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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Gli effetti trans e multigenerazionali delle sostanze chimiche persistenti sono essenziali per giudicare le loro conseguenze a lungo termine nell'ambiente e sulla salute umana. Forniamo nuovi metodi dettagliati per studiare gli effetti trans e multigenerazionali utilizzando il nematode free-living Caenorhabditis elegans.

Abstract

Le informazioni sulle tossicità delle sostanze chimiche sono essenziali nella loro applicazione e nella gestione dei rifiuti. Per le sostanze chimiche a basse concentrazioni, gli effetti a lungo termine sono molto importanti nel giudicarne le conseguenze nell'ambiente e sulla salute umana. Nel dimostrare influenze a lungo termine, gli effetti delle sostanze chimiche nel corso delle generazioni negli studi recenti forniscono nuove informazioni. Qui, descriviamo protocolli per studiare gli effetti delle sostanze chimiche su più generazioni utilizzando nematode Caenorhabditis elegansfree-living . Sono presentati due aspetti: (1) studi di effetti transgenerazionali (TG) e (2) di effetti multigenerazionali, quest'ultimo dei quali è separato da studi di esposizione multigenerazionale (MGE) e residuio multigenerazionale (MGR). Lo studio sugli effetti TG è robusto con un semplice scopo per determinare se l'esposizione chimica ai genitori può provocare conseguenze residue sulla prole. Dopo che gli effetti sono misurati sui genitori, le soluzioni di ipoclorito di sodio vengono utilizzate per uccidere i genitori e mantenere la prole in modo da facilitare la misurazione degli effetti sulla prole. Lo studio sugli effetti TG viene utilizzato per determinare se la prole è interessata quando il genitore è esposto agli inquinanti. Lo studio degli effetti MGE e MGR viene utilizzato sistematicamente per determinare se l'esposizione generazionale continua può provocare risposte adattative nella prole nel corso delle generazioni. Un attento pick-up e trasferimento sono utilizzati per distinguere le generazioni per facilitare la misurazione degli effetti su ogni generazione. Abbiamo anche combinato protocolli per misurare il comportamento di locomozione, la riproduzione, la durata della vita, i cambiamenti biochimici e dell'espressione genica. Alcuni esperimenti di esempio sono presentati anche per illustrare gli studi sugli effetti trans e multigenerazionali.

Introduzione

L'applicazione e la gestione dei rifiuti di sostanze chimiche dipende fortemente dalle informazioni dei loro effetti a determinate concentrazioni. In particolare, il tempo è un altro elemento essenziale tra effetti e concentrazioni. Vale a dire, le sostanze chimiche, soprattutto quelle a basse concentrazioni negli ambienti reali, hanno bisogno di tempo per provocare effetti misurabili1. Pertanto, i ricercatori organizzano diverse lunghezze della durata dell'esposizione negli esperimenti sugli animali e coprono anche l'intero ciclo di vita. Ad esempio, i topi sono stati esposti alla nicotina per 30, 90 o 180 giorni per studiare i suoi effetti tossici 2. Tuttavia, tali durate di esposizione non sono ancora sufficienti a chiarire gli effetti a lungo termine degli inquinanti (ad esempio, inquinanti organici persistenti [POP]) che possono durare su generazioni di organismi nell'ambiente. Pertanto, gli studi sugli effetti nel corso delle generazioni stanno guadagnando sempre più attenzione.

Ci sono due aspetti principali negli studi di effetti generazionali. Il primo è lo studio dell'effetto transgenerazionale (TG) che può verificare in modo robusto se l'esposizione chimica ai genitori può comportare conseguenze sulla prole3. Il secondo è uno studio multigenerazionale degli effetti che è più sistematico con considerazioni sia in esposizione che in quelli residui. Da un lato, gli effetti dell'esposizione multigenerazionale (MGE) vengono utilizzati per illustrare le risposte adattive negli animali agli ambienti difficili a lungo termine. D'altra parte, gli effetti residui multigenerazionali (MGR) sono utilizzati per dimostrare le conseguenze residue a lungo termine dopo l'esposizione, poiché l'esposizione materna è accompagnata da esposizione embrionale alla prima prole e all'esposizione germinale alla seconda prole che rende la terza prole come la prima generazione completamente fuori esposizione4.

Anche se i mammiferi (ad es. topi) sono organismi modello negli studi di tossicità soprattutto in relazione agli esseri umani, la loro applicazione nello studio degli effetti generazionali è piuttosto dispendiosa in termini di tempo, costosa ed eticamente relativa 5 . Di conseguenza, gli organismi tra cui il crostaceo Daphnia magna6, gli insetti Drosophila melanogaster7 e il pesce zebra Danio rerio8, forniscono scelte alternative. Tuttavia, questi organismi o mancano di somiglianze con gli esseri umani, o richiedono attrezzature specifiche negli studi.

Caenorhabditis elegans è un piccolo nematode free-living (circa 1 mm di lunghezza) con un breve ciclo di vita (circa 84 h a 20 gradi centigradi)9. Questo nematode condivide molti percorsi biologici conservatori con gli esseri umani, e quindi è stato ampiamente impiegato per illustrare gli effetti di varie sollecitazioni o tossici10. In particolare, il 99,5% dei nematodi sono ermafroditi che rendono questi organismi estremamente adatti nello studio degli effetti generazionali, ad esempio gli effetti TG di metalli pesanti e solfati33,11, effetti MGE di nanoparticelle d'oro e pesanti metalli12 e temperatura13, effetti MGR della solfonamide14, e gli effetti MGE e MGR di irradiazione gamma15 e lindane4. Inoltre, sono stati riscontrati risultati comparabili tra gli effetti delle sostanze chimiche (ad esempio zearalenone) sullo sviluppo e la riproduzione di topi e C. elegans16,17, che fornirebbero un vantaggio per estrapolare effetti da questo piccolo animale agli esseri umani.

Entrambi gli studi sugli effetti TG e MG richiedono molto tempo e richiedono un'attenta progettazione e prestazioni. In particolare, esistevano differenze nelle scelte della fase di vita, nelle condizioni di esposizione e nei metodi di separazione della generazione negli studi summenzionati. Tali differenze hanno ostacolato il confronto diretto tra i risultati e ostacolato un'ulteriore interpretazione dei risultati. Pertanto, è imperativo stabilire protocolli uniformi per guidare gli studi sugli effetti TG e MG, e anche fornire un quadro più ampio per rivelare modelli simili di vari sostanze tossiche o inquinanti in conseguenze a lungo termine. L'obiettivo superiore dei protocolli attuali dimostrerà chiari processi operativi nello studio degli effetti trans e multigenerazionali con C. elegans. I protocolli andranno a beneficio dei ricercatori interessati a studiare gli effetti a lungo termine di sostanze tossiche o inquinanti.

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Protocollo

1. Cultura E. coli OP50

  1. Preparare la soluzione di idrossido di sodio da 1 M sciogliendo 4 g di idrossido di sodio in acqua di 100 mL.
  2. Preparare il brodo di lisogenità (LB) medio sciogliendo 10 g di tripone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio con 1 L di acqua ultrapura in una fiaschetta conica 1 L. Regolare il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio da 1 M.
  3. Aliquota del supporto liquido LB da passo 1.2 a 20 flaconi conici (volume massimo consentito: 100 mL) con 50 mL di mezzo in ciascuno. Coprire i flaconi conici con carta kraft.
  4. Sterilizzare il supporto liquido LB a 121 e 0,105 MPa per 20 m. Raffreddare il supporto LB fino a temperatura ambiente.
  5. Pipette 200 - L dalle sospensioni batteriche (vedi passo 1.8) o scegliere una piccola colonia da agars (nel passo 2.14) utilizzando un anello inoculante, posizionarlo in mezzo LB.
  6. Incubare il supporto LB con agitazione a 150 giri/min a 37 gradi centigradi per 24-48 h. Il mezzo LB cambierà da un liquido trasparente marrone a sospensione torbida color kaki.
  7. Utilizzare le sospensioni batteriche dell'80% dei flaconi totali per fornire E. coli OP50 come alimento per nematodi da utilizzare al punto 2.11.
  8. Conservare il resto dei flaconi contenenti le sospensioni batteriche in frigorifero a 4 gradi centigradi. Pipetta 200 - L delle sospensioni LB sul lato superiore del supporto LB fresco (passaggio 1.4) e ripetere il passo 1.6 per la successiva incubazione.

2. Cultura C. elegans

NOTA: Colture C. elegans secondo i passaggi da 2.1 a 2.11 in base ai metodi standard18.

  1. Sciogliere 22,8 g di K2HPO4x 3H2O in 100 mL di acqua distillata sterile.
  2. Sciogliere 6,8 g di KH2PO4 in 50 mL di acqua distillata sterile.
  3. Mescolare le soluzioni dai passaggi 2.1 e 2.2, per preparare 1 M K2HPO4-KH2PO4 buffer (pH 6.0, 150 mL in totale).
  4. Preparare 1,0 M MgSO4 sciogliendo 1,232 g di MgSO4,7H2O in 5 mL di acqua distillata sterile, e sterilizzarlo filtrando la soluzione attraverso un filtro di membrana monouso sterile da 0,22 m in un contenitore sterile.
  5. Preparare 1 M CaCl2 sciogliendo 0,554 g di CaCl2 in 5 mL di acqua distillata sterile e sterilizzarla filtrando le soluzioni attraverso un filtro di membrana monouso sterile da 0,22 m in un contenitore sterile.
  6. Preparare la soluzione di colesterolo da 1 M sciogliendo 0,025 g di colesterolo in 5 mL di etanolo assoluto e sterilizzarla filtrando la soluzione attraverso un filtro di membrana usa e getta sterile da 0,22 m in un contenitore sterile.
  7. Preparare il nematode medio (NGM) agar con l'aggiunta di 17 g di polvere di agar, 2,5 g di peptone e 3 g di cloruro di sodio a una fiaschetta conica da 1 L contenente 1 L di acqua ultrapura. Aggiungere 25 mL di K2HPO4-KH2PO4 soluzione dal passaggio 2.3.
  8. Sterilizzare l'agar NGM da passo 2.7 a 121 gradi centigradi con 0,105 MPa per 20 min.
  9. Raffreddare l'agar NGM a circa 50 gradi centigradi, aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4, 1 M CaCl2e 5 soluzione di colesterolo-etanolo mg/mL dai passi da 2,4 a 2,6 nel mezzo e mescolarli accuratamente.
  10. Versare 10 mL di agar medio per piatto in 100 piatti sterili Petri (6,0 cm di diametro). Raffreddare il mezzo nei piatti Petri a temperatura ambiente per formare agar solido.
  11. Pipetta 170 - L delle sospensioni batteriche dal punto 1.7 sul suddetto agar NGM utilizzando una punta sterile. Agitare leggermente l'agar NGM per distribuire uniformemente il supporto LB sulla superficie dell'agar NGM.
  12. Inoculare l'agar NGM con il lato superiore verso l'alto fino a 37 gradi centigradi per 8-12 h per formare un prato batterico.
  13. Utilizzare la maggior parte dell'agar con prati batterici dal passo 2.12 ai nematodi di coltura nel passo 2.15 o 2.19.
  14. Conservare 1 o 2 agar a testa in giù per evitare l'evaporazione dell'acqua e la contaminazione nei frigoriferi a 4 gradi centigradi in modo da sostenere i batteri in contaminazione.
  15. Quando ci sono meno di 2.000 nematodi sugli agarNGM di stoccaggio (da esperimenti precedenti o dotati di altri laboratori), tagliare un sesto dell'agar NGM che contiene C. elegans con una punta sterile e trasferirlo su agar NGM appena preparati con agar batterici prato (dal punto 2.13). Tenere gli agarNG agars a testa in giù in un incubatore di 22 gradi centigradi per la successiva coltura.
  16. Quando ci sono più di 2.000 nematodi sull'agar NGM, lavare i nematodi dell'agar NGM con 2 mL di acqua sterile nei tubi di centrifuga. L'ingresso di 2 mL di acqua si tradurrà in un'uscita di circa 1,5 mL.
  17. Lasciare che i nematodi si depositino nei tubi di centrifuga da 30 min. Scartare 1 mL dei supernatanti pipettando e aggiungere 1 mL di acqua sterile in ogni tubo per lavare i pellet (cioè i nematodi).
  18. Sistemare i nematodi nei tubi di centrifuga per 30 min. Scartare 1 mL dei supernatanti pipettando. Aggiungere 1 mL di acqua sterile in ogni tubo per risospendere i nematodi.
  19. Distribuire le sospensioni dei nematodi (circa 1,5 mL in totale) con il pipettaggio di 150 gradi l su ogni nuovo agar NGM con prato batterico (dal punto 2.13), realizzando 8-10 nuovi agar NGM in totale.
  20. Tenere gli agarNG da passo 2.19 up-side up in un incubatore 20 c durante la notte e poi a lato verso il basso per la successiva cultura.
  21. Ripetere il passaggio 2.15 o 2.16-2.20 ogni tre giorni.

3. Preparare uova sincronizzate e larve L3 di C. elegans

  1. Svuotare i nematodi gravidi e le uova appena prodotte dagli agarNGM in sterili tubi di centrifuga, con 2 mL di acqua sterile su ogni agar NGM che ha ottenuto circa 1,5 mL di uscita.
  2. Depositare i nematodi nei tubi di centrifuga per 30 min, quindi scartare l'85% dei supernatanti pipettando.
  3. Preparare soluzioni di ipoclorito di sodio sciogliendo 0,6 g di NaOH e 5 mL di NaOCl (4-6% gradienti attivi, vedere la Tabella dei Materiali per i dettagli) con 25 mL di acqua per portare il NaOH a 0,5 M e NaOCl all'1%.
  4. Mescolare i pellet dal punto 3.2(contrassegnare il volume come V 0) con 7 volte V0 di soluzioni di ipoclore di sodio da (passaggio 3.3, cioè, rapporto di volume di 1:7)19.
  5. Agitare i tubi di centrifuga ogni 2 min per 10-15 min per losianizzare le larve e nematodi adulti; il colore delle sospensioni nematode si trasformerà da torbido a chiaro.
  6. Centrifugare i tubi a 700 x g per 3 min a 20 gradi centigradi, quindi scartare i supernatanti pipettando.
  7. Risospendere i pellet in 5 volte V0 di acqua sterile per lavare le uova sincronizzate con l'età. Centrifuga a 700 x g per 3 min a 20 gradi centigradi, quindi scartare i supernatanti.
  8. Ripetere il passaggio 3.7 due volte.
  9. Aggiungere 1 v0 di acqua sterile nei tubi per risospendere le uova sincronizzate in base all'età.
  10. Distribuire le sospensioni delle uova con pipiglianti 50 gradi l su ogni nuovo agar NGM con prato batterico da passo 2.13. Tenere gli agarNG dall'alto in un'incubatrice di 20 gradi centigradi per 30 min, permettendo all'acqua di evaporare o di essere assorbita dal prato batterico. Quindi, fare il NGM agars a testa in giù per la cultura successiva. Contrassegnare il tempo comeil tempo dell'uovo (uovo T ).
  11. Preparare K-medio sciogliendo 3 g di NaCl e 2,36 g di KCl in 1 L di acqua. Sterilizzare il mezzo a 121 e 0,105 MPa per 20 min e raffreddarlo a temperatura ambiente.
  12. Quando il tempo raggiunge 36h dopo l'uovo T , i nematodi raggiungeranno lo stadio di larve L3 (L3 nematodes)20. Sciacquare i nematodi dagli agar NGM in tubi di centrifuga, con 2 mL di acqua sterile su ogni agar NGM che ha ottenuto circa 1,5 mL di uscita.
  13. Dopo un assestamento per 30 min, sostituire l'85% dei supernatanti (pipettando) con K-medium da 2 h per digerire il cibo nelle viscere3.
  14. Scartate i superalatari. Utilizzare K-medium (dal punto 3.11) per regolare le sospensioni dei nematodi a circa 200 nematodi per 100 l per gli esperimenti successivi.

4. Utilizzare C. elegans per lo studio degli effetti transgenerazionali

  1. Preparare soluzioni chimiche con 5 livelli di concentrazione e un solvente o controllo assoluto, vale a dire 6 gruppi in totale.
  2. Aggiungere 100 soluzioni di controllo o chimiche con 10 pozzi come repliche in ogni gruppo (cioè 60 pozzi in totale) nella zona centrale di una micropiastra sterile di 96 pozzetti per evitare effetti di bordo.
  3. Diluire le sospensioni nematode dal gradino 3.14 con K-medium dal passo 3.11 per 10 volte. Aggiungete 100 sospensioni per nematodi a ciascuno dei 60 pozze del punto 4.2. Contrassegnare l'ora come t0.
  4. Quando il tempo raggiunge 24 h dopo t0, contare i nematodi viventi e morti nei pozzi. Calcolare la concentrazione letale mediana (LC50).
  5. Preparare una serie di 5 concentrazioni al di sotto del 10% dei valori LC50.
  6. Aggiungere 100 soluzioni di controllo o chimiche (dal punto 4.5) con 10 pozze come repliche in ogni gruppo (vale a dire 60 pozzi in totale) nella zona centrale di una microplacca sterile da 96 pozzeper evitare effetti di bordo.
  7. Aggiungere 100 L di K-medium contenente circa 200 nematodi L3 (dal punto 3.14) a ciascuno dei 60 pozze dal punto 4.6. Contrassegnare l'ora come T0.
  8. Eseguire l'esposizione per 24 a 96 h da T0.
  9. Dopo l'esposizione, raccogliere i nematodi da cinque pozzi in ciascun gruppo in tubi centrifugati da 1,5 mL mediante pipettaggio (cioè 6 tubi in totale).
  10. Accomodate i nematodi per 30 min, scartate i supernatanti pipettando e revistano e lavate i nematodi sul fondo con 1 mL di acqua sterilizzata.
  11. Accomodare i nematodi per 30 min, scartare i supernatanti pipettando e utilizzare i nematodi nella parte inferiore per le misurazioni dell'indicatore (vedere la sezione 7) della generazione padre esposta contrassegnata come F0.
  12. Raccogliere, sistemare e lavare (rimettendo) i nematodi dai restanti cinque pozzi in ogni gruppo nel passaggio 4.9 secondo il passaggio 4.10.
  13. Accomodate i nematodi dal punto 4.12 per 30 min. Scartate i supernatanti pipettando e aggiungete 100 l di acqua sterile per risospendere i nematodi. Trasferire le sospensioni nematode in modo uniforme su tre agar NGM appena preparati con prato batterico dal passo 2.13.
  14. Incubare i nematodi per 36 h per diventare gravid ed eseguire la sincronizzazione dell'età secondo i passaggi 3.1-3.9. Incubare le uova sincronizzate sui rispettivi agar NGM con prato batterico dal passo 2.13 per 36 h.
  15. Sciacquare i nematodi sugli agar NGM dal gradino 4.14 in sei tubi di centrifuga.
  16. Sistemare i nematodi per 30 min e scartare i supernatanti pipettando. Risospendere e lavare i pellet con 1 mL di acqua sterilizzata.
  17. Sistemare i nematodi per 30 min e scartare i supernatanti pipettando. Utilizzare i nematodi in basso per le misurazioni dell'indicatore (vedere la sezione 7) della generazione della prole contrassegnata come T1.

5. Utilizzare C. elegans per lo studio dell'effetto di esposizione multigenerazionale (MGE)

  1. Mescolare 99,0 mL di agar NGM (dal punto 2.9) con 1 mL di soluzioni di controllo o chimiche (basse e alte concentrazioni nel presente protocollo come esempi, vale a dire tre gruppi in totale).
  2. Versare i circa 10 mL di NGM agar medium per piatto da passo 5.1 in 100 sterili piatti Petri (6,0 cm di diametro). Raffreddare il mezzo nei piatti Petri a temperatura ambiente per formare agar solido.
  3. Sospensioni batteriche pipette sull'agar come da passo 2.11.
  4. Mettere da parte i coperchi superiori dei piatti Petri ed esporre il prato battericoalla luce UV (145 gradi centigradi) nell'armadio di biosicurezza per 15 min.
  5. Scegli una piccola colonia usando un anello inoculante, posizionala in un supporto LB dagli agar nel passaggio 1.4. Incubare il mezzo LB con scosse ad una velocità di 150 giri/min a 37 gradi centigradi per 24 h per confermare la negligle bacterial growth, convalidando la fase di uccisione 5.4.
  6. Pipette le uova sincronizzate con età dal passo 3.9 sugli agar (dal punto 5.4). Contrassegnare l'inizio dell'esposizione alla generazione padre F0 e contrassegnare il giorno 0 (D0).
  7. Incubare gli agar per 3 d a 20 gradi centigradi. Quindi (cioè su D3), utilizzare i nematodi maturi per misurare gli effetti in F0 (vedi sezione 7).
  8. Sempre su D3, scegli I nematodi maturi F0 sui nuovi agar NGM (dal punto 5.4) utilizzando un'asta di vetro, la cui estremità è dotata di un filo di fibra artificiale piegato in un anello.
  9. Sulla D4, scegli e scarta i nematodi F0 maturi dagli agarNGM. Contrassegnare i nematodi appena nati all'interno di questi 24 h (da D3 a D4) come F1 per sperimentare l'esposizione di seconda generazione.
  10. Su D6, misurare gli indici (vedere la sezione 7) dei nematodi maturi F1 che hanno sperimentato l'esposizione per 3 giorni.
  11. In D9 ripetere i passaggi da 5,8 a 5,10, utilizzare i nematodi F1 per riprodurre i worm F2 e misurare gli effetti sui nematodi F2.
  12. Su D12, ripetere il passaggio 5.11, utilizzare i nematodi F2 per riprodurre i vermi F3 e misurare gli effetti sui nematodi F3. Allo stesso modo, riprodurre la prole e misurare gli effetti MGE sulla generazione di nprole (Fn).

6. Utilizzare C. elegans per lo studio degli effetti residui multigenerazionali (MGR)

  1. Ripetere i passaggi 5.1-5.7. Su D3, scegliere F0 nematodi maturi su nuovi agar NGM senza prodotti chimici aggiunti (dal passo 2.13).
  2. Sulla D4, scegli e scarta i nematodi F0 maturi. Mark i nematodi appena nati all'interno di questi 24 h come nematodi T1.
  3. Su D6, misurare gli indici (vedere la sezione 7) dei nematodi maturi T1 che sono cresciuti per 3 giorni.
  4. In D9 ripetere i passaggi da 6.2 a 6.3, utilizzare i nematodi T1 per riprodurre i nematodi T2 e misurare gli effetti nei nematodi T1.
  5. In D12 ripetere i passaggi 6.4, utilizzare i nematodi T2 per riprodurre i nematodi T3 e misurare gli effetti nei nematodi T2. Allo stesso modo, riprodurre la prole e misurare gli effetti MGR sulla generazione nth prole (Tn) nematodes di F0, o n prole (Tn') nematodi di Fn dal passo 5.12.

7. Indicatori di misura

  1. Misurare il comportamento della locomozione.
    1. Sciacquare i nematodi dagli agar NGM usando acqua sterile e raccoglierli in tubi di centrifuga. Accomodate i nematodi per 30 min, scartate i supernatanti e usate i nematodi nei pellet per la misurazione degli effetti.
    2. Risospendere i nematodi nei pellet con 1 mL di acqua sterile e pipettarli su agarNGM senza prato batterico dal punto 2.10.
    3. Utilizzare un microscopio dissettivo per segnare i nematodi per la frequenza di piegatura del corpo (BBF) che si riferisce ai tempi in cui la lampadina posteriore della facrela cambia direzione lungo la direzione verticale del percorso di viaggio entro un intervallo di 60 s.
    4. Utilizzare il microscopio sezionato per segnare il movimento di inversione (RM) che si riferisce ai tempi in cui la direzione di viaggio cambia oltre 90 s compresi giri all'indietro e Omega girare (OT) in un intervallo di 60 s. L'OT si riferisce al movimento quando la testa del nematodo tocca o quasi tocca la coda rendendo la forma nematode come la lettera greca Omega (z).
      NOTA: sono stati esaminati almeno 6 nematodi per ogni trattamento in ogni replica sperimentale.
Esempi di effetti MGE (da F0 a F3) sulla riproduzione e sulla durata della vita con 3 gruppi (un controllo e due trattamenti di esposizione).
giornoNumero di agar NGM per lo studio MGEspiegazione
Duratariproduzione
0 (in vie30 (esposizione F0)10 repliche per ogni gruppo, contrassegnate come F0-1-1-0 a F0-3-10-0, con l'ultima cifra per mostrare i giorni di sopravvivenza.
1 : il nome del30 (F0 sopravvive 1 d)Da F0-1-1-0 a F0-3-10-0 deve essere cambiato in F0-1-1-1 in F0-3-10-1.
2 Il nome del sistema30 (F0 sopravvive 2 d)Da F0-1-1-1 a F0-3-10-1 deve essere cambiato in F0-1-1-2 in F0-3-10-2.
Non c'è bisogno di trasferire F0 nematodi fino a 3 d.
3 (COM del nome30 (F0 sopravvive a 3 d, cancellato dopo il trasferimento e la raccolta dei nematodi)Dopo 3 d, I nematodi F0 sono maturi e 36 nuovi agar NGM (con 2 nematodi su ogni agar) vengono utilizzati per osservare la loro sopravvivenza e riproduzione.
36 (da F0-1-1-3 a F0-3-12-3)Dovrebbero essere effettuati esperimenti preliminari per organizzare il numero di nematodi F0, assicurando almeno 200 prole per il successo delle operazioni multigenerazionali.
In particolare, se si studiano gli effetti MGR, i nematodi F0 dovrebbero essere trasferiti su agarNG senza esposizione chimica, e dovrebbe essere notato come Inizio T1.
La maggior parte dei nematodi F0 sono raccolti per misurare gli indici chimici e genetici e i 30 agar in F0 vengono cancellati.
4 DEL psu'36 (da F0-1-1-4 a F0-3-12-4)36 (da F1-1-1-1 a F1-3-12-1)La misurazione sulla durata e la riproduzione richiede il trasferimento ogni giorno.
I nematodi dei genitori da F0-1-1-3 a F0-3-12-3 vengono raccolti sui nuovi agar NGM contrassegnati come F0-1-1-4 a F0-3-12-4.
I restanti nematodi della prole (cioè F1 in MGE o T1 in MGR) in F0-1-1-3 a F0-3-12-3 sono cresciuti per 1 d, e i marcatori vengono cambiati in F1-1-1-1 in F1-3-12-1. Questi agar sono utilizzati anche per monitorare la durata della F1 con trasferimento giornaliero.
5 Del numero 3(36 (da F0-1-1-5 a F0-3-12-5)36 (da F1-1-1-2 a F1-3-12-2)Nematodi su F1-1-1-1 a F1-3-12-1 agar sono cresciuti per 2 d e diventano facilmente osservabili e i nematodi vengono contati, e i marcatori vengono cambiati in F1-1-1-2 in F1-3-12-2.
36 (da F0-1-1-4 a F0-3-12-4)I nematodi della prole negli agar F0-1-1-4 a F0-3-12-4 sono cresciuti per 1 d.
6 È possibile:36 (da F0-1-1-6 a F0-3-12-6)36 (da F0-1-1-4 a F0-3-12-4, cancellato dopo il conteggio)Nematodi su F1-1-1-2 a F1-3-12-2 agar sono cresciuti per 3 d e i marcatori sono cambiati in F1-1-1-3 in F1-3-12-3. In particolare, i nematodi di F1 iniziano a riprodursi F2 in questo giorno, i nematodi di F1 dovrebbero essere trasferiti su nuovi agar NGM che producono F2-1-1-0 a F1-3-12-0. Per gli studi MGR, T2 inizia oggi.
36 (da F1-1-1-3 a F1-3-12-3)36 (da F0-1-1-5 a F0-3-12-5)Questo può essere ritardato dall'esposizione chimica, e quindi cambiamenti flessibili dovrebbero essere eseguiti in ogni esperimento per garantire abbastanza nematodi per le generazioni successive.
36 (da F2-1-1-0 a F1-3-12-0)I nematodi della prole sugli amatodi F0-1-1-4 a F0-3-12-4 sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
I nematodi della prole sugli amatodi F0-1-1-5 a F0-3-12-5 sono cresciuti per 1 d.
7 (in questo stato36 (da F0-1-1-7 a F0-3-12-7)36 (da F0-1-1-5 a F0-3-12-5, eliminato dopo il conteggio)I nematodi della prole sugli amatodi F0-1-1-5 a F0-3-12-5 sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-4 a F1-3-12-4)36 (da F0-1-1-6 a F0-3-12-6)Il numero complessivo di nematodi in F1-1-1-1 a F1-3-12-1, F0-1-1-4 a F0-3-12-4 agars e da F0-1-1-5 a F0-3-12-5 sono utilizzati per calcolare la riproduzione iniziale di F0.
36 (da F2-1-1-1 a F2-3-12-1)I nematodi della prole sugli amatodi F0-1-1-6 a F0-3-12-6 sono cresciuti per 1 d.
I nematodi F2 da F2-1-1-0 a F1-3-12-0 sono cresciuti per 1 d e i loro marcatori vengono trasformati in F2-1-1-1 in F2-3-12-1.
8 (IN vio36 (da F0-1-1-8 a F0-3-12-8)36 (da F0-1-1-6 a F0-3-12-6, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole sugli amatodi F0-1-1-6 a F0-3-12-6 sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-5 a F1-3-12-5)36 (da F0-1-1-7 a F0-3-12-7)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-7 a F0-3-12-7 agar s'aspettano per 1 d.
36 (da F2-1-1-2 a F2-3-12-2)36 (da F1-1-1-4 a F1-3-12-4)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-4 a F1-3-12-4 agar sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-1 a F2-3-12-1, cambiato in F2-1-1-2 in F2-3-12-2 dopo contato)I nematodi F2 da F2-1-1-1 a F2-3-12-1 sono cresciuti per 2 d, i nematodi sono contati e i loro marcatori vengono cambiati in F2-1-1-2 in F2-3-12-2.
9 (in vie36 (da F0-1-1-9 a F0-3-12-9)36 (da F0-1-1-7 a F0-3-12-7, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-7 a F0-3-12-7 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-6 a F1-3-12-6)36 (da F1-1-1-4 a F1-3-12-4, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-4 a F1-3-12-4 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-3 a F2-3-12-3)36 (da F0-1-1-8 a F0-3-12-8)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-8 a F0-3-12-8 agar sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-0 a F3-3-12-0)36 (da F1-1-1-5 a F1-3-12-5)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-5 a F1-3-12-5 agars sono cresciuti per 1 d.
I nematodi F2 da F2-1-1-2 a F2-3-12-2 sono cresciuti per 3 giorni e i loro marcatori vengono cambiati in F2-1-1-3 in F2-3-12-3. I nematodi F2 iniziano a riprodursi oggi e vengono trasferiti a 36 nuovi agar NGM sono necessari e contrassegnati come F3-1-1-0 a F3-3-12-0. Per gli studi MGR, T3 inizia oggi.
10 del sistema36 (da F0-1-1-10 a F0-3-12-10)36 (da F0-1-1-8 a F0-3-12-8, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F0 da F0-1-1-8 a F0-3-12-8 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-7 a F1-3-12-7)36 (da F1-1-1-5 a F1-3-12-5, eliminato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-5 a F1-3-12-5 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-4 a F2-3-12-4)36 (da F0-1-1-9 a F0-3-12-9)Il numero complessivo di nematodi da F2-1-1-1 a F2-3-12-1, F1-1-1-4 a F1-3-12-4 e da F1-1-1-5 a F1-3-12-5 per calcolare la riproduzione iniziale di F1.
36 (da F3-1-1-1 a F3-3-12-1)36 (da F1-1-1-6 a F1-3-12-6)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-9 a F0-3-12-9 agar sono cresciuti per 1 d.
I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-6 a F1-3-12-6 agar sono cresciuti per 1 d.
Il nematode della prole sugli agar F3-1-1-0 a F3-3-12-0 è cresciuto per 1 d e i marcatori vengono trasformati in F3-1-1-1 in F3-3-12-1.
In particolare, la riproduzione dei nematodi F0 diminuirà significativamente dopo i primi giorni. Pertanto, il trasferimento nematode non è strettamente richiesto di essere giornaliero dopo D10 e può essere eseguito ogni 2 giorni. Tuttavia, la sopravvivenza richiede ancora un'osservazione quotidiana.
La stessa regola si applica anche in F1 (T1, T1'), F2 (T2, T2') e F3 (T3, T3').
11 Del sistema di36 (da F0-1-1-11 a F0-3-12-11)36 (da F0-1-1-9 a F0-3-12-9, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F0 da F0-1-1-9 a F0-3-12-9 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-8 a F1-3-12-8)36 (da F1-1-1-6 a F1-3-12-6, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-6 a F1-3-12-6 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-5 a F2-3-12-5)36 (da F0-1-1-10 a F0-3-12-10)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-10 a F0-3-12-10 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-2 a F3-3-12-2)36 (da F1-1-1-7 a F1-3-12-7)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-7 a F1-3-12-7 agar sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-4 a F2-3-12-4)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-4 a F2-3-12-4 agar sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-1 a F3-3-12-1, cambiato in F3-1-1-2 in F3-3-12-2 dopo il conteggio)I nematodi sugli agar F3-1-1-1 a F3-3-12-1 sono cresciuti per 2 d, i nematodi vengono contati e i marcatori vengono cambiati in F3-1-1-2 in F3-3-12-2.
12 mila36 (da F0-1-1-12 a F0-3-12-12)36 (da F0-1-1-10 a F0-3-12-10, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F0 da F0-1-1-10 a F0-3-12-10 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-9 a F1-3-12-9)36 (da F1-1-1-7 a F1-3-12-7, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-7 a F1-3-12-7 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-6 a F2-3-12-6)36 (da F2-1-1-4 a F2-3-12-4, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-4 a F2-3-12-4 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-3 a F3-3-12-3)36 (da F0-1-1-11 a F0-3-12-11)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-11 a F0-3-12-11 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F4-1-1-0 a F4-3-12-0)36 (da F1-1-1-8 a F1-3-12-8)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-8 a F1-3-12-8 agar sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-5 a F2-3-12-5)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-5 a F2-3-12-5 agars sono cresciuti per 1 d.
I nematodi sugli agar F3-1-1-2 a F3-3-12-2 sono cresciuti per 3 d e i marcatori vengono trasformati in F3-1-1-3 in F3-3-12-3. I nematodi F3 iniziano a riprodursi oggi e vengono trasferiti a 36 nuovi agar NGM sono necessari e contrassegnati come F4-1-1-0 a F4-3-12-0. Per gli studi MGR, la prole di F3 (cioè T1') inizia oggi.
13 del sistema36 (da F0-1-1-13 a F0-3-12-13)36 (da F0-1-1-11 a F0-3-12-11, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F0 da F0-1-1-11 a F0-3-12-11 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-10 a F1-3-12-10)36 (da F1-1-1-8 a F1-3-12-8, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-8 a F1-3-12-8 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-7 a F2-3-12-9)36 (da F2-1-1-5 a F2-3-12-5, eliminato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-5 a F2-3-12-5 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-4 a F3-3-12-4)36 (da F0-1-1-12 a F0-3-12-12)Il numero di nematode complessivo da F3-1-1-1 a F3-3-12-1, F2-1-1-4 a F2-3-12-4 e da F2-1-1-5 a F2-3-12-5 per calcolare la riproduzione iniziale di F2.
36 (da F4-1-1-1 a F4-3-12-1)36 (da F1-1-1-9 a F1-3-12-9)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-12 a F0-3-12-12 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-6 a F2-3-12-6)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-9 a F1-3-12-9 agar sono cresciuti per 1 d.
I nematodi della prole di F2 sugli agar F2-1-1-6 a F2-3-12-6 sono cresciuti per 1 d.
I nematodi della prole di F3 da F4-1-1-0 a F4-3-12-0 sono cresciuti per 1 d, e i marcatori sono cambiati in F4-1-1-1 in F4-3-12-1.
14 Del sistema36 (da F0-1-1-14 a F0-3-12-14)36 (da F0-1-1-12 a F0-3-12-12, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-12 a F0-3-12-12 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-11 a F1-3-12-11)36 (da F1-1-1-9 a F1-3-12-9, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-9 a F1-3-12-9 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-8 a F2-3-12-8)36 (da F2-1-1-6 a F2-3-12-6, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 sugli f2-1-1-6 agli agar F2-3-12-6 sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-5 a F3-3-12-5)36 (da F4-1-1-1 a F4-3-12-1, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F4-1-1-1 a F4-3-12-1 sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati. Per gli studi MGR, i nematodi T1' sono cresciuti per 2 d, e inizieranno a riprodurre T2' il giorno successivo (D15), e T2' inizierà a riprodurre T3' su D18. La durata della vita del tipo selvaggio C. elegans è di 15 giorni. Quindi, la fine della durata di vita di T3' sarà su D33.
36 (da F0-1-1-13 a F0-3-12-13)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-13 a F0-3-12-13 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F1-1-1-10 a F1-3-12-10)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-10 a F1-3-12-10 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-7 a F2-3-12-7)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-7 a F2-3-12-7 agar sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-4 a F3-3-12-4)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-4 a F2-3-12-4 agar sono cresciuti per 1 d.
15 Mi lasa del sistema36 (da F0-1-1-15 a F0-3-12-15)36 (da F0-1-1-13 a F0-3-12-13, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-13 a F0-3-12-13 agars sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono cancellati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-12 a F1-3-12-12)36 (da F1-1-1-10 a F1-3-12-10, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-10 a F1-3-12-10 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-9 a F2-3-12-9)36 (da F2-1-1-7 a F2-3-12-7, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 sugli f2-1-1-7 agli agar F2-3-12-7 sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-6 a F3-3-12-6)36 (da F3-1-1-4 a F3-3-12-4, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-4 a F3-3-12-4 agar sono cresciuti per 2d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F0-1-1-14 a F0-3-12-14)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-14 a F0-3-12-14 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F1-1-1-11 a F1-3-12-11)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-11 a F1-3-12-11 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-8 a F2-3-12-8)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-8 a F2-3-12-8 agar sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-5 a F3-3-12-5)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-5 a F2-3-12-5 agars sono cresciuti per 1 d.
1636 (da F0-1-1-15 a F0-3-12-15, oltre)36 (da F0-1-1-14 a F0-3-12-14, cancellato dopo il conteggio)La durata della vita del tipo selvaggio C. elegans è di 15 giorni. Pertanto, F0 dovrebbe essere morto prima del giorno 16 dopo l'esposizione.
36 (da F1-1-1-13 a F1-3-12-13)36 (da F1-1-1-11 a F1-3-12-11, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F0 da F0-1-1-14 a F0-3-12-14 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-10 a F2-3-12-10)36 (da F2-1-1-8 a F2-3-12-8, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-11 a F1-3-12-11 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-7 a F3-3-12-7)36 (da F3-1-1-5 a F3-3-12-5, eliminato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-8 a F2-3-12-8 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F0-1-1-15 a F0-3-12-15)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-5 a F3-3-12-5 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-12 a F1-3-12-12)Il numero complessivo di nematodi da F4-1-1-1 a F4-3-12-1, F3-1-1-4 a F3-3-12-4 e da F3-1-1-5 a F3-3-12-5 per calcolare la riproduzione iniziale di F3.
36 (da F2-1-1-9 a F2-3-12-9)I nematodi della prole di F0 su F0-1-1-15 a F0-3-12-15 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-6 a F3-3-12-6)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-12 a F1-3-12-12 agars sono cresciuti per 1 d.
I nematodi della prole di F2 sugli f2-1-1-9 agli agar F2-3-12-9 sono cresciuti per 1 d.
I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-6 a F2-3-12-6 agar sono cresciuti per 1 d.
17 mi lato36 (da F1-1-1-14 a F1-3-12-14)36 (da F0-1-1-15 a F0-3-12-15, eliminato dopo il conteggio, oltre)I nematodi della prole di F0 da F0-1-1-15 a F0-3-12-15 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati. Non ci saranno più figli di F0.
36 (da F2-1-1-11 a F2-3-12-11)36 (da F1-1-1-12 a F1-3-12-12, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-12 a F1-3-12-12 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-8 a F3-3-12-8)36 (da F2-1-1-9 a F2-3-12-9, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 sugli agar F2-1-1-9 a F2-3-12-9 sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-6 a F3-3-12-6, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-6 a F3-3-12-6 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-13 a F1-3-12-13)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-13 a F1-3-12-13 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-10 a F2-3-12-10)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-10 a F2-3-12-10 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-7 a F3-3-12-7)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-7 a F2-3-12-7 agar sono cresciuti per 1 d.
18 mi lato36 (da F1-1-1-15 a F1-3-12-15)36 (da F1-1-1-13 a F1-3-12-13, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-13 a F1-3-12-13 agars sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono cancellati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-12 a F2-3-12-12)36 (da F2-1-1-10 a F2-3-12-10, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-10 a F2-3-12-10 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-9 a F3-3-12-9)36 (da F3-1-1-7 a F3-3-12-7, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-7 a F3-3-12-7 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-14 a F1-3-12-14)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-11 a F2-3-12-11)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-11 a F2-3-12-11 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-8 a F3-3-12-8)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-8 a F2-3-12-8 agar sono cresciuti per 1 d.
Negli studi MGR, T2' inizierà a riprodurre T3' oggi. La durata della vita del tipo selvaggio C. elegans è di 15 giorni. Quindi, la fine della durata di vita di T3' sarà su D33.
19 del 1236 (da F1-1-1-15 a F1-3-12-15, oltre)36 (da F1-1-1-14 a F1-3-12-14, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-13 a F2-3-12-13)36 (da F2-1-1-11 a F2-3-12-11, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-11 a F2-3-12-11 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-10 a F3-3-12-10)36 (da F3-1-1-8 a F3-3-12-8, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-8 a F3-3-12-8 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F1-1-1-15 a F1-3-12-15)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-15 a F1-3-12-15 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F2-1-1-12 a F2-3-12-12)I nematodi della prole di F2 sugli f2-1-1-12 agli agar F2-3-12-12 sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-9 a F3-3-12-9)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-9 a F2-3-12-9 agar sono cresciuti per 1 d.
20 anni36 (da F2-1-1-14 a F2-3-12-14)36 (da F1-1-1-15 a F1-3-12-15, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F1 su F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati. Non ci saranno più prole di F1.
36 (da F3-1-1-11 a F3-3-12-11)36 (da F2-1-1-12 a F2-3-12-12, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-12 a F2-3-12-12 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-9 a F3-3-12-9, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-9 a F3-3-12-9 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-13 a F2-3-12-13)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-13 a F2-3-12-13 agars sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-10 a F3-3-12-10)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-10 a F2-3-12-10 agars sono cresciuti per 1 d.
21 Mieto36 (da F2-1-1-15 a F2-3-12-15)36 (da F2-1-1-13 a F2-3-12-13, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-13 a F2-3-12-13 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-12 a F3-3-12-12)36 (da F3-1-1-10 a F3-3-12-10, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-10 a F3-3-12-10 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F2-1-1-14 a F2-3-12-14)I nematodi della prole di F2 sugli agar F2-1-1-14 a F2-3-12-14 sono cresciuti per 1 d.
36 (da F3-1-1-11 a F3-3-12-11)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-11 a F2-3-12-11 agars sono cresciuti per 1 d.
22 Milia36 (da F2-1-1-15 a F2-3-12-15, oltre)36 (da F2-1-1-14 a F2-3-12-14, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-14 a F2-3-12-14 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-13 a F3-3-12-13)36 (da F3-1-1-11 a F3-3-12-11, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-11 a F3-3-12-11 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-12 a F3-3-12-12)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-12 a F2-3-12-12 agars sono cresciuti per 1 d.
23 del 23 o36 (da F3-1-1-14 a F3-3-12-14)36 (da F2-1-1-15 a F2-3-12-15, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F2 su F2-1-1-15 a F2-3-12-15 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati. Non ci saranno più prole di F2.
36 (da F3-1-1-12 a F3-3-12-12, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-12 a F3-3-12-12 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-13 a F3-3-12-13)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-13 a F2-3-12-13 agars sono cresciuti per 1 d.
24 Mi lasa' di36 (da F3-1-1-15 a F3-3-12-15)36 (da F3-1-1-13 a F3-3-12-13, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-13 a F3-3-12-13 agar s'innalzano per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-14 a F3-3-12-14)I nematodi della prole di F3 sugli agar F3-1-1-14 a F2-3-12-14 sono cresciuti per 1 d.
25 mi lato36 (da F3-1-1-15 a F3-3-12-15, oltre)36 (da F3-1-1-14 a F3-3-12-14, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-14 a F3-3-12-14 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
36 (da F3-1-1-15 a F3-3-12-15)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-15 a F2-3-12-15 agars sono cresciuti per 1 d.
26 del sistema di36 (da F3-1-1-15 a F3-3-12-15, cancellato dopo il conteggio)I nematodi della prole di F3 su F3-1-1-15 a F3-3-12-15 agar sono cresciuti per 2 d, e gli agar vengono eliminati dopo che i nematodi sono stati contati.
In particolare, negli studi MGR, la prima prole non esposta di F3 (cioè T3') sarebbe nata sulla D18. La durata della vita del tipo selvaggio C. elegans è di 15 giorni. Quindi, la fine della durata di vita di T3' sarà su D33.
Entrambi gli studi MGE e MGR copriranno più giorni quando la durata della vita dei nematodi è più lunga.

Tabella 1: Elenco dei marcatori e delle relative definizioni.

  1. Misurare la riproduzione e la durata della vita negli studi sugli effetti MGE.
    1. In D0 ripetere il passaggio 5.6. Contrassegnare gli agar (3 gruppi con 10 repliche in ciascuno) come Fx-a-b-c, dove x si riferisce al numero di generazione, a si riferisce al numero di gruppo (1 per il controllo, 2 per la bassa concentrazione e 3 per l'alta concentrazione ); b si riferisce alla replica da 1 a 10; e c si riferisce alla durata dell'esposizione (0 indica l'inizio). Per D0, contrassegna gli agar come F0-1-1-0 a F0-3-10-0. I lettori possono fare riferimento alla Tabella 1 per informazioni dettagliate.
    2. Su D1, controllare la crescita del nematode sugli agar, e cambiare i marcatori da F0-1-1-0 a F0-3-10-0 a F0-1-1-1 a F0-3-10-1.
    3. Su D2, controllare la crescita del nematode sugli agar e modificare i marcatori F0-1-1-2 in F0-3-10-2.
    4. Su D3, scegli 24 nematodi F0 da ogni gruppo su 12 nuovi agar NGM con due agar NGM dal punto 5.4. Contrassegnare gli agar come F0-1-1-3 a F0-3-12-3.
    5. Sulla D4, trasferire i due nematodi padre da F0-1-1-3 a F0-3-12-3 raccogliendo i nuovi agar NGM dal passo 5.4. Contrassegnare i nuovi agarNGM come F0-1-1-4 a F0-3-12-4. Modificare i marcatori da F0-1-1-3 in F0-3-12-3 in F1-1-1-1 in F1-3-12-1 per rappresentare la prole di F0 (cioè, F1) entro il primo giorno da quando F0 inizia a riprodursi.
    6. Su D5, utilizzare un microscopio dissettivo per contare i nematodi su F1-1-1-1 a F1-3-12-1 agars dove i nematodi sono cresciuti 2 giorni. Lasciare che gli agar F1-1-1-1 a F1-3-12-1 riproducano F2 per le generazioni successive.
    7. Trasferire i due nematodi padre da F0-1-1-4 a F0-3-12-4 agars raccogliendo su nuovi agar NGM dal passo 5.4. Contrassegnare NGM agars da F0-1-1-5 a F0-3-12-5. Modificare i voti di F0-1-1-4 in F0-3-12-4 in F1-1-1-2 in F1-3-12-2 per rappresentare la prole di F0 (cioè F1) entro il secondo giorno da quando F0 inizia a riprodursi.
    8. Sulla D6, contare i nematodi su F1-1-1-2 a F1-3-12-2 agars. Trasferire i nematodi genitori da F0-1-1-5 a F0-3-12-5 agar a F0-1-1-6 a F0-3-12-6. Modificare i marcatori da F0-1-1-5 in F0-3-12-5 in F1-1-1-3 in F1-3-12-3 per rappresentare la prole di F0 (cioè, F1) entro il terzo giorno da quando F0 inizia a riprodursi.
    9. I nematodi sugli agar F1-1-1-1 a F1-3-12-1 sono cresciuti per 3 giorni. Usali per riprodurre F2 nel successo degli studi sugli effetti MGE. Allo stesso modo, utilizzare nematodi F2 per riprodurre F3 per continuare gli studi di effetto MGE.
    10. Allo stesso modo, trasferire i due nematodi dei genitori ogni giorno e contare i nematodi della prole il giorno successivo, fino a quando i nematodi genitore in 6 agarNGM (cioè la metà degli agar totali in ogni gruppo) interrompere la riproduzione.
    11. Calcolare il numero totale della prole per l'intera durata della riproduzione come dimensione totale della covata. Utilizzare il numero della prole entro i primi 3 giorni per rappresentare la riproduzione iniziale dei genitori.
    12. Utilizzare il giorno in cui la riproduzione dei nematodi genitore si ferma in 6 agar NGM per stimare la durata della riproduzione. Usa i giorni in cui ogni singolo genitore è sopravvissuto come durata della sua vita.
    13. Ottenere la riproduzione iniziale, la durata della riproduzione, la dimensione totale della covata e la durata della durata di F1 nello stesso modo in cui viene eseguita per F0. Allo stesso modo, ripetendo la procedura di cui sopra, è possibile ottenere informazioni sulla riproduzione e sulla durata della vita di F2 (a Fn).
  2. Misurare la riproduzione e la durata della vita negli studi sugli effetti MGR.
    1. Eseguire il passaggio 7.2.4 con gli agar NGM del passaggio 5.4 modificati in quelli del passaggio 2.13.
  3. Misurare gli indici biochimici.
    1. Sciacquare i nematodi dagli agarNGM con acqua sterile e raccoglierli in tubi di centrifuga. Sistemare i nematodi per 30 min e scartare i supernatanti. Utilizzare i nematodi nei pellet per la misurazione dell'effetto.
    2. Aggiungere 1 mL di fosfato freddo con ghiaccio tamponato salina (PBS, pH 7.0) nei nematodi (pellet) nei tubi centrifugati da 1,5 mL per lavare i nematodi.
    3. Centrifuga a 10.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, e scartare con cura i supernatanti con una pipetta.
    4. Agganciare i pellet con azoto liquido o in un congelatore a -80 gradi centigradi.
    5. Omogeneizzare i pellets utilizzando pestelli in un bagno di ghiaccio. Utilizzare 200 PBS ghiacciato 200 per lavare i liquidi residui sul pestello nel tubo di centrifuga prima di estrarre il pestello.
    6. Centrifuga a 10.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi di nuovo, e utilizzare i supernatanti per determinare le attività o le quantità di sostanze biochimiche con i kit commerciali (vedere la Tabella dei Materiali per i dettagli).
    7. Misurare la quantità della proteina totale (TP) nei campioni e utilizzare i risultati come denominatore nel rappresentare altri indicatori biochimici, in modo da eliminare la differenza tra i numeri di nematodi tra i campioni.
  4. Misurare l'espressione genica.
    1. Ripetere i passaggi da 7.4.1 a 7.4.4. Isolare l'RNA totale dai campioni di nematodi utilizzando un kit commerciale di estrazione dell'RNA (vedere la Tabella dei Materiali per i dettagli) secondo le istruzioni del produttore21.
    2. Utilizzare l'RNA per sintetizzare cDNA secondo le istruzioni del produttore21.
    3. Analizzare il campione cDNA nella reazione a catena di polimerasi in tempo reale (RT-PCR) utilizzando i kit SYBR Green RT-PCR secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali)21.
    4. Quantifica i livelli di espressione relativi dei geni scelti con il metodo2 - CT 22e tratta i livelli di espressione del pil-2 (o di altro altro gene di riferimento) come riferimento negativo.

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Risultati

Qui, descriviamo i protocolli per studiare gli effetti delle sostanze chimiche nel corso delle generazioni utilizzando C. elegans negli studi di esposizione trans-generazionale (TG), esposizione multigenerazionale (MGE) e residui multigenerazionale (MGR). I nostri risultati di ricerca sono presentati come esempi. Uno studio presenta gli effetti TG dei metalli pesanti sul comportamento di locomozione3. Gli altri due studi presentano gli effetti MGE e MGR di...

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Discussione

Al fine di condurre con successo il protocollo descritto, dovrebbero essere presi in considerazione i seguenti suggerimenti. Eseguire le operazioni sperimentali complessive in un ambiente sterile. Un'operazione impropria può provocare la contaminazione dei ceppi di E. coli, ad esempio, funghi e acari può ostacolare la normale crescita di C. elegans e quindi influenzare i risultati sperimentali. Nella sezione che descrive la coltivazione C. elegans, osservare la scala di crescita di C. ele...

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Divulgazioni

Gli autori sono grati per i supporti finanziari del National Science and Technology Major Project for Water Pollution Control and Treatment (2017-X07201004) e del Programma internazionale di cooperazione scientifica e tecnologica della Cina (n. 2016YFE0123700).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
 agar powderOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 
96-well sterile microplateCostar?Corning?America
Autoclave sterilizerTomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinetLongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China10043-52-4
centrifuge  5417REppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubesAxygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterolSinopharm chemical reagent company Ltd, China57-88-5
Dimethyl sulfoxideVETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America67-68-5
disodium hydrogen phosphateSinopharm chemical reagent company Ltd, China7558-79-4
ethanolSinopharm chemical reagent company Ltd, China64-17-5
FilterThermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubatorYiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2OSinopharm chemical reagent company Ltd, China16788-57-1
kraft paper
Mcroplate ReaderBoitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2OSinopharm chemical reagent company Ltd, China10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TDBM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
PipetteEppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China7447-40-7
potassium dihydrogen phosphateSinopharm chemical reagent company Ltd, China7778-77-0
Qiagen RNeasy kitsQiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kitsQiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitThermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China7647-14-5
sodium hydroxideSinopharm chemical reagent company Ltd, China1310-73-2
sodium hypochlorite solutionAladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China7681-52-9
tryptoneOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK73049-73-7
yeast extractOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK119-44-8

Riferimenti

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