Ultrasonografia del tratto urinario maschile adulto per test funzionali urinari

Riepilogo

Descriviamo l'uso di ultrasuoni ad alta frequenza con imaging a contrasto come un metodo per misurare il volume della vescica, lo spessore della parete della vescica, la velocità delle urine, il volume del vuoto, la durata del vuoto e il diametro uretrale. Questa strategia può essere utilizzata per valutare la disfunzione di vuoto e l'efficacia del trattamento in vari modelli murini di disfunzione del tratto urinario inferiore (LUTD).

Abstract

L'incidenza di iperplasia prostatica benigna clinica (BPH) e sintomi del tratto urinario più bassi (LUTS) sta aumentando a causa dell'invecchiamento della popolazione, con conseguente significativo carico economico e di qualità della vita. Sono stati sviluppati modelli murini transgenici e di altro genere per ricreare vari aspetti di questa malattia multifattoriale; tuttavia, mancano metodi per quanticare con precisione la disfunzione urinaria e l'efficacia delle nuove opzioni terapeutiche. Qui, descriviamo un metodo che può essere utilizzato per misurare il volume della vescica e lo spessore della parete detrustore, la velocità urinaria, il volume del vuoto e la durata del vuoto e il diametro uretrale. Ciò consentirebbe la valutazione della progressione della malattia e dell'efficacia del trattamento nel tempo. I topi erano anestesizzati con isoflurane, e la vescica è stata visualizzata dagli ultrasuoni. Per l'imaging non a contrasto, è stata scattata un'immagine 3D della vescica per calcolare il volume e valutare la forma; lo spessore della parete della vescica è stato misurato da questa immagine. Per l'imaging a differenza di contrasto, un catetere è stato posizionato attraverso la cupola della vescica utilizzando un ago calibro 27 collegato a una siringa da tubi PE50. Un bolo di 0,5 mL di contrasto è stato infuso nella vescica fino a quando non si è verificato un evento di minzione. Il diametro uretrale è stato determinato nel punto della finestra campione di velocità Doppler durante il primo evento di annullamento. La velocità è stata misurata per ogni evento successivo che produce una portata. In conclusione, gli ultrasuoni ad alta frequenza si sono rivelati un metodo efficace per valutare le misurazioni della vescica e dell'uretra durante la funzione urinaria nei topi. Questa tecnica può essere utile nella valutazione di nuove terapie per BPH/LUTS in un ambiente sperimentale.

Introduzione

L'iperplasia prostatica benigna (BPH) è una malattia che si sviluppa negli uomini con l'età e colpisce quasi il 90% degli uomini sopra gli 80 anni di età^1,2. Anche se lo sviluppo di BPH è generalmente associato con l'invecchiamento, altri fattori tra cui l'obesità e la sindrome metabolica possono portare alla BPH negli uomini relativamente più giovani^3,4. Molte persone con BPH sviluppano sintomi del tratto urinario inferiore (LUTS) che diminuiscono significativamente la loro qualità di vita, e alcune complicazioni di esperienza che possono includere sanguinamento, infezione, ostruzione della vescica (BOO), calcoli della vescica, e insufficienza renale. Il costo del trattamento per BPH supera i 4 miliardi di dollari all'anno^5,6,7. La diagnosi di LUTS causata da BPH si basa generalmente sull'uso del punteggio dell'indice dei sintomi AUA (AUASI), dell'uroflowmetria e della valutazione della dimensione della prostata⁸. L'eziologia di BPH/LUTS è complessa e multifattoriale, e lo sviluppo e la progressione della malattia sono stati associati con l'iperplasia prostatica (proliferazione della prostata), la contrattilità muscolare liscia e la fibrosi. I trattamenti attuali includono l'uso di bloccanti di z-adrenergici per regolare il tono muscolare liscio all'interno della vescica e della prostata per alleviare gli inibitori di LUTS e/o 5-riduttivi per diminuire il metabolismo degli androgeni e diminuire la dimensione della prostata. Migliori modelli di malattia, murino e altro, per consentire lo studio accurato degli effetti dei vari fattori causali e terapeutici in questo processo di malattia nel tempo è altamente auspicabile⁹.

I modelli di roditore sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'urodinamica; tuttavia, la maggior parte degli studi si concentra sulla minzione femminile e sulla malattia¹⁰. Al fine di esaminare completamente tutti gli aspetti del LUTS maschile, sono stati sviluppati e utilizzati modelli di roditori per studiare diversi aspetti della BPH, tra cui cambiamenti nella proliferazione cellulare, funzione muscolare liscia, deposizione di collagene e infiammazione^{11, 12} mila ^{, 13} del sistema ^{, 14.}Tuttavia, l'anatomia dei roditori e della prostata umana differiscono. Mentre la prostata umana è compatta e racchiusa da uno strato fibromuscolare condensato, la prostata del roditore è lobulare; e queste differenze complicano il confronto diretto della progressione della malattia e dell'efficacia del trattamento. Inoltre, LUTS sono difficili da valutare nei topi, dal momento che non è possibile misurare direttamente il fastidio. Invece, gli attuali metodi per studiare la malattia correlano le caratteristiche istologiche con caratteristiche fisiologiche (ad esempio, il volume della vescica e lo spessore della parete con uroflowmetria, saggi macchia vuota e dati endpoint di cistometria) che confrontano il livello di urinaria disfunzione tra modello BPH e animali di controllo^{12,15,16,17,18}. Le caratteristiche fisiologiche sono spesso valutate come endpoint di necropsia post-mortem, e c'è un'incapacità all'interno dello stesso animale di osservare BOO nel tempo. Recentemente, abbiamo identificato una suddivisione dell'uretra pelvica (l'uretra prostatica) dove gli impianti ormonali esogeni causano un restringimento basato sulle valutazioni di necrosa post-mortem¹². I metodi attuali non consentono la valutazione diretta, in vivo, del restringimento uretrale durante l'annullamento.

L'ecografia è una tecnica diagnostica e di valutazione non invasiva che è stata utilizzata con successo in altri modelli di malattia. Viene utilizzato per quantificare il volume degli organi e valutare il flusso vascolare^19,20,21. L'ecografia viene utilizzata anche per visualizzare e guidare le microiniezioni, consentendo iniezioni mirate di cellule staminali o altri farmaci, e per valutare la funzione cardiaca sistolica e diastolica.

Questo protocollo descrive l'uso di ultrasuoni ad alta frequenza per valutare l'anatomia del tratto urinario inferiore e valutare la fisiologia urinaria nei topi anestesizzati. Descriviamo l'uso di ultrasuoni per misurare il volume della vescica e lo spessore della parete. Descriviamo anche l'uso di ultrasuoni a contrasto migliorato per misurare la velocità delle urine, il volume delle urine, la durata del vuoto e il diametro dell'uretra. L'uso degli ultrasuoni fornisce una comprensione più completa del tratto urinario inferiore in vivo, determina come la malattia altera la normale funzione di svuotamento e ci fornisce gli strumenti per valutare meglio l'efficacia delle nuove opzioni terapeutiche. Attualmente, il protocollo di imaging non a contrasto non è terminale, mentre l'attuale protocollo di imaging a contrasto avanzato è una procedura terminale.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Wisconsin – Madison.

1. Preparazione degli animali

1. Posizionare un topo maschio C57Bl6/J di 24 mesi in una camera precaricata con 3-5% di isoflurane fino a quando il riflesso di raddrico è perso e la frequenza respiratoria rallenta.
2. Se necessario, utilizzare i tagliacapelli per radere i capelli addominali dall'animale per la chirurgia e/o l'imaging. Rimuovere tutti i capelli rimanenti con una crema depilatoria.
3. Posizionare il topo in posizione supina in un cono naso con 2% isoflurane su una piattaforma riscaldata per mantenere l'anestesia. Confermare la profondità dell'anestesia per perdita di movimento da parte dell'animale in risposta a un riflesso di ritiro del pedale (Figura 1B).

2. Set-up ad ultrasuoni

1. Collegare una sonda MV707 con frequenza centrale di 30 MHz alla porta attiva, con l'applicazione preimpostata su "imaging addominale" (Figura 1A).
2. Posizionare la sonda ad ultrasuoni parallelamente all'asse lungo della vescica (Figura 1C).
3. Le immagini dell'asse lungo e corto della vescica, della prostata e dell'uretra sono realizzate in modalità B (Figura 1D).
4. Utilizzare i micromanici "xy" per spostare il mouse.

3. Protocollo di imaging non a contrasto

1. Misurare lo spessore della parete della vescica utilizzando lo strumento di misurazione della distanza lineare e tracciando il bordo esterno fino al bordo interno della parete della vescica b-mode dopo l'acquisizione.
2. Misurare il volume 3D della vescica con lo strumento volumetrico sull'acquisizione della modalità 3D tracciando l'interno delle pareti della vescica per creare un contorno. Contorni multipli vengono quindi generati attraverso lo spessore della vescica per calcolare il volume.

4. Sospensione/attivazione del contrasto microbolle

1. Attivare l'agente di contrasto (ad esempio, DEFINITY) agitando nel mixer vortice per 45 s per incapsulare le microbolle in soluzione. Questo passaggio è fondamentale per un miglioramento ottimale del contrasto.

5. Inserimento catetere

1. Con il topo anestetizzato e registrato alla piattaforma riscaldata, esporre la vescica con un'incisione media naformie affilate/smussate attraverso la pelle e la parete addominale.
2. Inserire nella vescica un ago calibro 27 collegato a una siringa con tubi flessibili in polietilene (PE 50). Precompilare il tubo con salina per garantire che nessuna bolla d'aria venga iniettata nella vescica.

6. Protocollo di imaging con contrasto avanzato

1. Per confermare il posizionamento dell'ago, instillare 10 - L di salina nella vescica mentre viene osservato tramite ultrasuoni.
2. Sostituire la siringa salina con una siringa contenente il contrasto per migliorare la visualizzazione delle pareti uretrali e gli eventi di annullamento, perché l'uretra è normalmente collassata. Una volta ottenuta una vista completa dell'asse lungo dell'uretra e salvato un'immagine, ruotare la sonda di 90 gradi per ottenere una vista breve dell'asse e un'immagine in modalità M.
3. Instillare un bolo di microbolle a 0,5 mL per 3 s nella vescica fino a quando non si verifica un evento di minzione.
4. Durante il primo evento di annullamento, misurare il diametro uretrale nel punto della finestra del campione di velocità Doppler utilizzando lo strumento distanza lineare e la misurazione da bordo a bordo.
5. Con l'uretra correttamente posizionata, inclinare la sonda in relazione all'uretra per diventare più parallela al flusso di urina.
6. Instillare un secondo bolo di microbolle nella vescica e misurare la velocità degli eventi utilizzando lo strumento VTI (Velocity Time Integral).
7. Dopo la raccolta dei dati, eutanasia il topo con dislocazione cervicale.

7. Calcolo e analisi dei dati

1. Selezionare lo strumento VTI per misurare la velocità tracciando le immagini registrate.
2. Misurare il diametro dell'uretra dall'immagine in modalità B o in modalità M utilizzando la convenzione del bordo iniziale al bordo iniziale.
3. Calcolare l'area della sezione trasversale (CSA) utilizzando la seguente formula (CSA) utilizzando le misurazioni dell'immagine ottenute sopra.
4. Calcolare il volume vuoto utilizzando la CSA dell'uretra e moltiplicandolo per l'area sotto la traccia Doppler (velocity time integral)(CSA x VTI - volume).
5. Calcolare l'effettivo volume di urina nulla supponendo un grammo per centimetro di metri cubi di densità.

Risultati

Gli ultrasuoni possono essere utilizzati con o senza miglioramento del contrasto a seconda del progetto sperimentale e della misurazione dell'endpoint. I topi sono anestesizzati con isoflurane e rasati e tutte le tracce di capelli rimossi con una crema depilatoria. Gli animali anestesizzati sono collocati su una piattaforma riscaldata con la sonda ad ultrasuoni posizionata lungo il lungo asse della vescica (Figura 1).

Figura 2 mostra ...

Discussione

Le tecniche attuali per valutare il tratto urinario inferiore dei roditori sono limitate dalla loro capacità di correlare direttamente i cambiamenti nella fisiologia di voiding con cambiamenti nell'istologia prostatica conseguente alla progressione della malattia. I saggi spot void e l'uroflowmetry possono essere utilizzati per valutare gli eventi di minzione spontanea nei roditori, e queste tecniche possono essere utilizzate per valutare i cambiamenti in un periodo di tempo^15,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
21mm Clear Tubing	Supera Anesthesia Innov	301-150
27 gauge needle	BD	Z192376
4 port Manifold	Supera Anesthesia Innov	RES536
DEFINITY	Lantheus Medical Imaging	DE4
F/AIR Canister	Supera Anesthesia Innov	80120
Graefe forceps (Serrated, Straight)	F.S.T.	11050-10
Inlet/Outlet Fittings	Supera Anesthesia Innov	VAP203/4
Isoflurane	Midwest Vet Supply	193.33161.3
Isoflurane Vaporizer	Supera Anesthesia Innov	VAP3000
MV707 probe	Fujifilm VisualSonics Inc
Oxygen Flowmeter	Supera Anesthesia Innov	OXY660
Polyethylene 50 tubing	BD	427516
Pressure Reg/Gauge	Supera Anesthesia Innov	OXY508
Rebreathing Circuits	Supera Anesthesia Innov	CIR529
Small Mice Nose Cone	Supera Anesthesia Inov	ACC526
Sterile saline	Midwest Vet Supply	193.74504.3	NaCl 0.9%, Injectable
Straight Sharp/Blunt Scissors	Fine Scientific Tools (F.S.T)	14054-13
Syringe	BD	309646	5mL
Vevo 770	Fujifilm VisualSonics Inc
VIALMIX	Lantheus Medical Imaging	VMIX