definizione per un lotto di perline come il produttore fa al fine di evitare confusione. Lavare un lotto di queste perline 2x con PBS e dividere il liquame di perline in sei frazioni uguali. Vedere Figura 1 per un sistema sperimentale dettagliato.
5. Sciogliere le tre frazioni di peptide raccolte nel passaggio 2,3 in 1,4 mL di un buffer composto da 50 MM MOPS, 10 mM di fosdio di sodio e 50 mM NaCl (pH 7,2), e far girare verso il basso i detriti.
6. Aggiungere i supernatanti delle frazioni alle perle anticorpali diGly e incubare per 2 h a 4 gradi centigradi su un'unità rotatore. Girare verso il basso le perline e trasferire il supernatante in un nuovo lotto di perline anticorpali e incubare di nuovo per 2 h a 4 gradi centigradi.
7. Memorizzare i supernatanti per la successiva analisi del proteoma globale (GP).
8. Trasferire le perline da ogni frazione in una punta di pipetta da 200 luna dotata di una spina di filtro GF/F per conservare le perline. Mettere la punta della pipetta con le perline in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml dotato di adattatore per la centralità. Lavare le perline 3x con 200 l di tampone IAP ghiacciato e successivamente 3x con 200 l di milliQ H₂O. Ruotare la colonna a 200 x g per 2 min prima di ogni fase di lavaggio, ma fare attenzione a non far asciugare la colonna. Elute i peptidi usando 2 cicli di 50 -L di 0,15% TFA.
9. Disalare i peptidi utilizzando una punta dello stadio C18 (essenzialmente una punta di pipetta da 200 lun con due dischi C18) e asciugarli fino alla completezza utilizzando la centrifugazione sottovuoto.

3. Nanoflow LC-MS/MS

1. Eseguire esperimenti LC-MS/MS su uno spettrometro di massa sensibile accoppiato a un sistema LC a nanoflusso.
2. Utilizzate una colonna in-casa di 50 cm in fase invertita di 50 cm con un diametro interno di 75 m imballato con resina CSH130 (3,5 m, 130) ed eluse i tidi con un gradiente del 2-28% (AcN, 0,1% FA) su 120 min a 300 nL/min. In alternativa, utilizzare colonne LC disponibili in commercio con proprietà simili. Mantenere la colonna a 50 gradi centigradi utilizzando un forno a colonna, ad esempio (vedere Tabella dei materiali).
3. Eseguire l'analisi della spettrometria di massa.
   1. Lo spettrometro di massa deve essere azionato in modalità Diacquisizione dipendente dai dati (DDA). Gli spettri di massa MS1 devono essere raccolti ad alta risoluzione (ad esempio, 120.000), con un'impostazione di destinazione automatica del controllo del guadagno (AGC) di 4E5 e un tempo massimo di iniezione di 50 ms in caso di spettrometro di massa Orbitrap.
   2. Eseguire prima l'analisi della spettrometria di massa in modalità "Intensità massima prima". In questo modo, lo ione più intenso viene selezionato prima per la frammentazione, poi il secondo più alto, e così via, utilizzando il metodo della velocità massima con un tempo di ciclo totale di 3 s. Successivamente, eseguire un secondo round di analisi DDA MS in modalità "Intensità più bassa prima", in modo che lo ione meno intenso viene selezionato prima, poi il secondo più basso, e così via. Questa strategia garantisce un rilevamento ottimale di peptidi di adessidia molto bassa.
   3. Filtrare gli ioni precursori in base agli stati di carica (2-7 cariche) e l'assegnazione di picco monoisotopico. Escludere i precursori precedentemente interrogati in modo dinamico per 60 s. Isolare i precursori di peptidi con un filtro di massa quadrupolo impostato su una larghezza di 1,6 Th.
   4. Raccogliere gli spettri MS2 nella trappola iotaria a un AGC di 7E3 con un tempo massimo di iniezione di 50 ms e un'energia di collisione HCD del 30%.

4. Analisi dei dati

1. Analizzare i file raw spettrometria di massa utilizzando un motore di ricerca appropriato come la suite software MaxQuant liberamente disponibile basata sul motore di ricerca Andromeda^18,19. In MaxQuant, selezionare le impostazioni predefinite con alcune adattamenti indicate di seguito. Impostare la specificità dell'enzima su trypsin, con il numero massimo di scissioni mancati elevato a tre. Impostare l'acesiglia con un residuo diGly (114.04 Da), ossidazione della methionina e n-terminal e impostare la carbamidomethylation di cisteina come una modifica fissa.
2. Eseguire ricerche nel database su un file FASTA contenente sequenze proteiche scaricate, ad esempio, dal repository Uniprot (https://www.uniprot.org/downloads) combinato con un'esca e un database contaminanti comune standard fornito automaticamente da MaxQuant. Impostare il tasso di individuazione falsa (FDR) su 1% e impostare il punteggio minimo per i peptidi modificati (diGly) su 40 (valore predefinito). Escludere i peptidi identificati con un residuo di lisina modificato con diG del terminale C da ulteriori analisi.
3. Per l'analisi quantitativa dei file dell'esperimento SILAC, impostare la molteplicità su "2" e ripetere il passaggio 4.2.
4. Eseguire tutte le analisi a valle (ad esempio, statistiche, analisi geniali) con il modulo Perseus²⁰ della suite software MaxQuant.

Risultati

Le proteine ubiquitinate lasciano un residuo di diglicina 114.04 Da sul residuo lisina bersaglio quando le proteine vengono digerite con la trypsina. La differenza di massa causata da questo motivo è stata usata per riconoscere inmodo inequivocabile il sito di ubiquitinazione in un esperimento di spettrometria di massa. La strategia che qui descriviamo è un metodo all'avanguardia per l'arricchimento e la successiva identificazione dei peptidi diGly da parte del nanoflusso LC-MS/MS (

Discussione

Il protocollo qui descritto è stato applicato a campioni provenienti da varie fonti biologiche, come cellule coltivate e tessuto in vivo. In tutti i casi abbiamo identificato migliaia di peptidi diGly, a condizione che la quantità totale di ingresso proteica fosse di almeno 1 mg. L'arricchimento con anticorpi specifici è altamente efficiente, dato che solo al massimo 100-150 peptidi diGly molto bassi sono stati identificati da lismi a tutta cellula se non sono state applicate procedure di arricchimento per proteine ub...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F filter plug	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
Lysine, Arginine	Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC oven	MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge	Waters	WAT036790	Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK Treated	ThermoFisher	20233