Valutazione di una reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa nidificata universale per la rilevazione di Lyssaviruses

Riepilogo

È stata sviluppata una reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa nidificata di Pan-Lyssavirus per rilevare in modo specifico tutti i Lyssaviruses conosciuti. La validazione utilizzando campioni di cervello di rabbia di diverse specie animali ha mostrato che questo metodo ha una sensibilità e una specificità equivalenti al test anticorpale fluorescente standard oro e potrebbe essere utilizzato per la diagnosi di rabbia di routine.

Abstract

Per rilevare il virus della rabbia e altre specie membro del genere Lyssavirus all'interno della famiglia Rhabdoviridae, la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa di Pan-Lyssavirus (RT-PCR nidificata) è stata sviluppata per rilevare la regione conservata del gene nucleoproteico (N) di Lyssaviruses. Il metodo applica la trascrizione inversa (RT) utilizzando RNA virale come modello e oligo (dT)₁₅ e esameri casuali come primer per sintetizzare il DNA complementare virale (cDNA). Quindi, il cDNA virale viene utilizzato come modello per amplificare un frammento di gene 845 BP N nella PCR del primo round utilizzando primer esterni, seguiti da PCR nidificata del secondo round per amplificare il frammento finale 371 BP utilizzando primer interni. Questo metodo può rilevare diverse cladi genetiche di virus della rabbia (RABV). La validazione, utilizzando 9.624 campioni cerebrali di otto specie animali domestiche in 10 anni di diagnosi di rabbia clinica e di sorveglianza in Cina, ha mostrato che il metodo ha 100% di sensibilità e 99,97% di specificità rispetto alla fluorescenza diretta test anticorpale (FAT), il metodo standard Gold raccomandato dall'organizzazione mondiale della sanità (OMS) e dall'organizzazione mondiale per la salute animale (OIE). Inoltre, il metodo potrebbe anche amplificare in modo specifico il frammento di gene N mirato di 15 altre specie di Lyssavirus approvate e due nuove nel 10 ° rapporto del Comitato internazionale sulla tassonomia dei virus (ICTV) come valutato da un rilevamento mimico di sintetizzato N plasmidi genici di tutti i Lyssaviruses. Il metodo fornisce una comoda alternativa al FAT per la diagnosi della rabbia ed è stato approvato come standard nazionale (GB/T36789-2018) della Cina.

Introduzione

La rabbia è una malattia zoonotica a livello mondiale causata da virus all'interno del genere Lyssavirus¹. I Lyssaviruses (famiglia Rhabdoviridae) sono virus RNA a singolo-negativo-filamento con un genoma di circa 12 KB che codifica cinque proteine: N, fosfoproteina (P), proteina di matrice (M), glicoproteina (G), e la grande proteina o polimerasi (L). Sulla base delle sequenze nucleotidiche del gene N, della distanza genetica e dei modelli antigenici, i Lyssavirus sono stati suddivisi in 16 specie, comprendenti il virus della rabbia classica (RABV) e i virus correlati alla rabbia (RRV): virus bat di Lagos (LBV), Virus Duvenhage (DUVV ), Il Virus Mokola (MOKV), il bat europeo Lyssavirus 1 (EBLV-1), l'European bat Lyssavirus 2 (EBLV-2), bat lyssavirus australiano (ABLV), virus Aravan (ARAV), virus Ikoma (IKOV), Bokeloh bat Lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat Lyssavirus (GBLV), virus Irkut (IRKV), Virus Khujand (KHUV), virus della bat caucasica occidentale (WCBV), virus bat Shimoni (SHIBV) e Lleida bat Lyssavirus (LLEBV)². Recentemente, sono stati identificati altri due Lyssavirus: Kotalahti bat Lyssavirus (KBLV) isolato da una mazza di Brandt (Myotis Brandtii) in Finlandia nel 2017³ e Taiwan bat Lyssavirus (twblv) isolato da un pipistrello giapponese ( Pipistrellus Abramus) a Taiwan, Cina nel 2016 – 2017⁴.

Tutti i mammiferi sono suscettibili alla rabbia; Tuttavia, nessuna lesione patognomonica lorda o segni clinici specifici ne consentono l'identificazione, e la diagnosi può essere fatta solo nel laboratorio⁵. Il metodo più diffuso per la diagnosi della rabbia è il grasso, che è considerato come il gold standard sia dall'OMS che dall'OIE^5,6. Tuttavia, il FAT può produrre risultati inaffidabili su campioni di tessuto cerebrale degradato/autolizzato. Inoltre, non può essere utilizzato per il dosaggio di campioni di fluidi biologici come il liquido cerebrospinale (CSF), la saliva e l'urina, precludendo in gran parte il suo impiego nella diagnosi prima della morte⁷. Test diagnostici convenzionali alternativi, come il test di infezione della coltura del tessuto della rabbia (RTCIT) e il test di inoculo del topo (MIT), richiedono diversi giorni⁶, un grave inconveniente quando è essenziale una diagnosi rapida.

Vari test diagnostici molecolari (ad esempio, la rilevazione di RNA virale da RT-PCR, il saggio immunosorbente PCR-Linked [PCR-ELISA], l'ibridazione in situ e la PCR in tempo reale) sono utilizzati come tecniche rapide e sensibili per la diagnosi della rabbia⁸. La RT-PCR è ora raccomandata dall'OIE per la diagnosi della rabbia di routine e una PCR heminested (HN) è descritta nel manuale dell'OIE di test diagnostici e vaccini per animali terrestri per rilevare tutti i Lyssavirus⁵. Qui descriviamo un pan-Lyssavirus annidato RT-PCR, che consente il rilevamento specifico e sensibile di tutte le 18 specie di Lyssavirus paragonabile o superiore a quella ottenuta dal FAT. Il principio del metodo è una RT dell'RNA bersaglio (regione conservata del gene Lyssavirus N) in cDNA, seguita dall'amplificazione del cDNA da due cicli di PCR. Il cDNA subisce la PCR del primo round con primer esterni per amplificare un frammento di 845 BP; quindi, la PCR di secondo ciclo utilizza il prodotto PCR al primo round come modello per amplificare un frammento di 371 BP con primer interni. I due cicli di PCR aumentano significativamente la sensibilità del saggio.

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Protocollo

L'uso di topi in questo protocollo è stato approvato dal comitato amministrativo per il benessere degli animali dell'Istituto di medicina veterinaria militare, l'Accademia delle scienze mediche militari, Cina (laboratorio di cura degli animali e l'autorizzazione del Comitato di uso, permesso numero JSY-DW-2010-02). Sono state seguite tutte le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. estrazione dell'RNA

1. Estratto di RNA dalla rabbia-sospetto tessuto cerebrale, biopsie cutanee, saliva, o CSF o da coltura cellulare infetta da RABV, utilizzando metodi di estrazione a base di isotiocianato di guanidinio-fenolo-cloroformio o kit di estrazione di RNA virale commercialmente disponibili. Utilizzare immediatamente l'RNA preparato o conservarlo a-80 ° c fino a quando richiesto.

2. trascrizione inversa dell'RNA virale

1. Rimuovere i reagenti RT elencati nella tabella 1 dal congelatore, tenerli sul ghiaccio e scongelarli e vortici prima dell'uso.
2. Preparare 12 μL di miscela di reazione RT in un tubo PCR da 0,2 mL con i reagenti elencati nella tabella 1. Consentire le variazioni di pipettaggio preparando un volume di mix master almeno una dimensione di reazione maggiore del necessario.
3. Aggiungere 8 μL di campione, RNA di controllo positivo o controllo negativo alla miscela di reazione RT all'interno di una workstation PCR in una stanza modello. Il controllo positivo RT è RNA estratto dalla coltura cellulare infetta con ceppo RABV fisso CVS-11 (Challenge virus standard-11) e conservato a-80 ° c. Il controllo negativo contiene ddH₂O senza RNasi.
4. Mescolare il contenuto dei tubi RT con vortexing; quindi, centrifugare brevemente.
5. Caricare i tubi di reazione in un termociclatore. Impostare il programma di sintesi cDNA con le seguenti condizioni: 42 ° c per 90 min, 95 ° c per 5 min e 4 ° c in attesa. Impostare il volume di reazione a 20 μL. avviare la corsa RT.

3. PCR al primo turno

1. Conservare i reagenti PCR elencati nella tabella 2 sul ghiaccio in una stanza pulita fino all'uso; poi, scongelare e vortice loro.
2. Preparare la miscela PCR al primo round in un tubo PCR da 0,2 mL con i reagenti elencati nella tabella 2.
3. Aggiungere un campione di 2 μL di cDNA o plasmide nel mix PCR del primo round all'interno di una workstation PCR in una stanza modello. Il controllo positivo PCR è CVS-11 cDNA preparato come menzionato nel passaggio 2,3 per il metodo RT sopra indicato. Il controllo negativo PCR è ddH₂O.
4. Trasferire i tubi sigillati in un ciclatore termico PCR e pedalare utilizzando i parametri elencati nella tabella 3.

4. PCR di secondo turno

1. Preparare la miscela di PCR di secondo ciclo in un tubo PCR da 0,2 mL utilizzando i reagenti elencati nella tabella 4.
2. Aggiungere 2 μL di prodotto PCR al primo round nel mix di PCR del secondo round. Inoltre, includere ddH₂O come controllo negativo della PCR di secondo ciclo.
3. Eseguire il ciclo termico della PCR utilizzando gli stessi parametri indicati nel passaggio 3,4.

5. analisi dei prodotti PCR mediante elettroforesi sui gel di agarose

1. Preparare un gel di agarosio 1,5% aggiungendo 1,5 g di agarosio a 100 mL di tris-acetato-EDTA (TAE) e sciogliendolo accuratamente riscaldandolo in un forno a microonde.
2. Aggiungere il bromuro di etidium (EB) (ad una concentrazione finale di 0,01%) o un'altra sostituzione commerciale EB. Versare il gel nello stampo e lasciarlo a solidificare a temperatura ambiente per almeno 30 min.
3. Preparare i campioni di carico miscelando 5 μL di ciascun prodotto PCR con 1 μL di tampone di carico 6x.
4. Caricare i campioni e l'apposito marcatore di DNA separatamente nei pozzetti ed eseguire il gel per circa 30-45 min a 120 V fino a quando la linea colorante è circa il 75%-80% verso il basso il gel.
5. Spegnere l'alimentazione, scollegare gli elettrodi dalla fonte di alimentazione, quindi rimuovere con cautela il gel dalla scatola del gel.
6. Utilizzare un gel UV che documenta il dispositivo per visualizzare e fotografare i frammenti di DNA.

6. caratterizzazione della RT-PCR nidificata

1. 6,1. specificità e sensibilità per la rilevazione di 18 plasmidi di Lyssavirus
   1. Ordina 18 plasmidi commerciali contenenti il gene N completo di ogni Lyssavirus (16 specie di ICTV e due nuove specie) per la PCR.
   2. Calcola il numero di copie del plasmide usando il numero di Avogadro (N_A) e la seguente formula.
      [(g/μL di DNA plasmide)/(plasmide length in BP x 660)] x 6,022 x 10²³ = numero di molecole/μl
   3. Preparare le soluzioni di scorta (2,24 x 10⁹ molecole/μl) di tutti i 18 plasmidi in DDH₂O.
   4. Eseguire diluizioni seriali a 9 10 volte di tutti i 18 plasmidi in ddH₂o. Diluire 10 μl di ogni plasmide con 90 μl di DDH₂o. Vortex e centrifugare brevemente.
   5. Eseguire l'amplificazione PCR come descritto nelle sezioni 3-5.
   6. Analizzare la specificità e la sensibilità della PCR nidificata rilevando una serie di plasmidi Lyssavirus.
2. Determinazione della d l' accertamento l IMIT
   1. Regolare il titolo del ceppo di virus della rabbia CVS-11 coltura cellulare a 10^5,5 TCID₅₀/ml (virus titolo determinato secondo il manuale OIE)⁵.
   2. Eseguire diluizioni seriali a 5 10 volte di CVS-11 (la soluzione stock è 10^5,5 tcid₅₀/ml) come descritto nel punto 6.1.4.
   3. Eseguire l'estrazione dell'RNA e le procedure di amplificazione di RT-PCR nidificate di tutte le diluizioni virali come descritto nelle sezioni 1-5.
3. Compar ISON di il RT-PCR nidificata con il grasso "Gold standard"
   1. Testare tutti i campioni clinici mediante RT-PCR nidificata, quindi confermare i risultati con il sequenziamento del gene FAT⁵ e N⁹.
   2. Utilizzare i dati normalizzati per un'analisi statistica con SAS 9,1. Utilizzare il test Kappa e il test chi quadrato di McNemar per un confronto statistico dei test diagnostici (comando SAS: PROC FREQ; tabella/Accetto). Calcola gli intervalli di confidenza assumendo la distribuzione abinomiale.
4. Valutazione dell'efficacia nel test dei campioni degradati
   1. Esporre due campioni clinici confermati di tessuto cerebrale di cani rabbidi a 37 ° c.
   2. Analisi dei due campioni in ogni giorno di esposizione a 37 ° c mediante RT-PCR nidificata, FAT e MIT⁵.

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Risultati

I risultati della RT-PCR nidificata per rilevare 18 specie di Lyssavirus sono mostrati nella Figura 1. Tutti i controlli positivi della PCR hanno mostrato l'atteso 845 BP nel primo-e 371 BP nelle amplificazioni del secondo round senza banda nel controllo negativo. Tutti i 18 Lyssavirus hanno prodotto le bande attese 845 e/o 371 BP, indicando che la RT-PCR nidificata ha rilevato tutti i 18 Lyssavirus. Sedici Lyssavirus plasmidi avevano un'amplificazione efficiente in due cicli di PCR, ma due,...

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Discussione

Attualmente, RABV è un importante Lyssavirus responsabile di quasi tutte le rabbia umana e animale in Cina, così come in altri paesi. Inoltre, una variante IRKV è stata identificata per la prima volta da un pipistrello Murina leucogaster nella provincia di Jilin nella cina nordorientale nel 2012¹⁰, ed è stato segnalato per causare la morte di un cane nella provincia di Liaoning nel 2017¹¹. Più recentemente, un romanzo Lyssavirus, TWBLV, è stato anche...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 × TAE	Various	Various
6 × loading buffer	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Various	Various
DL 2,000 Marker	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 mM)	TakaRa	4030
Electrophoresis System	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
Gel Imaging System	UVITEC	Fire Reader
Microcentifuge tubes	Various	Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR Machine	BIO-RAD	T100
PCR Tubes	Various	Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Various	Various
Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
RNase-free ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10×)	TakaRa	9152A
Tips	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various