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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo lavoro presenta un protocollo per stabilire una coltura di sospensione cellulare derivata dal tè ( Foglie diCamellia sinensis L.) che possono essere utilizzati per studiare il metabolismo di composti esterni che possono essere assorbiti da tutta la pianta, come gli insetticidi.

Abstract

È stata sviluppata una piattaforma per studiare il metabolismo degli insetticidi utilizzando tessuti in vitro della pianta del tè. Foglie da sterili piantagioni di tè sono stati indotti a formare callus sciolto su Murashige e Skoog (MS) mezzi basali con gli ormoni vegetali 2,4-dichlorophenoxyacetic acido (2,4-D, 1.0 mg L-1) e kinetina (KT, 0.1 mg L-1). Callus si formò dopo 3 o 4 giri di subcultura, ciascuno della durata di 28 giorni. Il callo sciolto (circa 3 g) è stato poi inoculato in supporti liquidi B5 contenenti gli stessi ormoni vegetali ed è stato coltivato in un'incubatrice agitazione (120 giri/) al buio a 25 gradi centigradi. Dopo 3/4 sottoculture, una sospensione cellulare derivata dalla foglia di tè è stata stabilita in un rapporto di sottocultura compreso tra 1:1 e 1:2 (liquido madre sospensione: mezzo fresco). Utilizzando questa piattaforma, sei insetticidi (5 g mL-1 ciascuno tiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate e omethoate) sono stati aggiunti nella coltura delle sospensioni cellulari derivata dalla foglia di tè. Il metabolismo degli insetticidi è stato tracciato utilizzando la cromatografia liquida e la cromatografia a gas. Per convalidare l'utilità della coltura delle sospensioni delle cellule del tè, i metaboliti del tiamethoxan e del dimethoate presenti nelle colture cellulari trattate e nelle piante intatte sono stati confrontati utilizzando la spettrometria di massa. Nelle colture trattate di cellule del tè, sono stati trovati sette metaboliti di tiamethoxan e due metaboliti di dimethoate, mentre nelle piante trattate intatte, sono stati trovati solo due metaboliti del tiamethoxam e uno di dimethoate. L'uso di una sospensione cellulare ha semplificato l'analisi metabolica rispetto all'uso di piante da tè intatte, soprattutto per una matrice difficile come il tè.

Introduzione

Il tè è una delle bevande analcoliche più consumate al mondo1,2. Il tè è prodotto dalle foglie e dalle gemme della perenne camellia sinensis L. Tea coltivate in vaste piantagioni e sono suscettibili a numerosi insetti parassiti3,4. Gli insetticidi organofosforici e neonicotinoidi sono spesso usati come insetticidi sistemici5 per proteggere le piante da tè da parassiti come mosche bianche, tramogge di foglie e alcune specie di lepidopteran6,7. Dopo l'applicazione, questi insetticidi vengono assorbiti o traslocati nella pianta. All'interno della pianta, questi insetticidi sistemici possono essere trasformati attraverso l'idrolisi, l'ossidazione o le reazioni di riduzione da parte degli enzimi vegetali. Questi prodotti di trasformazione possono essere più polari e meno tossici rispetto ai composti padre. Tuttavia, per alcuni organofosfati, le bioattività di alcuni prodotti sono più elevate. Ad esempio, l'accesata è metabolizzato nel methamidophos più tossico8,9e dimethoate in omethoate10,11. Gli studi metabolici delle piante sono quindi importanti per determinare il destino di un pesticida all'interno di una pianta12.

Le colture di tessuti vegetali si sono dimostrate una piattaforma utile per studiare il metabolismo dei pesticidi, con i metaboliti identificati simili a quelli trovati nelle piante intatte13,14,15. L'uso di colture tissutali, in particolare le colture di sospensioni cellulari, ha diversi vantaggi. In primo luogo, gli esperimenti possono essere effettuati senza microrganismi, evitando così l'interferenza della trasformazione o della degradazione dei pesticidi da parte dei microbi. In secondo luogo, la coltura dei tessuti fornisce materiali coerenti da utilizzare in qualsiasi momento. In terzo luogo, i metaboliti sono più facili da estrarre dalle colture di tessuti che dalle piante intatte, e le colture di tessuti hanno spesso meno composti interring e minore complessità dei composti. Infine, le colture tissutali possono essere utilizzate più facilmente per confrontare una serie di metabolismo dei pesticidi in un singolo esperimento16.

In questo studio, è stata stabilita con successo una sospensione cellulare derivata dalle foglie di piantagione di tè coltivata sterilmente. La coltura delle sospensioni delle celle di tè è stata poi utilizzata per confrontare i comportamenti di dissipazione di sei insetticidi sistemici.

Questo protocollo dettagliato ha lo scopo di fornire alcune indicazioni in modo che i ricercatori possano stabilire una piattaforma di coltura dei tessuti vegetali utile per studiare il destino metabolico degli xenobiotici nel tè.

Protocollo

1. Cultura del callo del tè

NOTA: Le foglie sterili sono state derivate da linee di plantlet coltivate in vitro sviluppate per la prima volta nel gruppo di ricerca17. Tutte le procedure fino alla sezione 5 sono state eseguite in una cappa sterile di flusso laminare, ad eccezione del tempo di coltura in un'incubatrice.

  1. Regolare il pH dei due supporti (Murashige e Skoog [MS] supporto basale e mezzo liquido B5 di Gamborg) a 5,8 prima dell'autoclaving (121 gradi centigradi, 20 min).
  2. Tagliare lungo la vena centrale di una foglia sterile con le forbici, quindi suddividere ogni metà in piccoli pezzi di circa 0,3 cm x 0,3 cm in una piastra di Petri.
  3. Collocare gli espianti sterili (i piccoli pezzi di foglie) su supporti basali MS contenenti gli ormoni vegetali 2,4-D (1,0 mg L-1) e KT (0,1 mg L-1). Sei espianti possono essere collocati in un flacone da 300 mL contenente 100 mL di supporti basali MS.
  4. Coltura le foglie di cui sopra esplode ad una temperatura costante di 25 gradi centigradi al buio. Dopo 28 giorni, selezionare la prima generazione di callo indotto e trasferirlo in una pallina fresca (una sottocultura). Acquisisci il callo sciolto e friabile dopo 3/4 sottoculture.

2. Coltura delle sospensioni a celle di tè

  1. Tagliare i calli vigorosi, friabili e sciolti dal mezzo solido in piccoli pezzi (gamma qui 0,5, 2 mm) utilizzando una lama chirurgica sterile in condizioni sterili.
  2. Pesare circa 3 g dei piccoli pezzi di callo. Posizionare il callus in un pallone da 150 mL contenente 20 mL di supporti liquidi B5 integrati con 2,4-D (1,0 mg L-1) e KT (0,1 mg L-1).
  3. Coltura la sospensione a celle liquide ad una temperatura costante (25 x 1 gradi centigradi) in un'incubatrice tremante a 120 giri al buio.
  4. Dopo 7-10 giorni di coltura, togliere i flaconi di coltura e lasciarli riposare per qualche minuto.
  5. Prendere tutti i sovrinamine come materiale di semi per la sottocoltura al mezzo fresco (rapporto di sottocultura tra liquido madre sospensione a medio fresco compreso tra 1:1 e 1:2). Rimuovere i calli precipitati e di grandi dimensioni.
  6. Ottieni l'ultima coltura di sospensioni cellulari ben coltivata dopo 3/4 cicli di sottocultura di 28 giorni ciascuno.

3. Triphenyl cloruro di clorzo

  1. Uccidi un campione di cellule viventi a 100 gradi centigradi per 10 min come cella di controllo prima di colorare la vitalità.
  2. Centrifugare tutta la coltura di sospensione cellulare per 8 min a 6000 x g. Rimuovere il supernatante prima di sospendere le cellule in 2,5 mL di buffer salina con buffer fosfati (PBS) (pH 7.3) e agitarlo a mano per 1 min.
  3. Aggiungere 2,5 mL della soluzione TTC (0,4% tripil tetrazolium) e agitare di nuovo a mano.
  4. Incubare il composto per 1 h in un'incubatrice in piedi (30 gradi centigradi).

4. Trattamento e campionamento delle colture di sospensioni per cellule del tè con insetticidi

  1. Aggiungere un'aliquota di 400 l di soluzione di stock sterilizzata a filtro (500 g mL-1) di quattro neonicotinoidi (thiamethoxam, acetamiprid, imidacloprid e imidaclothiz) o due organofosfati (dimethoate e omethoate) nelle colture di sospensione cellulare, rispettivamente.
    NOTA: Se l'obiettivo è confrontare i comportamenti xenobiotici, utilizzare lo stesso lotto madre di sospensioni cellulari per testare i diversi composti.
  2. Coltura i campioni di sospensioni cellulari con insetticidi a temperatura costante (25 x 1 gradi centigradi) e agitazione della velocità dell'incubatrice (120 giri/min). Prelevare i campioni (vedere il passaggio 4.3 o 4.4) su 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 e 75 giorni.
  3. Per testare un campione contenente un neonicotinoide, rimuovere un'aliquota di 1 mL della coltura cellulare omogenea, collocarlo in un tubo di centrifuga di plastica da 1,5 ml e centrifugare a 4000 x g per 2 min.
    1. Passare i superanatanti attraverso una membrana filtrante di dimensioni pori di 0,22 m prima dell'analisi mediante la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC-UV) e la cromatografia liquida ad alte prestazioni-quadrupolo di massa di volo (UPLC-QTOF) spettrometria (Tabella dei materiali).
  4. Per testare un campione contenente un organofosfato, rimuovere un 500 l'Ll della coltura cellulare e collocarlo in un tubo di centrifugadi o un tubo di centrifuga in plastica da 1,5 ml (preparare quest'ultimo campione come quello del neonicotinoide).
    1. Aggiungere 0,1 g di cloruro di sodio e 5 mL di acetato di acetone/etil (3:7, v/v) nel tubo centrifugato 35 mL dei 500 campioni.
    2. Vorticare le miscele per 1 min, e poi lasciarli riposare per 10 min.
    3. Prendere 2,5 mL del supernatante in un tubo di vetro da 10 mL ed evaporare a quasi essiccazione utilizzando un evaporatore di azoto a 40 gradi centigradi.
    4. Sciogliere il residuo con 1 mL di acetone, vortice per 1 min, passarlo attraverso una membrana filtrante 0,22-m prima dell'analisi da rilevatore fotometrico gas-demografia-fiamma (GC-FPD).

5. Esempio di preparazione di pianta di tè intatta con insetticidi

NOTA: Lo studio intatto della pianta del tè è stato condotto in un sistema idroponico utilizzando piantine di tè coltivate in 50mL di una soluzione nutritiva (30 NH4, 10 NO3-, 3,1 PO4-, 40 K , 20 Ca2 ,25 Mg2 ,0,35 Fe 2,0,1 B 3,1,0 Mn2, 0,1 , n2, 0,025 Cu2, 0,05 Mo e 10 Al3 ,in mg L-1)18. Una serra sperimentale era sotto un ciclo chiaro-scuro (12 h di luce e 12 h di oscurità) a 20 gradi centigradi presso l'Università Agricola Anhui.

  1. Mettere cinque piante in un vaso di plastica da 4 L per 15 giorni.
  2. Aggiungere 0 ppm (controllo) o 100 ppm di thiamethoxam o dimethoate rispettivamente in vasi di plastica.
  3. Preparare il campione vegetale intatto secondo il metodo precedente, ad eccezione di presoinconddiace19, quindi analizzare con spettrometria di massa per uno spettro di massa accurato.

6. Analisi strumentale

  1. Analisi HPLC del comportamento metabolico dei neonicotinoidi
    1. Utilizzare un HPLC-UV (Table of Materials) per rilevare il contenuto e i prodotti metabolici di tiamethoxam e acetamiprid ad una lunghezza d'onda di 254 nm, e di imidacloprid e imidaclothiz a 270 nm in campioni della sezione 4.3.
      NOTA: la condizione HPLC-UV era la stessa dello studio precedente19.
  2. Analisi GC del comportamento metabolico degli organofosfati
    1. Rilevare il contenuto di dimethoate e omethoate nei campioni della sezione 4.4 da un GC-FPD utilizzando una colonna chirale (Tabella dei materiali).
    2. Utilizzare l'azoto come gas portante e impostare la portata a 1,0 mL min-1.
    3. Impostare la temperatura iniziale a 120 gradi centigradi, e tenerla per 5 min. Aumentare la temperatura a 150 gradi centigradi a 30 gradi centigradi min-1 e tenere premuto per 3 min. Infine aumentare a 210 gradi centigradi a 30 gradi centigradi min-1 e poi tenere premuto per 5 min.
    4. Impostare la temperatura di iniezione a 200 gradi centigradi in modalità senza divisioni; Impostare la temperatura del rivelatore a 250 gradi centigradi.
    5. Impostare il volume di iniezione su 1 .
  3. Analisi UPLC-QTOF dei metaboliti degli insetticidi nella coltura cellulare
    1. Rilevare i metaboliti degli insetticidi nella coltura cellulare (campioni della sezione 4.3) utilizzando UPLC-QTOF con una colonna C18 (Tabella dei materiali).
    2. Impostare la portata su 0,2 mL min-1. Impostare il volume di iniezione su 10.
    3. Per i campioni trattati con neonicotinoidi, impostare la fase mobile iniziale su 85% A (5 mM di acqua formatta di ammonio) e 15% B (acetonitrile). Oltre 10 min, aumentare la fase mobile B al 38% e tornare al 15% oltre 1 min, tenere per 9 min.
    4. Per i campioni trattati con organofosfato, impostare la fase mobile iniziale al 55% A (0,1% di acqua acimica) e al 45% B (acetonitrile). Oltre 5 min, aumentare la fase mobile B al 70%, poi tornare al 45% di B sopra 0,5 min, tenere per 2,5 min.
    5. Impostare i parametri di funzionamento QTOF come segue: temperatura del gas, 325 gradi centigradi; essiccazione del gas (azoto), 10 L min-1; temperatura del gas di guaina, 350 gradi centigradi; flusso di gas di guaina, 11 L min-1; tensione capillare, 4000 V; tensione dell'ugello, 1000 V; tensione del frammentatore, 100 V per gli insetticidi neonicotinoidi o 110 V per insetticidi organofosforici; tensione skimmer, 65 V; in modalità ios positivo.
    6. Impostare lo strumento sullo spettro di scansione completo e sulla modalità MS/MS di destinazione.
    7. Elaborare i dati utilizzando strumenti di massa accurati; Dedurre i metaboliti senza prodotti standard dall'annotazione MS/MS così come la letteratura12,15,20,21,22.
  4. Analisi UPLC-Orbitrap dei metaboliti degli insetticidi in estratto vegetale intatto
    1. Rilevare i metaboliti degli insetticidi nell'estratto vegetale intatto utilizzando la spettrometria di massa UPLC-Orbitrap (Tabella dei materiali).
    2. Impostare i parametri operativi della spettrometria di massa (Tabella dei materiali) come segue: pressione del gas di guaina, 35 arb; temperatura del gas, temperatura del gas, 300 gradi centigradi; tensione dell'ugello, 3,5 KV; temperatura capillare, 350 gradi centigradi.
    3. Impostare i programmi di elusione come indicato di seguito (passaggi 6.3.3 e 6.3.4) per l'analisi UPLC-QTOF della coltura cellulare.

Risultati

L'induzione di callo dalle foglie raccolte da alberi da tè coltivati sul campo e da foglie eccitate da piantagioni di tè coltivate in vitro in un ambiente sterile è stata confrontata misurando contaminazione, doratura e induzione dopo 28 giorni di coltivazione su supporti MS ( figura 1A). La crescita del callo è stata registrata a 20, 37, 62 e 90 giorni di cultura (Figura 1B). Il callo derivato dalle foglie coltivate in vitro...

Discussione

Questo articolo presenta il processo dettagliato di definizione di un modello di metabolismo dei pesticidi nel tessuto vegetale del tè, compresa la selezione di espianti, la determinazione della vitalità cellulare e la creazione di una coltura di sospensione delle cellule del tè con alta attività. Qualsiasi parte di un tessuto vegetale potrebbe essere utilizzata per avviare callo in un ambiente sterilizzato25. Le foglie di tè sono state scelte per l'avvio del calloso in questo studio, non sol...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research & Development Program (2016YFD0200900) della Cina, dalla National Natural Scientific Foundation of China (n. 31772076 e n. 31270728), dalla China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) e dall'Open Fund di Laboratorio chiave dello Stato di biologia e utilizzo delle piante di tè (SKLTOF20180111).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetamiprid (99.8%)Dr. Ehrenstorfer46717CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%)TediaAS1122-801CAS No: 75-05-8
AgarSolarbio Science & TechnologyA8190CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%)Dr. Ehrenstorfer525CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%)Dr. Ehrenstorfer109217CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%)Dr. Ehrenstorfer91029CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%)Toronto Research ChemicalI275000CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%)Solarbio Science & TechnologyK8010CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%)Dr. Ehrenstorfer105491CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)Solarbio Science & TechnologyP8070CAS No: 25249-54-1
SucroseTocris Bioscience5511CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%)Dr. Ehrenstorfer20625CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%)Solarbio Science & TechnologyT8170CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%)Guangzhou Saiguo BiotechD8100CAS No: 94-75-7
chiral columnAgilent CYCLOSIL-B112-6632Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC)Shimadu2010-PlusPaired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC)Agilent1260Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 columnWaters186003539Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)Agilent1290-6545Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)Thermo ScientificUltimate 3000-Q Exactive FocusConnected to a Orbitrap mass spectrometer

Riferimenti

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