Applicazione di tensione nell'analisi dinamica delle particelle di dispersione della luce

Riepilogo

Qui, viene presentato un protocollo per applicare la tensione alla soluzione durante le misurazioni dinamiche delle dimensioni delle particelle di dispersione della luce con l'intento di esplorare l'effetto dei cambiamenti di tensione e temperatura sull'aggregazione dei polimeri.

Abstract

La dispersione dinamica della luce (DLS) è un metodo comune per caratterizzare la distribuzione delle dimensioni di polimeri, proteine e altre nanoparticelle. La strumentazione moderna consente la misurazione delle dimensioni delle particelle in funzione del tempo e/o della temperatura, ma attualmente non esiste un metodo semplice per eseguire misurazioni di distribuzione delle dimensioni delle particelle DLS in presenza di tensione applicata. La capacità di eseguire tali misurazioni sarebbe utile nello sviluppo di polimeri elettroattivi e sensibili agli stimoli per applicazioni quali rilevamento, robotica morbida e stoccaggio dell'energia. Qui, viene presentata una tecnica che utilizza la tensione applicata accoppiata con DLS e una rampa di temperatura per osservare i cambiamenti nell'aggregazione e nelle dimensioni delle particelle nei polimeri termoresistenti con e senza monomeri elettroattivi. I cambiamenti nel comportamento di aggregazione osservati in questi esperimenti sono stati possibili solo attraverso l'applicazione combinata del controllo della tensione e della temperatura. Per ottenere questi risultati, un potentiostat è stato collegato a una cuvette modificata al fine di applicare la tensione a una soluzione. I cambiamenti nelle dimensioni delle particelle polimeriche sono stati monitorati utilizzando DLS in presenza di tensione costante. Allo stesso tempo, sono stati prodotti dati attuali, che potrebbero essere confrontati con i dati sulle dimensioni delle particelle, per comprendere la relazione tra il comportamento attuale e quello delle particelle. Il polimero polimeropolimero N-isopropylacrylamide (pNIPAM) è servito come polimero di prova per questa tecnica, poiché la risposta di pNIPAM alla temperatura è ben studiata. Cambiamenti nel comportamento di aggregazione della temperatura della soluzione meno critica (LCST) di pNIPAM e poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmetilmethyl methacryla), un blocco-copolimero elettrochimicamente attivo, in presenza di tensione applicata sono osservati. Comprendere i meccanismi alla base di tali cambiamenti sarà importante quando si cerca di ottenere strutture polimeriche reversibili in presenza di tensione applicata.

Introduzione

La dispersione dinamica della luce (DLS) è una tecnica per determinare le dimensioni delle particelle attraverso l'uso di cambiamenti casuali nell'intensità della luce diffusa attraverso la soluzione¹. DLS è in grado di misurare l'aggregazione di polimeri determinando le dimensioni delle particelle. Per questo esperimento, DLS è stata accoppiata con variazioni di temperatura controllate per osservare quando un polimero aggrega, il che è indicativo di aver superato la temperatura della soluzione critica inferiore (LCST)^2,3. Al di sotto del LCST, esiste una fase liquida omogenea; sopra il LCST, il polimero diventa meno solubile, aggrega e si condensa fuori soluzione. Una tensione applicata (cioè un campo potenziale applicato o elettrico) è stata introdotta in tutto il campo di dispersione per osservare gli effetti del campo elettrico sul comportamento di aggregazione e sul comportamento di aggregazione e sull'LCST. L'applicazione della tensione nelle misurazioni del dimensionamento delle particelle consente nuove informazioni sul comportamento delle particelle e sulle successive applicazioni nei campi dei sensori, dello stoccaggio dell'energia, dei sistemi di somministrazione di farmaci, della robotica morbida e di altri.

In questo protocollo sono stati utilizzati due polimeri di esempio. Poly(N-isopropylacrylamide), o pNIPAM, è un polimero sensibile termico, che contiene sia un gruppo amide idrofilo che un gruppo isopropile idrofobico sulla catena macromolecolare^4,5. I materiali polimerici termoattivi come il pNIPAM sono stati ampiamente utilizzati nel rilascio controllato di farmaci, nella separazione biochimica e nei sensori chimici negli ultimi anni^3,4. Il valore della letteratura LCST di pNIPAM è di circa 30-35 c^{4 .} pNIPAM non è in genere elettrochimicamente attivo. Pertanto, come secondo polimero campione è stato aggiunto un blocco elettrochimicamente attivo al polimero. In particolare, il methaclacolo ferrocenylmetilmetilè è stato utilizzato per creare un blocco-copolimero a blocchiN-isopropillicacrine)-polymera blocchi (o p(NIPAM-b-FMMA)^6,7. Entrambi i polimeri di esempio sono stati sintetizzati dalla polimerizzazione di trasferimento a catena di frammentazione ad aggiunta reversibile con lunghezza della catena controllata^8,9,10. Il polimero non elettrochimicamente attivo, pNIPAM, è stato sintetizzato come 100 mer pNIPAM puro. Il polimero elettrochimicamente attivo, p(NIPAM-b-FMMA), era anche la lunghezza della catena di 100 mer, che contiene il 4% di methacrylato ferrocenylmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmetilmethyl (FMMA) e 96% NIPAM.

In questo articolo, viene dimostrato un protocollo e una metodologia per studiare l'effetto della tensione applicata sull'aggregazione polimerica. Questo metodo potrebbe anche essere esteso ad altre applicazioni di DLS, come l'analisi del ripiegamento/dispiegamento delle proteine, le interazioni proteina-proteina e l'agglomerazione di particelle caricate elettrostaticamente per citarne alcune. Il campione è stato riscaldato da 20 a 40 gradi centigradi per identificare l'LCST in assenza e presenza di un campo applicato a 1 V. Quindi, il campione è stato raffreddato da 40 a 20 gradi senza interrompere il campo applicato per studiare effetti isterici o di equilibrio.

Protocollo

1. Esempi di preparati polimerici

1. sintesi polimerica pNIPAM
   NOTA: Questa preparazione produce 10 mL di soluzione da 1 g/L, che è sufficiente per 3-4 esperimenti.
   1. Preparare l'apparato della linea Schlenk. Assicurarsi che la fiaschetta Dewar della trappola fredda sia riempita con un liquame di ghiaccio secco e acetone, o se viene utilizzata una trappola di refrigerazione meccanica, assicurarsi che la trappola abbia raggiunto una temperatura appropriata.
   2. In un flacone rotondo da 50 mL, aggiungere 0,566 g din-isopropylacrylamide (NIPAM), 0,016 g di agente di polimerizzazione reversibile di trasferimento a catena di addetto alla gemma (RAFT) (phthalimidomethyl butyocarbonate), 0,0008 g di 2,2 azobis (2-metilpropionitrile) (AIBN) e 10 mL di 1,4-dioxane. Mettere una barra di agitazione nel pallone. Sigillare il flacone con un setto di gomma, avvolgere con nastro in vinile e sciogliere i monomeri in 1,4 dioxane.
   3. Eseguire il degassamento congelato come segue: Congelare la soluzione immergendo il fiaschetta rotondo in una fiaschetta Dewar contenente un liquame di ghiaccio secco e metanolo. Una volta che tutto il materiale è congelato, utilizzare il collettore a vuoto della linea Schlenk per evacuare il pallone a una pressione interna inferiore a 100 kPa. Isolare il pallone e scongelare sotto vuoto statico, utilizzando acqua tiepida. Riportare il pallone alla pressione atmosferica utilizzando il collettore di azoto della linea Schlenk.
   4. Ripetere il passaggio 1.1.3 tre volte per ridurre al minimo la concentrazione interna di ossigeno.
   5. Sparge la soluzione con azoto per bilanciare la pressione all'atmosfera. Riscaldare il composto a 85 gradi centigradi con un bagno d'olio e mescolare a 200 giri/min per 36 h.
   6. A un becher da 50 mL, aggiungere 40 mL di esagonale. Quindi aggiungere la miscela di polimero al dropwise esano. Il pNIPAM dovrebbe precipitare fuori come floccolo bianco.
      NOTA: il momettale NIPAM è solubile in esamere, ma pNIPAM ha una scarsa solubilità in esano.
   7. Versare la miscela torbida in un imbuto di Bàchner per raccogliere la polvere di pNIPAM bianco. Trasferire la polvere in una fiala da 20 ml e metterla in un forno sottovuoto durante la notte per rimuovere il solvente resivo. Conservare in un contenitore sigillato a temperatura ambiente fino a quando necessario.
2. pNIPAM-block-poly(ferrocenylmetilmetilmetilmetilmetillato) sintesi block-copolimer (p(NIPAM-b-FMMA))
   NOTA: Questa preparazione produce 10 mL di soluzione da 1 g/L, che è sufficiente per 3-4 esperimenti.
   1. Preparare l'apparato della linea Schlenk. Assicurarsi che la fiaschetta Dewar della trappola fredda sia riempita con un liquame di ghiaccio secco e acetone, o se viene utilizzata una trappola di refrigerazione meccanica, assicurarsi che la trappola abbia raggiunto una temperatura appropriata.
   2. In un flacone rotondo rotondo da 50 mL, aggiungere 0,057 g di ferrocenylmetilmetismometitil mehacrylato (FMMA), 0,016 g di agente RAFT, 0,0008 g di AIBN e 10 mL di 1,4-dioxane. Mettere una barra di agitazione nel pallone. Sigillare il flacone con un setto di gomma, avvolgere con nastro in vinile e sciogliere i monomeri in 1,4 dioxane.
   3. Eseguire il degassamento congelato come segue: Congelare la soluzione immergendo il fiaschetta rotondo in una fiaschetta Dewar contenente un liquame di ghiaccio secco e metanolo. Una volta che tutto il materiale è congelato, utilizzare il collettore a vuoto della linea Schlenk per evacuare il pallone a una pressione interna inferiore a 100 kPa. Isolare il pallone e scongelare sotto vuoto statico, utilizzando acqua tiepida. Riportare il pallone alla pressione atmosferica utilizzando il collettore di azoto della linea Schlenk.
   4. Ripetere il passaggio 1.2.3 tre volte per ridurre al minimo la concentrazione interna di ossigeno.
   5. Sparge la soluzione con azoto per bilanciare la pressione all'atmosfera. Riscaldare il composto a 85 gradi centigradi con un bagno d'olio e mescolare per 10 h.
   6. Sciogliere 0,543 g di NIPAM e 0,0002 g di AIBN in 3 mL di 1,4 dioxane. Aggiungere la soluzione nel pallone sotto azoto e sparge per 30 min. Scaldare il composto a 85 gradi centigradi utilizzando un bagno d'olio e mescolare a 200 rpm per altri 36 h.
   7. Aggiungere 40 mL di esagonale a un becher da 50 mL. Quindi aggiungere la miscela di polimero al dropwise esano. Il p(NIPAM-b-FMMA) dovrebbe precipitare fuori come polvere marrone perché il monomero FMMA ha un colore giallo scuro.
      NOTA: i monomeri NIPAM e FMMA sono solubili in esagonale, ma p(NIPAM-b-FMMA) ha scarsa solubilità in esagonale.
   8. Versare la miscela torbida gialla in un imbuto di Bàchner per raccogliere la polvere p(NIPAM-b-FMMA) marrone. Trasferire la polvere in una fiala da 20 ml e metterla in forno sottovuoto durante la notte per rimuovere il solvente resista. Conservare in un contenitore sigillato a temperatura ambiente fino a quando necessario.

2. Esempio DLS e preparazione cuvette

NOTA: questa sezione prepara la cuvette per la tensione applicata e il campione per le misurazioni DLS.

1. Misurare 10 mg di polvere polimerica e sciogliere in 10 mL di acqua filtrata deionizzata (DI). Mettere il composto in frigorifero durante la notte. Quando si è pronti per iniziare l'esperimento, tenere il campione sul ghiaccio.
   NOTA: la concentrazione di polimeri utilizzata in questi esperimenti era di 1 g/L, ma la gamma ottimale di concentrazioni per ogni campione sarà unica. Inoltre, la procedura consigliata consiste nel mantenere il polimero al di sotto del sistema LCST fino a quando non è pronto per il test.
2. Tagliare due pezzi di nastro di rame monolato da 6,3 mm x 7 cm (Figura 1). Utilizzare una pinzetta per attaccare ogni pezzo ai lati opposti dell'interno della cuvette campione DLS, perpendicolare al percorso della luce. La parte inferiore del nastro dovrebbe raggiungere vicino alla parte inferiore della cuvette. Piegare i bordi del nastro di rame sopra la parte superiore della cuvette. Assicurarsi che il nastro di rame sia vicino/avvolto sulla parte superiore della cuvette del campione per garantire un buon contatto elettrico. Assicurarsi inoltre che il nastro di rame non si colleghi ai contatti metallici associati all'apparecchiatura DLS utilizzata per le misurazioni potenziali di zeta.
3. Lavare la cuvette con acqua DI tre volte, quindi tamponare l'acqua in eccesso con un Kimwipe.

3. Controlli e

NOTA: si consiglia di completare tre controlli prima di eseguire ogni esperimento DLS: (1) soluzione per l'acqua vuota; 2 uno standard di taglia; (3) misurazione del polimero prima dell'inizio di una rampa di temperatura o della tensione applicata. Consultare il manuale dello strumento prima dell'operazione per istruzioni sulla preparazione di un campione, la scelta delle impostazioni e la valutazione del campione e della qualità dei dati.

1. Trasferire 1,5 mL di solvente filtrato alla cuvette. Utilizzare l'acqua DI.
2. Inserire la cuvette al supporto cuvette, assicurandosi che la piccola freccia sulla parte superiore della cuvette sia allineata con il supporto cuvette. Chiudere il coperchio.
3. All'interno del software , selezionare Misura sulla barra degli strumenti. Sono state impostate misure manuali per i controlli. Impostare la temperatura sul punto di partenza sperimentale. Selezionare 20 gradi centigradi per questo esperimento.
4. Una volta che il testo nella parte inferiore della finestra dice, Inserisci cella e premere start quando pronto, premere il pulsante di avvio triangolo verde nella parte superiore dello schermo. Questo inizia l'esperimento e il supporto cuvette non deve essere aperto dopo questo.
5. Fare clic sulla scheda Multi-view per osservare i risultati in tempo reale. Monitorare continuamente il campione e la qualità dei dati osservando il tasso di conteggio e la funzione di correlazione. Poiché questo campione è solo solvente, non deve essere osservato alcun segnale chiaro corrispondente alla presenza di particelle.
6. Aggiungere due gocce di una soluzione standard alla cuvette o semplicemente utilizzare il controllo dell'acqua e ripetere i passaggi 3.2-3.6. Utilizzare uno standard di 20 nm per le dimensioni del polistirolo tracciabile dal NIST per questo esperimento.
   NOTA: se viene eseguito il controllo dell'acqua o della soluzione standard, mostra dati incoerenti con i risultati previsti, risolvere l'errore e ripetere fino a quando i controlli non vengono letti come previsto.
7. Sciacquare la cuvette e aggiungere la soluzione polimero/test filtrata. Ripetere i passaggi da 3.2 a 3.5. Occorre osservare una misurazione chiara della soluzione di prova iniziale. Si consiglia di farlo prima di qualsiasi rampa di temperatura o tensione applicata per una misurazione della linea di base.

4. Configurazione SOP DLS

NOTA: Questa sezione si riferisce in particolare al funzionamento di rampa di temperatura di uno strumento DLS Malvern . Prima di iniziare gli esperimenti, si consiglia vivamente di consultare ampiamente il manuale dello strumento per indicazioni sulla selezione di una cella, sulla preparazione di un campione, sulla scelta delle impostazioni di misurazione e sulla valutazione della qualità dei campioni e dei dati.

1. All'interno del software (versione 7.11) scegliere File, quindi fare clic su Nuovo per impostare un nuovo SOP (Figura 2).
2. Fare clic su Tipo di misura per selezionare Tendenza > Temperatura > Dimensioni.
3. In Materialescegliere il materiale e l'indice di rifrazione appropriati. Scegli Le proteine e l'indice di rifrazione (RI) di 1.450 per questo esperimento. Se i valori esatti per l'indice di rifrazione sono desiderati per un calcolo più accurato della distribuzione del volume, lo sperimentatore deve determinare sperimentalmente l'indice di rifrazione del campione.
4. In Disperdentescegliere il solvente appropriato. Scegliere Acqua come solvente in questo esperimento.
5. In Cell, scegliere la cuvette utilizzata. Utilizzare cuvette usa e getta (DTS0012) per questo esperimento.
6. In Sequenza, impostare Temperatura iniziale e Temperatura fine. Per gli esperimenti di riscaldamento, impostare la temperatura di inizio a 20 gradi centigradi e impostare la temperatura finale a 40 gradi centigradi. Per gli esperimenti di raffreddamento, scegliere l'opposto. Deselezionare la casella Torna alla temperatura iniziale.
7. Selezionare un intervallo per ogni modifica della fase di temperatura. Per questi esperimenti, selezionare 1,5 .
8. In Misura, impostare tempo equilibration. Per questi esperimenti, impostare la durata su 120 s. Scegliere il numero di misurazioni. Scegliere 3 misure e Automatico per la durata della misurazione.
9. Salvare SOP, quindi chiudere il file.
10. Se si deve utilizzare la tensione applicata, impostare il potenziatore (Sezione 5) prima di continuare.
11. Una volta che il potentiostat è impostato, o se viene applicata la tensione non viene utilizzata, tornare al software di zetasizer e fare clic su misura sulla barra degli strumenti, quindi fare clic su Avvia SOP.
12. Una volta che il testo nella parte inferiore della finestra SOP dice, Inserisci cella e premere start quando pronto, premere il pulsante di avvio triangolo verde nella parte superiore dello schermo. Questo inizia l'esperimento e il supporto cuvette non deve essere aperto dopo questo.
13. Fare clic sulla scheda Multi-view per osservare i risultati in tempo reale. Monitorare continuamente il campione e la qualità dei dati osservando il tasso di conteggio e la funzione di correlazione. Vedere le figure 3-5 per i risultati sperimentali rappresentativi.

5. Configurazione Potentiostat

NOTA: Si consiglia di utilizzare lo stesso computer per le dimensioni delle particelle e le operazioni di tensione applicate per sincronizzare i dati nel tempo e quindi semplificare la valutazione in un secondo momento. Consultare i manuali dello strumento di tensione applicato per istruzioni sulla configurazione del cablaggio, la consultazione del software e la scelta dei parametri appropriati. Un potenziatore Gamry è stato utilizzato in questi esperimenti.

1. Preparare due fili abbastanza sottili da adattarsi attraverso la piccola fessura sul bordo superiore destro dell'area del supporto della cuvette DLS (Figura 6). Su un'estremità del filo preparato, spogliare l'isolamento per consentire un collegamento al potenziato. All'estremità opposta, saldare un breve morsetto di alligatore al filo e collegare alla cuvette. Assicurarsi che il coperchio del campione DLS sia chiuso.
2. Clamp il filo potenziatore di riferimento bianco e il contro potentiostat rosso portare insieme a uno dei fili preparati. Clamp il piombo potenziatore di lavoro verde e il senso di lavoro blu potentiostat portare all'altro filo preparato. Per questo esperimento, non utilizzare il controsenso arancione e il potenziatore terra nero e lasciarli galleggianti. Per garantire che il circuito non sia corto, questi fili non devono toccare nessun altro piombo o superficie conduttiva.
   NOTA: Non importa a quale lato è collegato ogni lead.
3. All'interno della barra degli strumenti del software, fare clic su Esperimento, quindi sull'opzione E elettrochimica fisicae selezionare Chronoamperometry. Ai fini di questo protocollo, utilizzare una semplice tensione applicata applicando una singola tensione con risposta di corrente misurata nel tempo (cioè, cronoampemetrometria). Indipendentemente dalla metodologia elettrochimica specifica, si consiglia di monitorare la risposta del sistema nel tempo.
   1. Impostare Pre-Step, Step 1e Step 2 Voltage vs Reference. Questa sarà la tensione applicata attraverso l'intero campo/ cuvette. Impostare Voltage su 1 V vs Reference per tutti e tre i passaggi.
   2. Impostare Il tempo di ritardo in base al passaggio. Per questi esperimenti, impostare su 0,5 s per assicurarsi che il sistema sia stabile alla tensione desiderata prima di registrare un segnale.
   3. Impostare l'ora sia per il passaggio 1 ora che per il passaggio 2 Time. Questo controlla per quanto tempo verrà applicata la tensione. Impostare entrambi a 14.400 s per assicurarsi che la tensione applicata continuerà per tutta la durata dell'esperimento DLS.
   4. Imposta periodo di campionamento. Questo è la frequenza con cui il grafico leggerà e registrerà i valori di corrente e tensione. Usare 10.0 s in questo esperimento.
      NOTA: le altre impostazioni non sono significative per i dati presentati qui. Sono stati utilizzati i valori predefiniti nel sistema.
4. Fare clic su OK. Sulla barra degli strumenti superiore verrà visualizzato un segno Attivo che indica che è in corso l'applicazione della tensione. La corrente dovrebbe dare una risposta moderata (A), e non sovraccaricare il potenziatore. Se non viene osservato alcun segnale o segnale eccessivo, il sistema potrebbe essere collegato in modo non corretto e pertanto risolvere l'errore e ripetere fino a quando non viene osservata la corrente prevista.
5. Tornare al passaggio 4.10 per avviare il SOP DLS.

6. Analisi dei dati

NOTA: in questa sezione viene descritta in dettaglio l'analisi preliminare per comprendere i dati ottenuti.

1. Importa i dati nel software di analisi e grafica dei dati preferito.
2. Per ogni esecuzione all'interno di una serie di misurazioni a una determinata temperatura, determinare la dimensione del volume delle particelle del picco con la percentuale di volume più grande.
3. Calcolare la deviazione media e standard della dimensione del volume sulle tre misurazioni registrate a una determinata temperatura.
4. Per ogni esperimento, tracciare la dimensione media: la deviazione standard sull'asse y (scala di log) rispetto alla temperatura sull'asse x (scala lineare).
5. Importare i dati correnti di Gamry per l'analisi. Tracciare i dati correnti con il tempo sull'asse x e corrente (in microamplificatori) sull'asse y.
6. Per correlare i dati correnti con i dati relativi alle dimensioni delle particelle, confrontare il timestamp dei dati relativi allo strumento di memorizzazione temporale corrente di Gamry. Ciò è possibile se i due tipi di dati vengono raccolti dallo stesso computer. In caso contrario, corrispondono ai tempi registrati nel miglior modo possibile.

Risultati

L'output del file in tempo reale di ogni esecuzione nella rampa di temperatura è presentato come una tabella, come illustrato nella Figura 3. Ogni record può essere scelto in modo indipendente per visualizzare le dimensioni del volume (Figura 4) e il coefficiente di correlazione (Figura 5). La distribuzione delle dimensioni delle particelle di volume (PSD) è il dato più accurato per interpretare ...

Discussione

L'applicazione della tensione alle soluzioni pNIPAM o p(NIPAM-b-FMMA) ha modificato il comportamento di aggregazione dei polimeri in risposta alla temperatura. Con entrambi i materiali, quando era presente una tensione applicata, la dimensione del volume dei polimeri è rimasta elevata anche quando le soluzioni sono state raffreddate al di sotto del loro LCST. Questo è stato un risultato inaspettato, poiché le prove senza tensione hanno mostrato che i polimeri tornavano alle loro dimensioni originali. Questi e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Isopropylacrylamide	Tokyo Chemical Industry CO., LTD	I0401-500G
1,4-Dioxane	Alfa Aesar	39118
2,2"-Azobis(2-methylpropionitrile)	SIGMA-ALDRICH	441090-100G
Cuvette	Malvern	DTS0012
Dynamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer NanoZS
Ferrocenylmethyl methacrylate	ASTATECH	FD13136-1G
Phthalimidomethyl butyl trithiocarbonate	SIGMA-ALDRICH	777072-1G
Potentiostat	Gamry	Reference 600