Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Riepilogo

Questo articolo presenta un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato che richiede la decalcificazione e l'uso di un adesivo per cellule e tessuti per aderire i pezzi di epitemi cocleari a 10 mm rotondi schede di copertura per l'immunostochimica nelle cocleee di topo adulto.

Abstract

L'elaborazione uditiva nella coclea dipende dall'integrità delle cellule ciliate meccanosensoriali. Nel corso della vita, la perdita dell'udito può essere acquisita da numerose eziologie come l'esposizione a rumori eccessivi, l'uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell'orecchio, lesioni alla testa, e il processo di invecchiamento. La perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune delle varietà di perdita dell'udito acquisita. Inoltre, la sinapsi delle cellule ciliate interne può essere danneggiata da lievi insulti. Pertanto, i preparati superficiali di epiteli cocleari, in combinazione con tecniche di immunoetichettatura e immagini confocali, sono uno strumento molto utile per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi del nastro e cellule ciliate sensoriali, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate e nelle cellule di supporto, rigenerazione delle cellule dei capelli e determinazione dell'espressione genica del rapporto (cioè GFP) per la verifica della trasduzione e l'identificazione dei tipi di cellule trasdotte. La coclea, una struttura a spirale osa nell'orecchio interno, contiene l'organo finale sensoriale uditivo, l'organo di Corti (OC). Le cellule ciliate sensoriali e le cellule portante circostanti nell'OC sono contenute nel condotto cocleare e poggiano sulla membrana basilare, organizzate in modo tonotopico con rilevamento ad alta frequenza che si verifica nella base e a bassa frequenza nell'apice. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la capacità di manipolare i geni mediante tecniche di knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca biologica, anche nella scienza dell'udito. Tuttavia, la coclea adulta del topo è minuscola, e l'epitelio cocleare è incapsulato in un labirinto osseo, rendendo difficile la microdissezione. Anche se le tecniche di dissezione sono state sviluppate e utilizzate in molti laboratori, questo metodo di microdissezione modificato utilizzando l'adesivo per cellule e tessuti è più facile e più conveniente. Può essere utilizzato in tutti i tipi di cocleari di topi adulti dopo la decalcificazione.

Introduzione

La coclea è dedicata alla rilevazione del suono e responsabile dell'udito. Il condotto cocleare è arrotolato a spirale nel labirinto osseo e detiene l'organo finale sensoriale uditivo, l'organo di Corti (OC). L'OC poggia sulla membrana basilare, che costituisce l'epitelio cocleare, con una lunghezza di circa 5,7 mm quando srotolato nei topi adulti CBA/CaJ^1,2. Poiché l'OC è tonotopicamente organizzato con alte frequenze rilevate nella base e nelle basse frequenze nell'apice, l'epitelio cocleare è spesso diviso in tre parti per confronti analitici: i giri apicali, medi e basali corrispondenti a bassi, medio e ad alta frequenza, rispettivamente. Oltre a una serie di cellule di supporto, l'OC è composto da una fila di cellule ciliate interne (IHC) situate medialmente e tre file di cellule ciliate esterne (OHC) situate lateralmente rispetto alla spirale cocleare.

Una corretta elaborazione uditiva dipende dall'integrità delle cellule ciliate sensoriali nella coclea. Il danno o la perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune della perdita dell'udito acquisita, causata da numerose eziologie come l'esposizione a rumori eccessivi, l'uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell'orecchio, lesioni alla testa e l'invecchiamento processo³. Inoltre, l'integrità e la funzione delle cellule ciliate interne / sinapsi nervose uditive possono essere compromesse da lievi insulti⁴. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la manipolazione dei geni mediante tecniche knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella scienza dell'udito. Anche se la coclea adulta del topo è minuscola e l'epitelio cocleare è circondato da una capsula ossea con conseguente microdissezioni tecnicamente difficili, le preparazioni superficiali dell'epitelio in combinazione con immunoetichettatura o immunohistochimica e le immagini confocali sono state ampiamente utilizzate per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi a nastro e cellule ciliate, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate sensoriali e nelle cellule di supporto, e rigenerazione delle cellule dei capelli. I preparati cocleari sono stati utilizzati anche per determinare il modello di espressione dei geni reporter (ad esempio, GFP) e confermare la trasduzione riuscita e identificare i tipi di cellule trasdotte. Queste tecniche sono state precedentemente utilizzate per lo studio di meccanismi molecolari alla base della perdita dell'udito indotta dal rumore utilizzando topi adulti CBA/J^5,6,^7,8,9.

A differenza dell'immunohistochimica che utilizza sezioni di paraffina o criosezioni per ottenere piccole porzioni trasversali della coclea che contengono tre cellule ciliate esterne (OHC) e una cellula pilifena interna (IHC) su ogni sezione, i preparati cocleari della superficie visualizzazione dell'intera lunghezza dell'OC per il conteggio delle cellule ciliate sensoriali e delle sinapsi a nastro e l'immunoetichettatura delle cellule ciliate sensoriali corrispondenti a specifiche frequenze funzionali. La tabella 1 mostra la mappatura delle frequenze uditive in funzione della distanza lungo la lunghezza della spirale cocleare nel topo CBA/J adulto secondo gli studi di Muller¹ e Viberg e Canlon^1,2. I preparati di superficie cocleare sono stati ampiamente utilizzati per lo studio delle patologie cocleari^{4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15}. L'intero metodo di dissezione cocleare è stato originariamente descritto in un libro edito da Hans Engstrom nel 1966¹⁶. Questa tecnica è stata successivamente perfezionata e adattata a una varietà di specie, come descritto nella letteratura da un certo numero di scienziati nell'udito scientifico^{10,11,12,13, 15,17} e dagli Eaton-Peabody Laboratories presso Massachusetts Eye e Ear¹⁸. Recentemente, un altro metodo di dissezione cocleare è stato segnalato da Montgomery et al.¹⁹. La microdisezione della coclea è un passo essenziale e critico per le preparazioni della superficie cocleare. Tuttavia, la dissezione delle cocleari di topi è una sfida tecnica e richiede una pratica considerevole. Qui, viene presentato un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato per l'uso nelle cocleae dei topi adulti. Questo metodo richiede la decalcificazione e l'uso di adesivi cellulari e tissutali (ad esempio, Cell-Tak) per aderire ai pezzi di epitelio cocleare a 10 mm rotazioni rotonde per l'immunoetichettatura. L'adesivo per cellule e tessuti è stato ampiamente utilizzato per l'immunoistochimica²⁰. Questo metodo di microdissezione cocleare modificato è relativamente semplice rispetto a quelli precedentemente riportati^18,19.

Protocollo

Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgevano topi adulti maschi CBA/J all'età di 10-12 settimane e C57BL/6J topi all'età di 6-8 settimane sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Medical University of South Carolina (MUSC). La cura degli animali era sotto la supervisione della Divisione delle risorse animali di laboratorio del MUSC.

NOT: Per le procedure presentate di seguito, i topi sono anestesizzati con ketamina (100 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) tramite iniezioni intraperitive. I topi vengono decapitati dopo che l'animale non risponde più a stimoli dolorosi, come un pizzico di punta.

1. Estrazione di ossa temporali

1. Decapitare immediatamente il topo post-mortem con forbici chirurgiche (17 cm di lunghezza) e tagliare l'osso del cranio con le forbici dall'aspetto posteriore in avanti lungo la linea centrale del cranio dopo aver esposto l'osso del cranio tirando la pelle anteriormente.
2. Rimuovere il tessuto cerebrale con la pinze e rimuovere manualmente le ossa temporali con il pollice e l'indice per i topi di tre mesi di età o più. Utilizzare piccole forbici chirurgiche (11 cm di lunghezza) per tagliare l'osso temporale di topi di età inferiore ai tre mesi.
3. Mettere l'osso temporale in una piastra Petri (30 mm di diametro) contenente una soluzione fresca 4% di paraformaldeide (PFA) disciolta in salina con tamponamenti di fosfati (PBS), pH 7.4.
   NOT: Preparare una soluzione PFA fresca del 4% e regolare il pH a 7,4 appena prima di fissare le ossa temporali, perché il bilanciamento improprio del pH della soluzione PFA ridurrà la qualità dell'immunoetichettatura.

2. Fissazione e perfusione

1. Togliere le stapes dalla finestra ovale e forare la membrana rotonda della finestra con dimensioni #5 pinze. Sotto un microscopio di dissezione stereo fare un piccolo foro nell'apice della coclea utilizzando un ago 27 G collegato a una siringa da 1 mL.
2. Confondete delicatamente e lentamente la coclea con una soluzione PFA del 4% tramite le finestre rotonde e ovali fino a quando la soluzione non si lava dal piccolo foro all'apice. Trasferire la coclea (una o due cocleae per fiala) a fiale di scintillazione di volume da 20 mL contenenti 10 mL di soluzione PFA del 4%.
3. Agitare delicatamente le fiale scintillanti a temperatura ambiente (RT) per 2 ore e lasciare per notare in frigorifero (4 gradi centigradi) su un rotatore.
   NOT: Il tempo di fissazione può essere regolato a seconda dell'anticorpo utilizzato. Ad esempio, limitare la fissazione a 1,5 h consentirà di utilizzare con successo l'immunoetichettatura dei terminali post sinaptici quando si utilizza l'anticorpo GluA 2.

3. Decalcificazione dell'osso temporale

1. Rimuovere la soluzione PFA e lavare le cocleae con PBS 3x fresco per 5 min ciascuno.
2. Aggiungere alla luce le fiale scintillanti 20 mL del 4% di aquilonicadiata (EDTA) (pH 7.4) e conservarle in frigorifero per 48-72 h su un rotatore con agitazione delicata. Modificare la soluzione EDTA ogni giorno fino a quando le cocleae non vengono decalcolate. Controllare se le coclee sono decalcolate toccando la porzione vestibolare ossea con pinze per valutare l'elasticità o semplicemente tagliare un piccolo pezzo dal bordo della porzione vestibolare. Se tale taglio risulta in un pezzo schiacciato, la coclea non viene decalcolata.
   NOT: La soluzione EDTA può interferire con l'immunoreazione degli anticorpi primari a seconda della concentrazione della soluzione. Preparare il 4% EDTA in PBS e regolare il pH a 7.4. Per una costante decalcificazione delle ossa temporali, viene utilizzata una soluzione EDTA fresca.
3. Modificare la soluzione in PBS per la microdissezione al termine della decalcificazione.
   NOT: Se le cocleari non sono sufficientemente decalcolate, la dissezione delle coclee non può essere eseguita.

4. Microdisezione dell'epitelio cocleare

NOT: Una volta completata la decalcificazione, la microdissezione dell'epitelio cocleare per l'immunoetichettatura deve essere eseguita il prima possibile. In un piatto Petri pulito da 30 mm contenente PBS, l'orecchio interno è orientato nel modo seguente: in riferimento alla parte superiore (coperchio) del piatto Petri e al fondo, le finestre rotonde e ovali cocleari si affacciano sulla parte superiore. In riferimento al dissettore, la porzione cocleare è orientata verso la parte anteriore (lontano dal dissettore) e la porzione vestibolare verso la parte posteriore (vicino al dissettore). Di seguito vengono descritti in dettaglio i passaggi.

1. Tenere la parte vestibolare dell'osso temporale con le pinze e tagliare la curva apicale con il bisturi ad un angolo di 45 gradi, come indicato dalla linea rossa (Figura 1a).
2. Tagliare verticalmente lungo la linea di svenimento tra la finestra rotonda e la finestra ovale, come indicato dalla linea rossa (Figura 1b) per separare la coclea dalla parte vestibolare (Figura 1c).
   NOT: Questa porzione cocleare contiene le porzioni centrali, basali e uncino dell'epitelio.
3. Posizionare la porzione cocleare con la curva basale verso il basso e il centro girare verso la parte superiore della piastra Petri e tagliare la capsula ossea e la parete laterale del centro girare verso l'estremità da cui è stata rimossa la sezione apicale, come indicato dalla linea rossa (Figu re 1d,e).
4. Continuare il taglio per separare completamente la parte centrale dalle regioni basali e di aggancio (Figura 1f,g).
   NOT: La regione gancio della coclea è la fine dell'epitelio cocleare corrispondente alla sensibilità ai toni 48 kHz e superiore nei topi.
5. Mettere la porzione basale e gancio con il sito della membrana basilare orientata verso il fondo del piatto e tagliare verticalmente il modiolo fuori dalla regione gancio per rimuovere il modiolus come indicato dalla linea rossa verticale (Figura 1g).
   NOT: Il modiolo è l'asse centrale a forma conica della coclea che consiste di osso spugnoso e nervi cocleari, nonché il ganglio a spirale. Può essere preferibile eseguire questo taglio con le forbici.
6. Tagliare le regioni basale e gancio come indicato dall'altra linea rossa nella Figura 1g per separare la porzione di gancio (Figura 1h).
   NOT: La coclea è ora stata separata in porzioni apicali, centrali, basali e gancio. I prossimi passi saranno la dissezione finale di ciascuna delle singole curve, utilizzando il turno centrale come esempio.
7. Tagliare le porzioni relativamente grandi di capsula ossea e tessuto a parete laterale del turno centrale come indicato dalla linea rossa (Figura 1i).
   NOT: La parete laterale del condotto cocleare è formata dal legamento a spirale e dalla stria vascolari.
8. Tenere la parete laterale con pinze per allineare la capsula ossea e la parete laterale con il fondo del piatto Petri e tagliare questi tessuti dal lato della membrana basilare. Quindi appiattire il campione per orientare la superficie della cellula ciliata sensoriale verso l'alto. Tagliare via il resto della capsula ossea e parete laterale (Figura 1j).
9. Rimuovere la membrana tectoriale utilizzando pinze per separare completamente la regione centrale (Figura 1k).
10. Ripetere i passaggi di 4,7 x 4,9 per le dissezioni finali delle curve o delle regioni rimanenti, come illustrato nella Figura 1l.
11. Preparare una vela rotonda da 10 mm per l'adesione dell'epitelio sensoriale. Utilizzare una pipetta per diffondere a mano 0,5 ll di adesivo di cellule e tessuti al centro della vesscio rotonda. Dopo l'essiccazione (3-5 min a RT), mettere i copricopertine in PBS in piatti Petri.
12. Attaccare tutti e quattro i pezzi dell'epitelio sensoriale sulla planiglia rotonda da 10 mm nella parabola Petri. Quindi tenere un bordo della copertina per trasferirlo in un piatto di quattro pozzi per immunoetichettatura o immunohistochimica (Figura 1m).
    NOTA: la figura 2 illustra la posizione dei tagli principali.

5. Immunolabeling per sinapsi di cocleare

NOT: Il protocollo per l'immunoetichettatura per le sinapsi cocleari seguito in questo studio è stato descritto in precedenza¹³. I nastri presilpatici sono stati etichettati con un anticorpo CtBP2 (proteina legante topo anti-carboxyl-terminale 2 IgG1, etichettando il dominio B della proteina di scaffolding RIBEYE). I terminali post sinaptici sono stati etichettati con l'anticorpo GluA2 (recettore del topi anti-glutammato 2 IgG2a, etichettatura delle sottounità del recettore AMPA).

1. Lavare l'epitelio sensoriale con PBS 3x per 5 min ogni lavaggio in un piatto di quattro pozzetti e quindi aggiungere 2 mL del 2% di surfactant nonionico (cioè Triton-X 100) nel piatto per 30 min a RT su un rotatore.
2. Togliere la soluzione surfactant nonionica dal piatto utilizzando una pipetta e aggiungere 100 l di soluzione di blocco contenente 10% siero di capra normale a ogni pozzo per 1 h su un rotatore con agitazione delicata a RT.
3. Rimuovere la soluzione di blocco da ogni pozzo, lavare con PBS 3x per 5 min ogni lavaggio sotto agitazione delicata a RT.
4. Aggiungere 100 l degli anticorpi primari diluiti con PBS per ogni pozzo: topo anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), topo anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Coprire ogni piatto di quattro pozzi con il coperchio e posizionarlo in un grande contenitore umidificato che protegge dalla luce. Incubare a 37 gradi centigradi per 24 ore.
   NOT: Come opzione, è possibile aggiungere il coniglio anti-miosina VIIa (1:400) per l'immunoetichettatura delle cellule ciliate sensoriali.
5. Lavare 3x con PBS per 5 min ogni lavaggio con agitazione delicata a RT.
6. Aggiungere 100 l degli anticorpi secondari Alexa 594 capra anti-tono IgG1a (1:1,000), Alexa 488 capra anti-topo IgG2a (1:1,000) diluito con PBS per ogni bene. Coprire ogni piatto di quattro pozzi con il coperchio e posizionarlo in un grande contenitore umidificato che protegge dalla luce. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 ore.
   NOT: Se si usa la miosina VIIa, aggiungere Alexa 350 capra anti-coniglio (1:200).
7. Lavare 3x con PBS per 5 min. Quindi, trasferire la vetritta rotonda da 10 mm su una diapositiva con i campioni in cima.
8. Aggiungere con cura 8 -L di Fluoro-Gel con il tampone Tris al centro della coverslip. Quindi tenere il bordo di un altro coperchio rotondo da 10 mm con pinze da montare sulla parte superiore, inserendo le due coverlips insieme.
9. Utilizzare smalto per sigillare i vetrini, metterli in una cartella di diapositive di cartone, e conservare in frigorifero.
   NOT: Se alcuni Fluoro-Gel fuoriescono tra i copricapi durante il montaggio, pulire i bordi dei copricapi prima di sigillare lo scivolo con lo smalto. Le immagini confocali devono essere scattate entro 7 giorni.

Risultati

I preparati superficiali dell'epitelio cocleare, in combinazione con l'immunoetichettatura e l'imaging confocale, sono stati ampiamente utilizzati nella scienza dell'udito per lo studio di patologie cocleari, come la quantificazione delle sinapsi del nastro, le cellule ciliate sensoriali, ed espressione proteica nelle cellule ciliate sensoriali^5,6,7,8. Anche se la dissezione delle cocleari di t...

Discussione

La microdissezione cocleare dei preparati superficiali a montaggio intero in combinazione con l'immunoetichettatura fornisce uno strumento di base per lo studio delle patologie dell'orecchio interno e dei meccanismi molecolari. Questo metodo di dissezione cocleare del topo adulto modificato utilizzando l'adesivo della cellula e del tessuto semplifica questa difficile procedura.

Anche se questo metodo di preparazione della superficie cocleare modificato è relativamente facile e accessibile, ri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mm Rund Coverslips	Microscopy products for science and industry	260367
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2	Thermo Fisher Scientific	A-21131
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1	Thermo Fisher Scientific	A-21125
Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A11012
Carboard Micro Slide Trays	Fisher Scientific	12-587-10
Cell-Tak	BD Biosciences	354240
Corning Petri Dishes	Fisher Scientific	353004
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
Dumont #5 Forceps	FST fine science tools	11251-20
EDTA Disodium Salt	Sigma-Aldrich	E5134
Fluoro-gel with Tris Buffer	Electron Microscopy Sciences	17985-10
Four-well Cell Culture Dishes	Greiner Bio-One	627170
Goat Anti-myosin VIIa Antibody	Proteus Biosciences	25-6790
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Mouse Anti-CtBP2 Antibody	BD Biosciences	#612044
Mouse Anti-Glu2R Antibody	Millipore	MAB397
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP665-1
Scalpel	VWR	100491-038
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15001-08