Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione

Riepilogo

La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.

Abstract

I gliomi sono tumori cerebrali primari caratterizzati dalla loro invasività e eterogeneità. Modelli istologici specifici come pseudopalisades, proliferazione microvascolare, trasformazione mesenchymic e necrosi caratterizzano l'eterogeneità istologica dei gliomi di alta qualità. Il nostro laboratorio ha dimostrato che la presenza di alte densità di cellule mesenchymal, chiamate oncostream, correla con la malignità tumorale. Abbiamo sviluppato un approccio unico per comprendere i meccanismi alla base della crescita e dell'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo completo che utilizza la microdissezione di cattura laser (LMD) e il sequenziamento dell'RNA per analizzare l'espressione mRNA differenziale delle strutture multicellulari eterogenee intra-tumorali (cioè aree mesenchymal o aree di invasione del tumore). Questo metodo mantiene una buona istologia dei tessuti e l'integrità dell'RNA. Perfusione, congelamento, incorporamento, sezionamento e colorazione sono stati ottimizzati per preservare la morfologia e ottenere campioni di microdissezione laser di alta qualità. I risultati indicano che la perfusione di topi portanti con glioma utilizzando il 30% di saccarosio fornisce una buona morfologia e qualità dell'RNA. Inoltre, colorare le sezioni tumorali con 4% Cresyl viola e 0.5% eosina si traduce in una buona colorazione nucleare e cellulare, pur preservando l'integrità dell'RNA. Il metodo descritto è sensibile e altamente riproducibile e può essere utilizzato per studiare la morfologia tumorale in vari modelli tumorali. In sintesi, descriviamo un metodo completo per eseguire LMD che conserva la morfologia e la qualità dell'RNA per il sequenziamento per studiare le caratteristiche molecolari delle strutture multicellulari eterogenee all'interno dei tumori solidi.

Introduzione

I gliomi sono i tumori primari più aggressivi del sistema nervoso centrale. Sono altamente invasivi ed eterogenei¹. L'analisi dei componenti cellulari e molecolari del tumore rivelerà nuovi bersagli terapeutici.

Tra i diversi metodi attualmente disponibili, la microdissezione di cattura laser (LMD) del tessuto tumorale del cervello congelato è una tecnica affidabile e conveniente che consente l'isolamento di aree anatomiche discrete o specifiche popolazioni cellulari dai tessuti tumorali per studiare il loro profilo molecolare^2,3. LMD consente l'analisi dei profili di espressione genica mRNA di singole cellule selezionate o strutture multicellulari^4,5. LMD può essere utilizzato per acquisire conoscenze meccanicistiche approfondite sugli eventi molecolari che si svolgono durante la progressione del tumore. Il miglioramento nella lavorazione dei tessuti tumorali è necessario per ottenere una risoluzione ottica ottimale della morfologia dei tessuti e della qualità dell'RNA⁶. Anche se la fissazione della paraformaldeide è l'opzione migliore per l'analisi morfologica, la qualità dell'RNA è influenzata e degradata in queste condizioni, con conseguente scarsa qualità dell'RNA per l'analisi RNA-seq. L'uso di sezioni di tessuto congelato evita la formazione di cristalli di ghiaccio, che potrebbero rompere le membrane cellulari e produrre fori all'interno delle cellule, e rimane l'opzione migliore per l'analisi RNA-Seq⁷.

Qui, descriviamo un metodo ottimizzato di fissazione e colorazione delle sezioni per elaborare i tessuti tumorali del cervello del topo congelato per LMD. Per evitare che i cristalli di ghiaccio si formino nel tessuto, abbiamo perfuso i topi con una soluzione di saccarosio del 30%. Questa soluzione interrompe le interazioni tra molecole di acqua polare e impedisce la formazione di cristalli di ghiaccio, preservando la morfologia dei tessuti. La colorazione dei tessuti è necessaria per differenziare e ottenere una popolazione specifica di cellule o aree anatomicamente distinte all'interno del tumore. È essenziale fissare e macchiare il tessuto con coloranti innocui per mantenere l'integrità dell'RNA. È stato precedentemente dimostrato che la colorazione del tessuto con ematossina/eosina (H&E) deteriora l'integrità dell'RNA⁸. Abbiamo fissato e macchiato il tessuto di interesse con etanolo, Cresyl viola 4% e eosin Y 0.5% soluzioni. Cresyl violet è un colorante acidofilo che macchia il nucleo cellulare con un colore blu scuro. Eosin Y è un coloranti basofilo che macchia i componenti di base delle cellule, fornendo una distinzione tra citoplasma e altre strutture cellulari⁸. Entrambi i coloranti sono solubili in etanolo e non deteriorano la qualità dell'RNA. Per evitare danni ai tessuti e mantenere un'elevata risoluzione ottica delle strutture cellulari, abbiamo montato le sezioni di tessuto prima^{dell'LMD 9}.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui che utilizzano animali sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.

NOTA: le neurosfere di Glioma generate da un GEMM o linee stabili possono essere utilizzate per l'innesto del tumore intracranico nei topi¹⁰ e lavorate per il sequenziamento di LMD e RNA. Queste cellule estuono constitutivemente luciferata e proteine GFP, che saranno ulteriormente utilizzate per l'analisi della crescita del tumore e la localizzazione.

1. Generazione di un modello di glioma a topo intracranico da neurosfere derivate da modelli di glioma geneticamente ingegnerizzati

1. Per generare una coltura primaria di cellule della neurosfera da un modello di topo geneticamente ingegnerizzato (GEMM), utilizzare il protocollo descritto in precedenza^10,11.
2. Preparare il mezzo di coltura della neurosfera come descritto: 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 (DMEM/F12) integrato con 10 mL di 50x B-27 e 5 mL di integratori di coltura neuronale 100x N-2, 5 mL di 100x Antibiotic-Antimycotic e 1 mL di Normocin. Prima di placcare le neurosfere, aggiungere 20 ng/mL ricombinante umano EGF e FGF al mezzo di coltura.
3. Neurosfere di glioma di coltura in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂ per 2-3 giorni prima dell'innesto tumorale intracranico.
4. Il giorno dell'intervento, raccogliere le neurosfere del glioma e ruotarle a 550 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
5. Per dissociare le neurosfere, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione di distacco cellulare e incubare a 37 c e 5% di CO₂ per 2-4 min. Dopo il periodo di incubazione, pipette le neurosfere su e giù con una micropipetta da 1 mL per garantire una sospensione a singola cellula.
6. Disattivare la soluzione di distacco delle celle diluindo la sospensione della neurosfera con 10 mL di supporti DMEM/F12 non integrati. Girare le neurosfere a 550 x g per 5 min a temperatura ambiente. Con attenzione, rimuovere il super-natante.
7. Risospendere il pellet cellulare in 100 -L di supporti DMEM/F12 senza integratori. Fare una diluizione 1:50 della sospensione cellulare, quindi aggiungere 50 -L di Trypan Blue per contare le cellule vitali. Utilizzare la seguente formula per determinare la concentrazione delle cellule:
   cells/mL : [((celle contate per quadrato) / numero di quadrati contati) x 50 x 10.000 celle/mL]
8. Dopo aver determinato il numero di cellule, per raggiungere una concentrazione obiettivo di 30.000 cellule/L in volume 100, ruotare le neurosfere verso il basso e rispenderle nel volume appropriato di DMEM/F12 senza supplementi.
9. Posizionare le neurosfere in un tubo pre-etichettato da 0,6 mL sul ghiaccio.
10. Preparare soluzioni di lavoro di anestesia, analgesica, e anestesia prima dell'impianto: per l'anestesia ketamanzia/dexmedetomidine, aggiungere 0,6 mL di 100 mg/mL di idrocloruro di ketamina e 0,8 mL di 0,5 mg/mL di idrocchloride dexmedetomidine a sterile 8,6 mL di 0,9% NaCl contenente vial. Per l'analgesica buprenorfine, aggiungere 1 mL di 0,3 mg/mL di buprenorphine a 9 mL di 0,9% NaCl contenente fiala. Per l'inversione dell'anestesia dell'anestesia atipamezolo, aggiungere 1 mL di atipamezolo 5 mg/mL a 9 mL di 0,9% NaCl contenente fiala.
11. Utilizzare topi femminili C57BL/6J di 6-8 settimane per l'innesto di tumore intracranico.
12. In una stanza omologata per la chirurgia di sopravvivenza dei roditori, impostare forniture sterili per l'innesto di tumore intracranico. Eseguire interventi chirurgici su un telaio stereotassico roditore dotato di una siringa sterilizzata da 10 l Hamilton con un ago 33G rimovibile. Utilizzare uno sterilizzatore di perline per sterilizzare gli strumenti tra gli interventi chirurgici.
13. Anestetizza i topi con una singola iniezione intraperitoneale (i.p.) della soluzione anestetica preparata al passo 1.11 (ketamina:75.0 mg/kg e dexmedetomidine:0.5 mg/kg). Approssimativamente, un volume di 250 l della soluzione anestetico sarà consegnato a un mouse del peso di 20 g. Assicurarsi che il mouse non risponda al riflesso del pedale prima di procedere.
14. Una volta che il topo è in uno stato profondamente anetizzato, applicare lubrificante sterile petrolato oftalmico agli occhi per evitare l'essiccazione. Rasare la pelliccia sul cranio del topo. Applicare 10% povidone-iodio soluzione topica per l'area rasata al fine di disinfettare.
15. Fissare il cranio del mouse in una cornice stereotassica. In primo luogo, aprire con attenzione la bocca con pinze e tirare delicatamente la lingua e spostarlo su un lato della bocca per evitare soffocamento. Tenere la bocca aperta con le pinze e posizionare gli incisivi superiori nel buco della serratura della barra dei denti sul telaio stereotassico.
16. Tenendo la testa del topo per le orecchie, posizionare le barre dell'orecchio contro le ossa postorbitali e fissarle. Assicurarsi che il cranio del mouse sia livellato con il tavolo chirurgico. Fissare le barre dell'orecchio con attenzione senza applicare pressione contro il cranio. Successivamente, fissare con attenzione la barra del naso.
17. Utilizzando una lama bisturi di taglia 15, fare un'incisione lungo la testa del mouse, esponendo il cranio. Ritrarre la pelle nel sito di incisione utilizzando retrattili Colibri. Utilizzare un applicatore sterile per rimuovere tutto il tessuto pericranico.
18. Identificare il bregma e abbassare l'ago della siringa Hamilton direttamente su di esso. Utilizzando il telaio, posizionare l'ago 1 mm anteriore del bregma e 1,5 mm laterale. Utilizzando un ago 26G, segnare questo punto segnando il cranio.
19. Utilizzare un trapano di potenza cordless dotato di una punta di perforazione da 0,45 mm per creare un foro di bava nel sito di destinazione. Forare fino a raggiungere la dura mater sottostante. Estrarre con cura l'osso rimanente nel foro della bava con un ago da 26G.
20. Utilizzando una pipetta, omogeneizzare accuratamente le cellule e disegnare 7 L della sospensione della neurosfera nella siringa. Per assicurarsi che la siringa funzioni correttamente, erogare 1 o più di una sospensione su un cuscinetto ammollato di alcol al 70%.
21. Abbassare l'ago alla superficie della dura mater. Abbassare la siringa 3,5 mm ventrale e ritrarre 0,5 mm. Questo creerà uno spazio di 0,5 mm nel cervello per le neurosfere da depositare quando iniettato.
22. Lasciare l'ago in posizione per 2 min per l'equilibratione. Lentamente e senza intoppi fornire 1 L l delle cellule nel corso di 1 min.
23. Utilizzando soluzione salina sterile, lavare la superficie del cranio tre volte. Distribuisci le cellule in eccesso nella siringa su un tampinno allievio del 70% e pulisci l'ago con un altro tamponitta alcool del 70%. Sciacquare la siringa con PBS sterile per evitare intasamenti dell'ago.
24. Rimuovere i retrattori e prendere con attenzione il mouse fuori dal telaio stereotassico. Chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon 3-0, pinze e un driver ad ago.
25. Amministrare l'atomezolo (1,0 mg/kg), circa 100 -L per un topo da 20 g. Somministrare buprenorfine (0,1 mg/kg sottocutaneo) sottocutaneamente, circa 70 l per un topo da 20 g. Mettere i topi post-chirurgici in una gabbia di recupero pulita e monitorarli fino a quando non sono all'erta e attivi.

2. Perfusione animale e conservazione del cervello

1. Per monitorare la progressione del tumore, determinare la bioluminescenza in vivo utilizzando un sistema di imaging in vivo fino a quando gli animali mostrano segni di carico tumorale. Eutanasia i topi quando raggiungono un segnale compreso tra 10⁶ a 10⁷ fotone/s.
2. Anestesizza i topi che mostrano segni di carico tumorale con iniezione intraperitoneale (i.p.) di ketamina (75,0mg/kg) e dexmedetomidine (0,5 mg/kg). Consegnare circa 250 l a un topo del peso di 20 g. Quindi, assicurarsi che il mouse non risponda al riflesso del pedale.
3. Usando le pinze, tenere la pelle sopra la cavità peritoneale, e utilizzando un grande paio di forbici di scremazione fare un'incisione "Y" penetrando la parete peritoneale, forare il diaframma, e poi tagliare la gabbia toracica.
4. Inserire una cannula da 20G smussata nel ventricolo sinistro del cuore del mouse. Quindi snip l'atrio destro del cuore per consentire l'essanguinazione.
5. Consentire alla soluzione di Tyrode ossigenato (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl₂, 0,005% NaH₂PO₄, 0,1% glucosio, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) di fluire attraverso il sistema circolatorio del topo fino a quando il fegato e i polmoni non si sono completamente eliminati a causa della rimozione del sangue (5min).
6. Continuare a perfondere l'animale con una soluzione di saccarosio del 30% disciolta nella soluzione di Tyrode per ulteriori 15 min. Per valutare il successo della perfusione, confermare che il collo, la coda e le gambe sono rigide post 30% circolazione di saccarosio.
7. Utilizzando un piccolo paio di forbici dissezione, tagliare il cuoio capelluto alla linea mediana. Partendo dall'osso occipitale e lavorando in avanti verso il muso. Questo esporrà il cranio.
8. Utilizzando un paio di rongeurs, sfondare il cranio a partire dall'osso occipitale e continuare in avanti per esporre totalmente le superfici del cervello. Quindi girare il lato della testa verso l'alto e sezionare i nervi alla base del cervello per rilasciarlo dal cranio.
9. Preparare una soluzione di saccarosio al 30% con acqua libera da RNase e filtrarla attraverso un filtro a rete di nylon da 40 m per ridurre la degradazione dell'RNA.
10. Per massimizzare l'infiltrazione della soluzione di saccarosio, posizionare i cervelli sezionati in una soluzione di saccarosio del 30% e conservarli a 4 gradi durante la notte. Prima di un'ulteriore elaborazione assicurarsi che il cervello raggiunga il fondo dei tubi contenenti la soluzione di saccarosio.

3. Crioconservazione del cervello che ospita tumori del glioma

1. Prima di crioconservare il cervello, preparare un barattolo pieno di freddo èopentane/2-methylbutane e mettere il vaso in un contenitore pieno di azoto liquido. Lasciare raffreddare il solvente.
2. Togliere il cervello dalla soluzione di saccarosio 30% e asciugarlo su una carta da filtro.
3. Etichettare il criomuff con un pennarello permanente. Con attenzione, aggiungere circa 5 mL di OCT (composto di temperatura di taglio ottimale) al centro del criomuffare bolle d'aria.
4. Posizionare il cervello in criomuffare contenente OCT nell'orientamento desiderato. Riempire lo stampo con OCT fino a quando il cervello è completamente immerso. Utilizzando pinze pulite, posizionare rapidamente il criostampo con OCT e il cervello nel freddo èopentane/2-metilbutane.
5. Una volta che il OCT si solidifica (30-40 s), rimuovere il criostampo con il cervello e metterlo nel ghiaccio secco. Non lasciare lo stampo contenente il cervello in 2-metilbutane oltre 2 min in quanto ciò può causare crepe nel solido OCT. Avvolgere il criomuff con il cervello in un foglio di alluminio e conservarlo a -80 gradi centigradi.

4. Sezionamento dei tessuti tumorali cerebrali congelati

1. Etichetta 2 diapositive di naftalato di polietilene m (PEN) con le informazioni di esempio. Le sezioni tissutali saranno posizionate direttamente su queste diapositive seguendo la sezionamento.
2. Impostare la temperatura della camera criostatica compresa tra -20 e -24 gradi centigradi. Prima di sezionare, posizionare il blocco campione nella camera criostat e lasciare che ecchesca alla temperatura nella camera per 30-60 min.
3. Pulire la camera criostatista e il portacoltelli con 100% etanolo e spruzzare le spazzole da utilizzare con la soluzione di pulizia RNase. Lavorando all'interno della camera criostatta, rimuovere lo stampo e collegare il blocco dello STRUMENTO di personalizzazione di Office contenente il cervello al disco del campione criostato con l'OCT. Posizionare il blocco nel supporto del disco e allineare il blocco con la lama del coltello.
4. Installare una lama usa e getta nel supporto di sezionamento.
5. Sezionare il cervello a 10 m di spessore. Assicurarsi che non ci siano striature o linee di graffio nel tessuto. Utilizzando un pennello, appiattire con cautela e sbarrare il tessuto sulla superficie di taglio.
6. Montare con attenzione il tessuto contenente le sezioni cerebrali su vetrini di vetro PEN liberi rNase. Capovolgere i vetrini di vetro caricati positivi con le dita in direzione del tessuto e premere agevolmente il vetro scivolare verso il basso verso la sezione del tessuto.
   NOTA: La temperatura delle mani aiuterà il tessuto ad attaccarsi al vetro.
7. Dopo aver montato le sezioni cerebrali sui vetrini, tenere i vetrini in una scatola all'interno della camera criostatta e poi conservarli a -80 gradi centigradi. Non tenere mai gli scivoli a temperatura ambiente.
   NOTA: Piegatura del tessuto e lacerazione sono comuni. Per un'accurata analisi posteriore, è importante ridurre al minimo questi artefatti.

5. Fissazione e colorazione delle sezioni del tessuto cerebrale crioconservato

1. Per preservare l'integrità dell'RNA, pulire tutti gli strumenti da utilizzare con la soluzione di pulizia RNase. Procedere con il protocollo di fissaggio e colorazione all'interno di un cofano di fumi.
2. Preparare le soluzioni fissative descritte in tubi RNase free 50 mL puliti. Rendi tutte le soluzioni con RNase acqua libera il giorno della colorazione.
3. Stesso giorno verrà eseguita la microdissezione laser, preparare soluzioni 100%, 95%, 70% e 50% etanolo. Conservare le soluzioni in tubi ben chiusi a temperatura ambiente.
4. Preparare il 4% di Violet Cresyl e lo 0,5% eosin Y nella soluzione 75% di etanolo. Vorticare vigorosamente la soluzione per 1 min e filtrarli attraverso un filtro di nylon 0,45 m per eliminare tracce di polvere non disciolta.
5. Mettere i vetrini di tessuto in un contenitore con 95% etanolo per 30 s. Trasferire i vetrini al tubo contenente 75% etanolo; lasciare diapositive lì per 30 s.
6. Trasferire le diapositive al 50% di etanolo e lasciarli lì per 25 s. A questo punto, lo Strumento di personalizzazione di Office verrà sciolto. Trasferire la soluzione di scorrimento al 4% Cresyl violetto per 20 s, quindi trasferire a 0.5% eosin Y soluzione per 5 s.
7. Togliere il vetrino dalla soluzione di tintura e asciugare il vetrino con una carta da filtro. Quindi, inserire i vetrini nel 50% di etanolo per 25 s. Trasferire le diapositive al 75% di etanolo per 25 s. Trasferire le diapositive al 95% di etanolo per 30 s. Trasferire i vetrini al 100% etanolo per 60 s.
8. Sciacquare lo scivolo con lo xilene. Trasferirli in un contenitore con xilene e attendere 3 min.
9. Preparare il supporto di montaggio (ad esempio, la gomma Pinpoint) in acqua priva di RNase. Per montare le sezioni del cervello del topo, diluire il supporto di montaggio in acqua senza RNase con un rapporto di 1:10.
10. Asciugare i vetrini su una superficie senza RNase a temperatura ambiente per 10 s. Prima che lo xilene si sciolda, procedere al montaggio dei vetrini con le sezioni del tessuto.
11. Disperdere delicatamente la soluzione di montaggio sopra il tessuto sullo scivolo con un pennello sottile sterile e senza RNase. Attendere 10-20 s, quindi trasferire immediatamente i vetrini del tessuto alla piattaforma di microscopia al microscopio.
    NOTA: Il rapporto tra il supporto di montaggio e l'acqua senza RNase utilizzata per il montaggio varia a seconda del tessuto di interesse. Il rapporto medio/acqua di montaggio mantiene la morfologia del tessuto glioma per la microdisezione laser senza influire sull'integrità dell'RNA.

6. Microdissezione di cattura laser

NOTA: Un microscopio a microdissezione di cattura laser deve essere utilizzato per microdissect laser specifiche aree di interesse all'interno del tessuto tumorale. Per ridurre al minimo il tempo necessario per la microdissezione laser tissutale, preparare il microscopio LMD prima della fissazione e della colorazione.

1. Per avviare il sistema, accendere prima la striscia di alimentazione, seguita dall'accensione del laser. Quindi, accendere il controller del microscopio e il computer. Avviare il software LMD.
2. In Controllo microscopioselezionare l'ingrandimento 10volte. In Controllo laser, impostare i parametri laser per la dissezione dei tessuti. Impostare una frequenza laser di 120 Hz per ottenere i migliori risultati di taglio. Impostare sempre la corrente laser al 100%.
3. Per una microdissezione laser accurata, impostare la velocità a 10 e un'impostazione di apertura a 2,0-10,0 m. Impostare la potenza su 53. Avere la potenza laser ad un'impostazione superiore può causare l'incisione del vetro.
4. Caricare il collettore di tessuti che catturerà il tessuto dopo la dissezione. Fare clic sul secondo pulsante di scaricamento. Rimuovere il collettore vuoto e posizionare i tubi di testa piana da 0,5 mL PCR liberi da 0,5 mL contenenti 30 - L di tampone di lisi nel collettore. Posizionare nuovamente il raccoglitore nella macchina e fare clic su Continua sul software per procedere.
5. Caricare il campione lavorato (fisso e macchiato) al microscopio. Innanzitutto, fare clic su Scarica sul software LMD. Successivamente, montare il campione sul supporto scorrevole e posizionarlo sullo stage. Fare clic su Continua sul software per procedere.
6. In Finestre Taglia forme, selezionare Disegna e Taglia. Utilizzare i controlli del microscopio per trovare l'area di interesse. Disegnare la regione di interesse (ROI) e selezionare un tubo di raccolta di destinazione. È possibile disegnare più ROI per micro sezionare diverse aree da una singola diapositiva allo stesso tempo.
7. Fare clic su Avvia taglio per procedere alla micro dissezione dei tessuti. Dopo aver sezionato le aree di interesse rimuovere i tubi di raccolta dal supporto e posizionare i tubi sul ghiaccio secco. Trasferire i campioni di tessuto di RNA raccolti a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.

7. Isolamento dell'RNA del tessuto glioma micro-sezionato

1. Per l'estrazione di RNA da LMD utilizzare un kit di isolamento RNA ottimizzato per piccoli campioni e bassa resa dell'RNA (vedere Tabella dei materiali). Seguire le istruzioni di fabbricazione. Eseguire tutte le fasi di isolamento a temperatura ambiente (25 gradi centigradi). Per mantenere la qualità dell'RNA, lavorare rapidamente. Preparare tutte le soluzioni come indicato dal produttore.
2. Regolare il volume del campione a 350 gradi con il buffer di lisi con 1% di mercaptoetanolo. Vorticare il campione per 40 s al fine di ridurre la viscosità del campione e aumentare l'efficienza della colonna di spin di eluizione dell'RNA.
3. Trasferire l'intero campione in una colonna di spin dell'eliminatore gDNA collocata in un tubo di raccolta da 2 mL. Centrifugare il tubo per 30 s a 8.000 x g. Salvare il flow-through e assicurarsi che nessun liquido è lasciato sulla colonna dopo la centrifugazione.
4. Aggiungere al flusso attraverso il flusso e mescolare bene pipettando su e giù. Trasferire il campione in una colonna di spin di eluizione dell'RNA collocata in un tubo di raccolta da 2 mL. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 15 s a 8.000 x g. Eliminare il flow-through, salvando la colonna.
5. Aggiungete 700 l di buffer di lavaggio dell'RNA 1 (20% di etanolo, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) alla colonna di spin di elizione dell'RNA. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 15 s a 8.000 x g per lavare la membrana della colonna di spin. Eliminare il flusso attraverso.
6. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione la colonna di spin di eluizione dell'RNA dal tubo di raccolta in modo che la colonna non contatti il flusso attraverso.
7. Aggiungere 500 l del secondo buffer di lavaggio dell'RNA (etanolo 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5) alla colonna di spin. Chiudere il coperchio della colonna e girare 8.000 x g per 20 s per lavare la membrana della colonna. Eliminare il flusso attraverso.
8. Per lavare la colonna di eluizione dell'RNA, aggiungere 500 lun dell'80% di etanolo, chiudere il coperchio della colonna e centrifugare a 8000 x g per 2 min. Gettare i tubi con la soluzione di eluizione.
9. Utilizzare un nuovo tubo di raccolta, aprire il coperchio della colonna di spin e centrifugare a 8000 x g per 5 min per asciugare la colonna. Eliminare il tubo di eguagliazione.
10. Posizionare la colonna di spin di eluzione dell'RNA in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL. Aggiungete 12 gradi di acqua libera da RNase riscaldata a 37 gradi centigradi direttamente al centro della membrana della colonna di spin. Attendere 4 min e centrifugare per 1 min a piena velocità per eluire l'RNA.

8. Controllo della qualità dell'RNA, preparazione della libreria e analisi RNA-Seq

1. Dopo l'estrazione e la purificazione dell'RNA, amplificare l'RNA e creare una libreria cDNA utilizzando un kit speciale adatto per l'isolamento dell'RNA alle concentrazioni pico-molare seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Seguire le istruzioni del produttore. Pulire la postazione di lavoro per evitare la contaminazione con altri prodotti PCR e la degradazione nucleata dei campioni.
2. Se l'RNA ha un valore RIN maggiore di 4, il che significa che l'RNA è di buona qualità o solo parzialmente degradato, procedere con la fase di frammentazione. Preparare tutti gli elementi sul ghiaccio.
3. Create una combinazione principale come indicato (Tabella 1). Creare una miscela di reazione in un tubo PCR senza nuclesi. Incubare i tubi a 94 gradi centigradi in un ciclore termico a caldo. Il tempo di incubazione della frammentazione dipende dalla qualità dell'RNA. RIN 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
4. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi su un rack di refrigeratori PCR che è stato precedentemente raffreddato a -20 gradi centigradi e lasciarlo seduto per 2 min.
5. Per ogni campione di tubo di RNA, preparare il primo mix master di reazione di sintesi del filamento (Tabella 2). Incubare i tubi in un ciclore termico a caldo a condizioni descritte nella tabella 3. I prodotti cDNA possono essere congelati a -20 gradi centigradi fino a due settimane prima di procedere al passo successivo.
6. Create la combinazione principale PCR come indicato nella tabella 4. Posizionare i tubi in un riciclatore termico del coperchio caldo ed eseguire la reazione PCR nelle impostazioni indicate nella tabella 5.
7. Lasciare che le perline, che verranno utilizzate per purificare il DNA, si scaldino a temperatura ambiente. Una volta riscaldato, aggiungere 40 l delle perline ad ogni campione. Vorticare i tubi per mescolare e girare verso il basso brevemente per raccogliere il liquido sul fondo del tubo. Lasciare che i tubi incubano a temperatura ambiente per 8 min per consentire al DNA di legarsi alle perline.
8. Posizionare i tubi su un dispositivo di separazione magnetica e lasciare in sedile per circa 5 min, o fino a quando la soluzione diventa completamente chiara. Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante con attenzione senza disturbare le perline.
9. Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, aggiungere 200 l di etanolo appena fatto 80% alle perline da lavare senza disturbare le perline. Attendere 30 s prima di rimuovere l'80% di etanolo. Ripetere questo passaggio.
10. Ruotare brevemente i tubi e riposizionare i tubi sul dispositivo di separazione. Rimuovere qualsiasi etanolo residuo dell'80% senza disturbare le perline.
11. Lasciare asciugare l'aria dei tubi con i tappi aperti per 5 min. Non lasciate stare più a lungo come le perline saranno su asciutto.
12. Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, aggiungere 52 l'acqua senza nuclesino per coprire le perline. Rimuovere i tubi dal dispositivo di separazione e pipetta su e giù fino a quando tutte le perline sono risospese. Incubare a 5 min a temperatura ambiente.
13. Riposizionare i tubi sul dispositivo di separazione fino a quando la soluzione non diventa chiara, circa 1 min. Trasferire 50 gradi l del supernatale risultante ai pozzi di una striscia di 8 pozze. Aggiungere 40 -L di nuove perline ad ogni campione. Vortice accuratamente per mescolare. Lasciare che le perline si leghino al DNA incubando a temperatura ambiente per 8 min.
14. Durante questo periodo di incubazione, iniziare a scongelare i componenti da utilizzare per qualsiasi rRNA presente nei campioni. Una volta scongelati, metteteli sul ghiaccio. Inoltre, preriscaldare un ciclore termico a 72 gradi centigradi.
15. Posizionare i campioni sul dispositivo di separazione magnetica fino a quando la soluzione non si schiarisce (circa 5 min). Aliquota 1,5 l di sonde per campione a un tubo PCR refrigerato. Collocare il tubo nel ciclore termico preriscaldato sotto le impostazioni di 72 gradi centigradi per 2 e 4 gradi centigradi.
16. Mantenendo i tubi campione nel dispositivo di separazione magnetica, rimuovere il supernatante con un pipet senza disturbare le perline. Quindi aggiungere 200 l di etanolo appena fatto 80% alle perline per lavare senza disturbare le perline. Attendere 30 s prima di rimuovere l'80% di etanolo. Ripetere questo passaggio.
17. Ruotare brevemente i tubi e riposizionare i tubi sul dispositivo di separazione. Rimuovere qualsiasi etanolo residuo dell'80% senza disturbare le perline. Lasciare asciugare l'aria dei tubi con i tappi aperti per 2 min. Non lasciatevi sarescire più a lungo come le perline saranno su asciutto.
18. Preparare la combinazione principale per tutti i campioni combinando i seguenti componenti nell'ordine indicato(Tabella 6).
19. Mescolare il master colmo vortice ndolo e aggiungere 22 l del mix alle perline essiccate di ogni campione e mescolare accuratamente per risospendere. Lasciare incubare a temperatura ambiente per 5 min.
20. Ruotare i tubi e posizionarli sul dispositivo di separazione magnetica per 1 minuto o fino a quando i campioni diventano chiari. Trasferire 20 l del supernatante, senza disturbare le perline su nuovi tubi PCR. Posizionare i tubi in un riscaldatore termico preriscaldato sotto le impostazioni della tabella 7.
21. Preparare un master mix PCR per un numero sufficiente di reazioni per ogni campione. Aggiungere i seguenti componenti alla combinazione principale nella tabella 8indicata. Aggiungete 80 l della miscela master PCR a ciascuno dei tubi campione dal punto 8.20 e posizionatelo nel termotermico alle seguenti impostazioni (Tabella 9).
22. Consentire alle perline, che verranno utilizzate per purificare il DNA, riscaldare a temperatura ambiente. Una volta riscaldato, aggiungere 100 l di perline ad ogni campione. Lasciare che i tubi incubano a temperatura ambiente per 8 min per consentire al DNA di legarsi alle perline.
23. Posizionare i tubi su un dispositivo di separazione magnetica e lasciare in sedile per circa 5 min, o fino a quando la soluzione diventa completamente chiara.
24. Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante con attenzione senza disturbare le perline.
25. Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, aggiungere 200 l di etanolo appena fatto 80% alle perline da lavare senza disturbare le perline. Attendere 30 s prima di rimuovere l'80% di etanolo. Ripetere questo passaggio.
26. In breve, ruotare verso il basso i tubi e posizionare i tubi sul dispositivo di separazione. Rimuovere qualsiasi etanolo residuo dell'80% senza disturbare le perline.
27. Lasciare asciugare l'aria dei tubi con i tappi aperti per 5 min. Non lasciatevi sarescire più a lungo come le perline si asciugano troppo. Pipette 20 L di Tris Buffer al pellet essiccato. Rimuovere il tubo dal dispositivo di separazione e mescolare accuratamente con un pipet per risospendere le perline. Lasciare incubare a temperatura ambiente per 5 min.
28. Posizionare i tubi sul dispositivo di separazione per 2 min, o fino a quando la soluzione diventa chiara. Acquisire il supernatante e trasferirlo in nuovi tubi. Quindi conservare la soluzione raccolta a -20 gradi centigradi.
29. Controllare le librerie finali necessarie per il controllo della qualità e della quantità. Raggruppare i campioni, raggruppati e sequenza, come ad accoppiamento-end 50 nt letture, secondo i protocolli consigliati dal produttore.

Risultati

Il nostro laboratorio ha generato un modello murino geneticamente ingegnerizzato (GEMM) utilizzando il sistema di trasposasi di bellezza del sonno (Figura 1A). Questo sistema incorpora specifiche alterazioni genetiche nel genoma delle cellule progenitrici neurali nei topi neotopatici. Queste cellule progenitrici alterate formano tumori glioma endogeni. Le sequenze di plasmide utilizzate per generare i tumori erano: (1) pT2C-LucPGK-SB100X per ...

Discussione

Comprendere i meccanismi molecolari alla base dell'eterogeneità e dell'invasione del glioma è di fondamentale importanza per scoprire nuovi obiettivi terapeutici¹³. In questo manoscritto, descriviamo un metodo dettagliato e ottimizzato per analizzare il paesaggio molecolare dell'eterogeneità e dell'invasione del glioma usando la microdissezione di cattura laser (LMD) seguita dall'analisi trascrittomica.

La microdissezione di cattura laser (LMD) può essere utilizzata...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR Tubes	Sigma Aldrich	CLS6530
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Gibco	11330057
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
Laser Microdissection (LMD) System	Leica	LMD7000
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent	Invivogen	ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm)	Lieca	1150518
Pinpoint Solution	Zymo Research	D3001-1
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B-1MG
Research Cryostat	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian	Takara Bio	634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571