Applicazioni per pannelli di illuminazione compatibili con microplacca open source

Riepilogo

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) è un dispositivo computerizzato che illumina sistematicamente i pozzi di microtiteri per fornire indicazioni per la preparazione manuale delle microplacche.  M.A.P.L.E. migliora l'accuratezza della preparazione della microplacca automatizzando la registrazione dei dati.  Inoltre, può aiutare con l'esame della qualità della microplacca o aiutare nel rilevamento di errori.

Abstract

Le micropille sono comunemente utilizzate nell'ambiente di laboratorio moderno per un'ampia varietà di compiti sia nelle operazioni di laboratorio su piccola scala che nelle campagne di screening ad alta velocità (HTS) su larga scala. Anche se l'automazione di laboratorio ha notevolmente aumentato l'utilità delle microplacche, rimangono casi in cui la strumentazione basata sull'automazione non è fattibile, conveniente o compatibile con le esigenze di formattazione delle micropille. In questi casi, le microplacche devono essere preparate manualmente. La problematica per le manipolazioni manuali di micropilli è che possono sorgere una serie di difficoltà relative al monitoraggio accurato delle operazioni di campionamento, alla conservazione dei record di dati e all'ispezione del controllo qualità (QC) per gli artefatti dei pozzi o gli errori di formattazione. Con l'aumentare della densità dei pozzi di micropiastra (cioè 96-bene, 384-bene, 1536-well) aumenta anche drasticamente il potenziale per l'introduzione di errori.  Inoltre, per le piccole operazioni di laboratorio da banco esiste la necessità di migliorare la facilità e l'accuratezza della movimentazione dei campioni in modo conveniente. Qui, descriviamo un sistema che funge da guida di pipettaggio semi-automatico, indicato come Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.).  M.A.P.L.E. ha molteplici usi per supportare il recupero di colpi composti e la preparazione delle microplaciper per lo sviluppo di analisi nello screening ad alta velocità o nelle operazioni di laboratorio da banco, nonché la valutazione diagnostica qC/quality assurance (QA) della micropiastra qualità o visualizzare gli errori di formattazione del pozzo.

Introduzione

Come recentemente pubblicato¹, il laboratorio di identificazione dei piombi di Scripps Research² ha sviluppato e rilasciato un pannello di illuminazione open source per la preparazione della micropiastra, indicato come Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A. P.L.E.). La preparazione manuale delle microplacche, che siano fatte per la gestione dei composti o per le esigenze di bio-analisi, può essere soggetta a errori umani che aumentano drasticamente e aumenta la densità della micropiastra. Inoltre, una corretta registrazione e registrazione dei dati del contenuto/formato della microplacca è anche soggetta a errori di immissione manuale. Nelle strutture di automazione di screening ad alta velocità effettiva (HTS), questi problemi vengono attenuati dall'uso di workstation robotiche computerizzata che sono integrate con la registrazione automatica dei database; minimizzando le manipolazioni manuali e riducendo il potenziale di errori di formattazione e registrazione dei dati. Tuttavia, rimangono molti casi in cui la strumentazione basata sull'automazione semplicemente non è fattibile o compatibile con le esigenze di formattazione a microplacca, richiedendo un intervento manuale. Inoltre, è necessario supportare operazioni di laboratorio su piccola scala che richiedano dispositivi semiautomatici compatti ed economici per migliorare la loro produttività, precisione e automatizzare la registrazione dei dati della preparazione delle microplacche.

Mentre esistono altri sistemi di illuminazione a micropiastra, sono soluzioni commerciali proprietarie^3,4,5,6,7 limitati a selezionare i formati di microplacche e la loro proprietaria la natura a fonte chiusa impedisce modifiche guidate dall'utente che consentirebbero l'adattamento di questi dispositivi per operazioni specializzate.  M.A.P.L.E. è stato progettato per essere un dispositivo open source poco costoso, con codice sorgente e tutti i file di progettazione disponibili gratuitamente online⁸. Gli utenti con conoscenza delle tecniche di saldatura del montaggio di superficie possono assemblare i propri dispositivi M.A.P.L.E. con i file di codice e di progettazione disponibili su GitHub, oppure possono modificare i modelli di schede a circuito stampato (PCB) fornite, l'alloggiamento di stampa 3D assistito dal computer modelli di progettazione (CAD) e codice per soddisfare le loro esigenze specifiche. Un elenco completo delle parti necessarie per fabbricare la guida luminosa PCB può essere trovato nelle tabelle supplementari 1 e 2 e ulteriori dettagli per quanto riguarda la progettazione e l'implementazione dei pannelli luminosi possono essere trovati di recente documentazione¹. Gli utenti che desiderano acquistare PCB guida luce pre-assemblati basati sui file open-source possono trovarli elencati online⁹.

M.A.P.L.E. fornisce all'utente un pannello di illuminazione facilmente controllabile che ha un ingombro basato su microplacca e una spaziatura LED-to-LED corrispondente alle specifiche Society for Biomolecular Screening (SBS) per micropiastre¹⁰. M.A.P.L.E. è stato sviluppato per supportare microplacche a densità di 96 e 384 pozze e consentire agli utenti di illuminare i pozzi in qualsiasi configurazione, colore e intensità desiderati. Questi pannelli luminosi possono essere utilizzati per illuminare le microplacche per le operazioni di pipettaggio¹¹, per simulare operazioni di formattazione di laboratorio o strumenti come un lettore di microplacia^12,13 per l'istruzione e la dimostrazione Scopi. La natura open source del progetto consente agli utenti di modificare facilmente i pannelli, il firmware o il software dell'interfaccia utente grafica (GUI) per supportare qualsiasi nuova funzionalità desiderata. Le linee guida e la registrazione dei dati sono basate su computer e possono essere integrate con fogli di calcolo o ospitate in un sistema di database. Poiché M.A.P.L.E. è progettato per funzionare con file delimitati da virgole in testo non crittografato, qualsiasi foglio di calcolo o software di database in grado di importare o esportare file in formato CSV può essere facilmente esteso per funzionare con M.A.P.L.E. Inoltre, il recinto del progetto che è stato progettato per questo sistema inclina la micropiastra verso l'utente durante le operazioni di pipettaggio, aumentando l'ergonomia fornendo una postura più naturale per l'utente mentre si è al banco del laboratorio. Caratteristiche operative specifiche del sistema M.A.P.L.E. includono: (i) Facilitare gli sforzi di gestione composta nella preparazione di piastre personalizzate illuminando bene la singola sorgente e la destinazione bene tra micropiastre per la guida di pipettaggio manuale; assistito attraverso uno script del computer che può essere salvato come un record elettronico dopo il completamento. (ii) M.A.P.L.E. può illuminare un numero qualsiasi di pozzi su file o colonne di microplacca; che è ideale per una rapida guida alla diluizione seriale o per il posizionamento dei controlli di replica di selezione. (iii) M.A.P.L.E. può essere utilizzato in modalità dimostrativa per facilitare le esigenze di formazione di laboratorio o per evidenziare i requisiti di formattazione relativi ai posizionamenti di campionamento e controllo o all'utilizzo di pozzi dedicati (ad esempio, gap di barriera effetto bordo). (iv) M.A.P.L.E. può retroilluminazione pozzi trasparenti/traslucidi per consentire la visualizzazione di artefatti come precipitazioni / cristallo, bolle, eterogeneità dei pozzi, pozzi vuoti; che consente inoltre all'utente finale di fotografare facilmente le immagini delle lastre per le esigenze di documentazione

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Protocollo

1. Preparazione semiautomatica di trasferimento del campione "piastra a piastra"

1. Generare un file CSV come illustrato nella Figura 1 contenente le lastre di origine e di destinazione utilizzando un'applicazione di modifica del foglio di calcolo. Il file CSV generato deve avere le seguenti colonne di intestazione nell'ordine elencato: Codice_sorgente; Codice_are di destinazione; Source_well; Dest_well; Transfer_volume.
2. Sotto le colonne di intestazione, assicurarsi di includere una riga nel file CSV per ogni operazione di pipetting desiderata (ad esempio, trasferimento di esempio) con le seguenti informazioni:
   1. Codice a barre Source_codice: codice a barre alfanumerico della microplacca di origine, ad esempio S1007372; lasciare vuoto se non è associato alcun codice a barre.
   2. Codice a barre Destinazione: codice a barre alfanumerico della micropiastra di destinazione, ad esempio D0573282; lasciare vuoto se non è associato alcun codice a barre.
   3. Source_well: identificatore di riga e colonna alfanumerici per il modo in cui è possibile eseguire il pipetted all'esterno dalla lastra di origine, ad esempio H10 per la riga H^(8a riga), colonna 10 (denominazioni di pozzi standard ANSI/SLAS, ad esempio, A1, C10...).
   4. Dest_well: identificatore di riga e colonna alfanumerico per il modo in cui è possibile eseguire il pipetted all'esterno della piastra di destinazione, ad esempio A3 per la riga A (1^st row), colonna 3 (denominazioni di pozzi standard ANSI/SLAS, ad esempio, A1, C10...).
   5. Transfer_volume: Volume da trasferire da source_well in source_barcode a dest_well in destination_barcode (numerico e senza unità: in genere in .
3. Aprire l'applicazione Microplate Assistive Pipetting Light Emitter Plate to plate GUI, illustrata nella Figura 2,aprendo il programma Light Guide (Maple-LightGuide.exe).
4. Fare clic sul pulsante Seleziona file cherrypick nell'angolo superiore sinistro della GUI.
5. Utilizzare la finestra del browser di file, illustrata nella Figura 3, per passare al file CSV generato nei passaggi 1.1 e 1.2 precedenti e fare clic sul pulsante Apri. L'applicazione analizzerà la prima riga del file CSV e illuminerà i pozze corrispondenti nelle lastre di origine e di destinazione.
6. Utilizzare i pulsanti Precedente e Successivo, nell'angolo superiore destro della GUI, illustrato nella Figura 4, per attraversare il file CSV come desiderato. La GUI evidenzierà in grigio tutte le righe precedentemente illuminate ed evidenzieranno in marrone la riga attualmente attiva.
7. Eseguire le operazioni di pipettaggio in base alle esigenze per trasferire i campioni tra il pozzo di origine della piastra di origine al pozzo di destinazione della piastra di destinazione. Un esempio di un'operazione di pipettaggio a mano senza assistenza M.A.P.L.E. è riportato nella Figura 5, con un confronto della vista di pipettaggio utente corrente vista in Figura 4 e Figura 6. Oltre alla GUI dell'utente, i codici a barre a piastre possono essere verificati tramite i display LCD collegati ai pannelli di illuminazione.
8. Continuare fino a quando non viene raggiunta la fine del file CSV tramite il pulsante Avanti pozzo. Per caricare un nuovo file CSV, è possibile fare clic sul file Select cherrypick in qualsiasi momento. Per uscire dal programma si può cliccare sulla X rossa nell'angolo in alto a destra della GUI.

2. Illuminazioni multi-pozzo per trasferimenti paralleli e diluizioni seriali

1. Aprire l'applicazione 'SerialDilution' dell'emettitore di luce con tubazione di Microplate mediante aprendo il programma di diluizione seriale (Maple-SerialDilution.exe).
2. Utilizzare la GUI, illustrata nella figura 7 e nella figura 8,per specificare la modalità di titolazione desiderata (colonna o riga), la densità della piastra e le righe iniziali. La GUI consente inoltre agli utenti di specificare una maschera di colonna o di riga per controllare quali LED in una determinata riga o colonna vengono illuminati. Ciò consente di illuminare un sottoinsieme di LED in una riga o colonna anziché illuminare l'intera riga o colonna.
3. Utilizzare i pulsanti Successivo e Precedente per scorrere le righe o le colonne in sequenza dalla riga o colonna iniziale iniziale all'ultima riga o colonna della piastra. Ogni volta che si fa clic sul pulsante Avanti o Precedente, il pannello luminoso illuminerà i LED corrispondenti della micropiastra.
4. Continuare fino a raggiungere la fine della sequenza di titolazione. Per uscire dal programma, fare clic sulla X rossa nell'angolo in alto a destra della GUI.

3. Formazione di laboratorio: tecniche di sviluppo e screening dei test

1. Inserire una micropiastra da 96 o 384 pozze nella guida luminosa portatile. La guida luminosa portatile contiene una batteria e tutta l'elettronica necessaria per essere utilizzata indipendentemente da un computer. Ciò consente di utilizzare la lightguide portatile in una modalità palmare che può essere controllata con pulsanti incorporati per passare da una modalità dimostrativa all'altra.
2. Utilizzare l'interruttore di commutazione di alimentazione sulla custodia porta luminosa portatile per accendere il sistema.
3. Determinare la modalità in cui si trova la guida luminosa portatile. Per impostazione predefinita, la guida luminosa portatile verrà caricata nella modalità demo HTS predefinita che fornisce agli utenti una rappresentazione visiva di una tipica piastra di analisi come illustrato nella Figura 9. In questa modalità, è possibile utilizzare l'interruttore pulsante destro nella parte superiore della guida luminosa portatile per passare attraverso i seguenti modelli di illuminazione campione.
   1. Tutti i pozze illuminate con colore rosso per simulare l'erogazione reagente di un saggio, ad esempio, (cellule sospese nei supporti).
   2. Tutti i pozzi illuminati con un colore giallo per simulare l'aggiunta di reagente coloranti.
   3. Prima colonna e ultima colonna di pozzi illuminati di verde, colonne di "campo campione" restanti illuminate di blu per indicare la piastra letta sul lettore di microplacio. I pozzetti casuali nel campo campione avranno anche un colore verde di intensità variabile per rappresentare i risultati.
4. Per alternare la guida luminosa tra la modalità demo HTS e la modalità demo di titolazione, premere l'interruttore pulsante sinistro. In questo modo si passerà la guida luminosa portatile alla modalità demo a titola che fornisce una guida visiva agli utenti per capire come le titrations possono essere eseguite in piastre composte. Quando la guida luminosa entra nella modalità demo di titola, si verificherà quanto segue.
   1. Tutti i pozzi nelle colonne 3 e 13 sono illuminati di colore giallo.
   2. Le pressioni successive dell'interruttore a pulsante più a destra illuminano le colonne in sequenza, ad esempio (4 e 14, 5 e 15, ecc.).
   3. Quando il pulsante viene premuto dopo il raggiungimento delle colonne 12 e 22, i pozzetti nelle colonne 4-12 e 13-22 vengono illuminati in intensità decrescente di giallo per rappresentare la titolazione.
5. Per modificare il comportamento predefinito della guida luminosa, collegare la guida luminosa portatile a un computer tramite un cavo USB e seguire le istruzioni dettagliate per l'aggiornamento del firmware predefinito tramite l'IDE di Arduino che si trova sul progetto GitHub pagina⁸. Aggiornando il firmware, è possibile modificare queste modalità per visualizzare altre sequenze o set di LED.

4. Illuminazione di manufatti in microplacche

1. Inserire una micropiastra da 96 o 384 pozze nella guida luminosa portatile.
2. Passare la guida luminosa alla modalità Illuminazione premendo due volte l'interruttore del pulsante a sinistra.
   NOTA: Un esempio dell'uso pratico di questa modalità può essere visto in Figura 10 e Figura 11, dove i composti hanno precipitato fuori soluzione e possono essere osservati sul fondo delle micropiastre. Senza un'illuminazione retroilluminata, la maggior parte del precipitato è invisibile ad occhio nudo, ma la retroilluminazione M.A.P.L.E. rivela precipitare per l'ispezione dell'utente e la documentazione fotografica.
3. Utilizzare il pulsante a destra per alternare tra un set di colori predefiniti in base alle esigenze dell'applicazione. Il pannello luminoso accenderà tutti i LED sui seguenti colori in sequenza con ogni pressione del pulsante destro: rosso, blu, verde, arancione, bianco, viola, giallo e indago.
4. Come passaggio opzionale, utilizzare una fotocamera o uno smartphone per fotografare la piastra illuminata per la registrazione o la documentazione del lavoro.

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Risultati

La piattaforma M.A.P.L.E. è in grado di illuminare i pozzi in micropiastre da 96 e 384 pozzi in una varietà di modi configurabili dall'utente, consentendo un controllo semplice e indipendente del colore e dell'intensità della luce in ogni pozzo. Contribuendo a ridurre le opportunità di errore nelle operazioni di pipettaggio manuale, M.A.P.L.E. aiuta gli utenti a preparare microplacche con maggiore sicurezza che ogni bene contenga il contenuto desiderato. Il trasferimento di campioni tra le piastre e la preparazione d...

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Discussione

Rilasciando M.A.P.L.E. come piattaforma open source, abbiamo introdotto uno strumento di laboratorio che fornisce utilità, ma può anche essere facilmente esteso per soddisfare le esigenze in continua evoluzione dell'utente finale. La preparazione del campione di micropiastra Benchtop è un'attività comune che viene eseguita in un'ampia varietà di ambienti di laboratorio e questo compito può essere notevolmente migliorato con una tecnologia come M.A.P.L.E.

La piattaforma M.A.P.L.E. è stat...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 or 384 well microplate			https://en.wikipedia.org/wiki/Microplate
Microplate Assistive Pipetting Light Emitter	Open source		https://github.com/pierrebaillargeon/Microplate-Assistive-Pipetting-Light-Emitter
Pipettor			https://www.jove.com/science-education/5033/an-introduction-to-the-micropipettor
Spectrometer	Ocean Optics	USB-650 Red Tide