Quantificazione della lisciviazione dei metalli nella cromatografia di affinità metallica immobilizzata

Riepilogo

Vi presentiamo un saggio per una facile quantificazione dei metalli introdotti nei campioni preparati utilizzando la cromatografia dell'affinità dei metalli immobilizzati. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol come indicatore di metallo colorimetrico e uno spettrofotometro UV-Vis come rivelatore.

Abstract

La contaminazione di enzimi con metalli lisciviati da colonne di affinità dei metalli immobilizzati (IMAC) rappresenta una grande preoccupazione per gli enziologi, poiché molte delle cazioni di-e trivalenti comuni utilizzate nelle resine IMAC hanno un effetto inibitorio sugli enzimi. Tuttavia, l'entità della lisciviazione dei metalli e l'impatto di vari reagenti di eluizione e riduzione sono scarsamente compresi in gran parte a causa dell'assenza di protocolli di quantificazione dei metalli di transizione semplici e pratici che utilizzano apparecchiature tipicamente disponibili in laboratori di biochimica. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare rapidamente la quantità di contaminazione da metalli nei campioni preparati utilizzando iMAC come fase di purificazione. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol (HNB) come indicatore colorimetrico per il contenuto di metalli in una soluzione campione e la spettroscopia UV-Vis come mezzo per quantificare la quantità di metallo presente, nella gamma nanomolar, in base alla modifica dello spettro HNB a 647 nm. Mentre il contenuto di metalli in una soluzione è stato storicamente determinato utilizzando la spettroscopia atomica di assorbimento o tecniche plasmatiche accoppiate induttivamente, questi metodi richiedono attrezzature specializzate e formazione al di fuori dell'ambito di un tipico laboratorio di biochimica. Il metodo qui proposto fornisce un modo semplice e veloce per i biochimici di determinare il contenuto di metalli dei campioni utilizzando attrezzature e conoscenze esistenti senza sacrificare la precisione.

Introduzione

Fin dalla sua nascita da Porath e collaboratori¹, la cromatografia di affinità del metallo immobilizzato (IMAC) è diventata un metodo di scelta per separare rapidamente le proteine in base alla loro capacità di legarsi con gli ioni metallici di transizione come n², Ni², Cu²e Co^{2 .} Questo è più comunemente fatto tramite tag poli-istidina ingegnerizzati ed è ora una delle tecniche di purificazione cromatografica più comuni per l'isolamento delle proteine ricombinanti². L'IMAC ha anche trovato applicazioni che vanno oltre la purificazione ricombinante delle proteine come un modo per isolare quinolones, tetracicline, aminoglitrali, macrolidi e latcombe z per l'analisi dei campioni alimentari³ e come passo nell'identificazione dei marcatori proteici del siero del sangue per il fegato e i tumori del pancreasco^4,5. Non sorprende, IMAC è diventato anche un metodo di scelta per l'isolamento di un certo numero di enzimi bioenergetici nativi^6,7,8,9,10. Tuttavia, la riuscita dell'implementazione di questi metodi di purificazione per studi sulle proteine bioenergetiche enzimaticamente attive dipende dalla presenza di livelli trascurabili di cazioni metalliche lisciviate dalla matrice della colonna all'eluato. Le cazioni di metalli divalenti comunemente utilizzate nell'IMAC hanno conosciuto significato biologico patologico, anche a basse concentrazioni^11,12. L'effetto fisiologico di questi metalli è più pronunciato nei sistemi bioenergetici, dove possono rivelarsi letali come inibitori della respirazione cellulare o fotosintesi^13,14,15. Problemi simili sono inevitabili per la maggior parte delle classi proteiche in cui i metalli contaminanti residui possono interferire con le funzioni biologiche di una proteina o la caratterizzazione con tecniche biochimiche e biofisiche.

Mentre i livelli di contaminazione dei metalli in condizioni ossidanti e che utilizzano l'imidazolo come eluant sono tipicamente bassi^16,gli isolamenti proteici eseguiti in presenza di agenti di riduzione dei cistein (DTT, Il mercaptoetanolo, ecc.) o con chelatori più forti come la istidina^17,18 o acido etilenediaminetra (EDTA) provocano livelli molto più elevati di contaminazione da metalli^19,20. Analogamente, poiché gli ioni metallici nelle resine IMAC sono spesso coordinati da gruppi carboxilici, è probabile che anche le eluzioni proteiche eseguite in condizioni acide abbiano livelli molto più elevati di contaminazione da metalli. Il contenuto di metalli nelle soluzioni può essere valutato utilizzando la spettroscopia atomica di assorbimento (AAS) e la spettrometria plasma-massa induttivamente accoppiata (ICP-MS) fino a un limite di rilevamento nell'intervallo ppb-ppt^21,22,23,24. Sfortunatamente, AAS e ICP-MS non sono mezzi realistici per il rilevamento in un laboratorio di biochimica tradizionale in quanto tali metodi richiederebbero l'accesso a attrezzature specializzate e formazione.

Precedenti lavori di Brittain^25,26 hanno studiato l'uso di idxynaphthol blu (HNB) come un modo per identificare la presenza di metalli di transizione in soluzione. Tuttavia, vi sono state diverse contraddizioni interne nei dati²⁰ e tali opere non hanno offerto un protocollo adeguato. Gli studi di Temel et al.²⁷ e Ferreira et al.²⁸ hanno ampliato il lavoro di Brittain con HNB come potenziale indicatore metallico. Tuttavia, Temel ha sviluppato un protocollo che utilizza AAS per l'analisi dei campioni, usando HNB solo come agente chelante. Lo studio di Ferreira ha utilizzato il cambiamento degli spettri di assorbimento HNB a 563 nm, una regione degli spettri HNB a tintura libera che si sovrappone fortemente agli spettri dei complessi HNB-metal a pH 5.7, rendendo la sensibilità di analisi abbastanza bassa e con conseguente affinità di legame metallico relativamente debole²⁰. Per affrontare i problemi nel nostro laboratorio con l'lisciviazione Ni 2 o^da IMAC, abbiamo ampliato il lavoro svolto da Brittain^25,26 e Ferreria²⁸ per sviluppare un semplice saggio in grado di rilevare i livelli nanomolari di diversi metalli di transizione. Abbiamo dimostrato che l'HNB lega il nichel e altri metalli iMAC con affinità di legame sub-nanomolari e formano un complesso 1:1 su un'ampia gamma di valori di pH²⁰. Il test riportato qui si basa su questi risultati e utilizza cambiamenti di assorbimento nello spettro HNB a 647 nm per la quantificazione dei metalli. Il saggio può essere eseguito nella gamma fisiologica del pH utilizzando tamponi e strumentazione comuni trovati in un tipico laboratorio di biochimica utilizzando il rilevamento colorimetrico e la quantificazione dei complessi di tintura metallica e il cambiamento associato nell'assorbimento del colorante libero quando si lega al metallo.

Protocollo

1. Preparazione dei componenti di analisi

1. Determinare le frazioni cromatografiche da esaminare utilizzando l'assorbimento ottico a 280 nm o metodi alternativi di quantificazione delle proteine per identificare le frazioni arricchite di proteine.
   NOTA: Per questo lavoro, abbiamo usato uno spettrofotometro UV-Vis array a diodi. Per aumentare la produttività, è possibile utilizzare un lettore di lastre in grado di misurare l'assorbimento UV-Vis.
2. Preparazione dei componenti di ssay necessari
   1. Preparare o ottenere un buffer da 10-100 mM ("Buffer campione") con un pH compreso tra 7 e 12.
      NOTA: buffer biochimici comuni come Tris, HEPES, MOPS e fosfato a pH neutro o di base sono tutti accettabili per il saggio. Tricine and histidine can be used but will require calibration curves as they both substantially chelate metal ions. Un esempio di calibrazione per l'istidina è mostrato nel riferimento²⁰.
   2. Preparare una soluzione di 12% w/v (20 volte concentrata) di dispersione blu idrossiaphthol (HNB) nel buffer campione utilizzando 120 mg di reagente HNB per ogni millilitro di soluzione di stock preparato.
      AVVISO: L'esposizione di HNB all'occhio può causare gravi danni e irritazioni. La protezione degli occhi deve essere utilizzata quando si maneggia l'HNB e le mani devono essere lavate accuratamente dopo la manipolazione.
      NOTA: HNB è venduto come una dispersione su KCl dai principali fornitori di reagenti scientifici. Come tale, la concentrazione effettiva in soluzione varierà da diversi produttori, lotti, e dove in bottiglia viene prelevata la dispersione HNB. Idealmente, dovrebbe essere ottenuta un'assorbimento tra 0,5-0,8 a 647 nm dopo 20 volte la diluizione dello stock.

2. Preparazione e misurazione del campione

1. Preparazione dello spettrofotometro per la raccolta dei dati
   1. Accendere e riscaldare lo spettrofotometro UV-Vis. Impostare lo spettrofotometro per raccogliere i dati a 647 nm.
      NOTA: se lo spettrofotometro lo consente, raccogliere inoltre dati a 850 nm o altre lunghezze d'onda senza modifiche significative relative agli spettri di tintura metallica e colorazione, da utilizzare per una correzione della linea di base.
   2. Svuotare lo spettrofotometro utilizzando il buffer di esempio.
      NOTA: possono essere utilizzati cuvette di plastica monouso o monouso. Le cuvette al quarzo sono preferite per l'analisi quantitativa in quanto consentiranno una maggiore precisione e precisione rispetto alle cuvette di plastica usa e getta. Tuttavia, le cuvette di plastica bloccano la luce UV, che può essere presente nei fasci di misura di alcuni spettrofotometri a matrice di diodiodi. L'esposizione di HNB a un'intensa luce UV provoca una notevole degradazione dei tinture e una riduzione indesiderato di assorbimento lento che può essere confusa con un'associazione metallica lenta (ad esempio, vedere la figura 1 in Informazioni di supporto di riferimento 20).
2. Preparazione e misurazione dell'assorbimento del controllo
   1. Preparare una soluzione di controllo che contenga 50 o più scorte di HNB per millililatore del volume totale del saggio. Per garantire una buona miscelazione di tutti i campioni, pipette i piccoli volumi prima poi aggiungere il buffer di esempio seguito dalla miscelazione da pipettatura. La soluzione HNB diluita deve essere preparata fresco, ma gli stock HNB possono essere immagazzinati a 4 gradi centigradi e schermati dalla luce per settimane senza degrado significativo.
   2. Lasciare il controllo inincubare per un minimo di 3 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Un tempo di incubazione più lungo può essere necessario per i campioni a pH alcalino o in presenza di fosfato a causa della formazione di complessi metallici scarsamente solubili con conseguente equissezione più lenta.
   3. Misurare e registrare l'assorbimento a 647 nm per il campione di controllo.
3. Misurazione di preparazione e assorbimento dei campioni
   1. Preparare i campioni di prova mescolando 50 - L di stock HNB con 950 - L di frazioni proteiche opportunamente diluite con il buffer di campionamento.
      NOTA: Poiché i livelli di contaminazione dei metalli riportati nella letteratura variano di un fattore superiore a 1000 a seconda delle condizioni di elusione^16,20, potrebbe essere necessario provare alcune diluizioni delle frazioni proteiche punette con il buffer campione (vedi passo 1.2.1 sopra) per ottenere cambiamenti di assorbimento all'interno dell'intervallo dinamico del saggio.
      AVVISO: Il nichel e altri metalli utilizzati nell'IMAC sono noti irritanti per la pelle, sospettati di essere cancerogeni, e sono in grado di danneggiare i reni e il sangue dopo un'esposizione prolungata. I guanti e la protezione degli occhi devono essere utilizzati quando si maneggiano campioni proteici preparati con IMAC.
   2. Lasciare il campione incubare per un minimo di 3 min a temperatura ambiente e misurare le assorbimenti a 647 nm.
      NOTA: Il passo limitante del saggio in termini di tempo investito è la fase di incubazione. I dati di questa carta sono stati raccolti utilizzando una singola cuvette di quarzo che è stata accuratamente lavata tra ogni campione. Anche con l'aggiunta del tempo di lavaggio e la preparazione dello stock HNB, la raccolta dei dati per 14 campioni e il controllo ha richiesto circa un'ora e mezza e come tale, il protocollo può essere facilmente completato senza la necessità di interruzioni.
   3. Ripetere i passaggi 2.3.1 e 2.3.2 per ogni frazione che verrà misurata.
      NOTA: Se verranno utilizzate più cuvette per più campioni, i campioni devono essere preparati in modo da consentire tempi di incubazione comparabili e l'esposizione alla luce ambientale.

3. Quantificazione dei metalli

1. Determinazione della concentrazione di metallo in ogni campione
   1. Trova la differenza di ogni assorbimento del campione a 647 nm dal controllo HNB.
   2. Determinare la concentrazione di metalli (in M) utilizzando la formula riportata di seguito:
      
      
      
      dove DF è il fattore di diluizione per la frazione di analisi, lafrazione di analisi₆₄₇ è il cambiamento di assorbimento a 647 nm, 3,65x10^-2 rappresenta il coefficiente di estinzione di HNB (36,5 mM^-1cm^-1 vedi Riferimento²⁰ per maggiori dettagli) e l è il percorso ottico della cuvette in cm.

Risultati

Lo spettro di HNB libero al pH neutro (linea nera) e spettri rappresentativi delle frazioni analizzate per Ni^2, dall'isolamento di MSP1E3D1²⁹ sono mostrati nella Figura 2. Una serie di analisi di successo dovrebbe dimostrare una minore assorbimento a 647 nm rispetto al controllo HNB, che corrisponde alla formazione di complessi HNB in presenza di un metallo di transizione. Un test fallito sarebbe indicato da un aumento dell'assorbimento a 647 nm. In alterna...

Discussione

Il rilevamento colorimetrico dei metalli che utilizzano HNB fornisce un modo semplice per quantificare il grado di contaminazione delle proteine mediante ioni metallici di transizione da resine IMAC. Come abbiamo stabilito in Ref. 20, Ni^{2 si} lega ad HNB con stoichiometria 1:1 e la costante di dissociazione per i cambiamenti complessi Ni-HNB con pH. Tuttavia, il complesso K_d è nell'intervallo sub-nM per tutti i valori di pH raccomandati (7-12). In termini pratici, significa che tutti i Ni^{2 in}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500