Costruzione di plasmidi CRISPR e rilevamento dell'efficienza knockout nelle cellule di mammifero attraverso un sistema Dual Luciferase Reporter

Hegang Li; Huaiyuan Qin; Ning Zhang; Jinshan Zhao; Jingjing Xin; Flor M. Perez-Campo; Huawei Liu

doi:10.3791/59639

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Method Article

Costruzione di plasmidi CRISPR e rilevamento dell'efficienza knockout nelle cellule di mammifero attraverso un sistema Dual Luciferase Reporter

DOI:

10.3791/59639

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December 5th, 2020

Hegang Li*¹, Huaiyuan Qin*¹, Ning Zhang*¹, Jinshan Zhao¹, Jingjing Xin¹, Flor M. Perez-Campo², Huawei Liu¹

¹Qingdao Agricultural University, Qingdao, China, ²University of Cantabria, Santander y Torrelavega, Spain

* Questi autori hanno contribuito in egual misura

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Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo che descrive un metodo semplificato per la generazione efficiente di plasmidi che esprimono sia l'enzima CRISPR che l'RNA a guida singola associato (sgRNA). La co-trasfezione delle cellule di mammifero con questo vettore sgRNA/CRISPR e un vettore reporter a doppia luciferasi che esamina la riparazione della rottura a doppio filamento consente la valutazione dell'efficienza knockout.

Abstract

Sebbene altamente efficiente, la modifica di un sito genomico da parte dell'enzima CRISPR richiede in anticipo la generazione di uno sgRNA unico per il sito o i siti di destinazione. Questo lavoro descrive i passaggi chiave che portano alla costruzione di vettori sgRNA efficienti utilizzando una strategia che consente il rilevamento efficiente delle colonie positive da parte della PCR prima del sequenziamento del DNA. Poiché un editing efficiente del genoma utilizzando il sistema CRISPR richiede uno sgRNA altamente efficiente, è necessaria una preselezione degli obiettivi di sgRNA candidati per risparmiare tempo e fatica. È stato sviluppato un sistema di reporter a doppia luciferasi per valutare l'efficienza del knockout esaminando la riparazione della rottura a doppio filamento tramite ricottura a singolo filamento. Qui, usiamo questo sistema reporter per raccogliere il target xCas9 / sgRNA preferito dai vettori sgRNA candidati per l'editing genico specifico. Il protocollo delineato fornirà un vettore enzimatico sgRNA/CRISPR preferito in 10 giorni (a partire da oligonucleotidi opportunamente progettati).

Introduzione

Gli sgRNA CRISPR comprendono una sequenza di 20 nucleotidi (il protospazio), che è complementare alla sequenza bersaglio genomica^1,². Sebbene altamente efficiente, la capacità del sistema CRISPR/Cas di modificare un determinato sito genomico richiede la generazione di un vettore che trasporta uno sgRNA efficiente unico per il sito o i siti di destinazione². Questo documento descrive i passaggi chiave nella generazione di quel vettore sgRNA.

Per un corretto editing del genoma utilizzando il sistema CRISPR/Cas, l'uso di sgRNA altamente efficienti è un