Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano

Riepilogo

Il protocollo presentato descrive un metodo per un saggio di escrescenza neurite e la valutazione della neurotossicità di piccoli composti molecolari.

Abstract

Neurite analisi di escrescenza e la valutazione della neurotossicità sono due studi principali che possono essere eseguiti utilizzando il metodo presentato qui. Questo protocollo fornisce un'analisi affidabile della morfologia neuronale insieme alle misurazioni quantitative delle modifiche sulla lunghezza dei neuriti e sulla localizzazione delle proteine sinaptiche e sull'abbondanza al trattamento con piccoli composti molecolari. Oltre all'applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità può essere eseguita per valutare, distinguere e classificare i composti chimici commerciali in base al loro potenziale effetto di neurotossicità dello sviluppo.

Anche se le linee cellulari sono oggi ampiamente utilizzate nei saggi di screening composto nelle neuroscienze, spesso differiscono geneticamente e fenotipicamente dalla loro origine tissutale. Le cellule primarie, d'altra parte, mantengono importanti marcatori e funzioni osservate in vivo. Pertanto, a causa del potenziale di traduzione e rilevanza fisiologica che queste cellule potrebbero offrire analisi di crescita neurite e la valutazione della neurotossicità possono notevolmente beneficiare dell'utilizzo di cellule progenitrici neurali umane (hNPC) come modello cellulare umano primario.

Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre la crescita di neurite e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana."

Introduzione

La crescita di Neurite è un processo fondamentale per la formazione della rete neuronale e la rigenerazione del nervo^1,2. A seguito di un infortunio, la crescita dei neuriti svolge un ruolo chiave nella rigenerazione del sistema nervoso. L'escrescenza di Neurite è anche un elemento importante della segnalazione extracellulare nell'indurre attività rigenerative neuronali per migliorare i risultati per disturbi neurodegenerativi e lesioni neuronali^3,4,5,6.

Mantenendo il loro potenziale di differenziazione nella produzione di vari lignaggi neurali, le cellule progenitrici neurali umane (hNMC) potrebbero fornire un sistema modello per gli studi sulla funzione del sistema nervoso centrale (CNS) e sullo sviluppo^7,8,9. L'elevato potenziale traslazionale e la rilevanza fisiologica degli hNMC come modello primario di cellule umane offrono un notevole vantaggio negli screening di scoperti di farmaci legati alla crescita neurite. Tuttavia, la manutenzione e il ridimensionamento dei modelli cellulari primari per i test ad alto consumo potrebbero richiedere molto tempo e molta mano doperante^10,11,12,13.

Oltre all'applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità è un'altra applicazione che utilizza i neuroni derivati dall'hNPC. Ci sono migliaia di composti chimici commerciali che non vengono esaminati o con un potenziale di neurotossicità poco compreso. Pertanto, esperimenti di screening più affidabili ed efficaci per valutare, distinguere e classificare i composti in base al loro potenziale di provocare neurotossicità dello sviluppo è molto richiesto¹⁴. L'aumento della prevalenza e dell'incidenza di disturbi neurologici insieme all'abbondanza di composti non testati nell'ambiente richiede lo sviluppo di esperimenti più affidabili ed efficienti per identificare composti ambientali pericolosi che possono rappresentare la neurotossicità¹⁵.

Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre neurite ecrescita e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana.

Protocollo

Dichiarazione etica: Gli esemplari fetali sono stati ricevuti dal Birth Defects Research Laboratory dell'Università di Washington a Seattle attraverso un programma di distribuzione dei tessuti sostenuto dal National Institute of Health (NIH). Il Birth Defects Research Laboratory ha ottenuto un adeguato consenso informato scritto dai genitori e l'approvvigionamento dei tessuti è stato monitorato dall'Institutional Review Board dell'Università di Washington. Tutto il lavoro è stato svolto con l'approvazione dell'Ufficio di Ricerca Sulla Materia Umana dell'Università di Miami⁸.

1. Isolamento e coltura di cellule progenitrici neurali umane (hNPC)

1. Mettere il tessuto cerebrale in una parabola Petri da 100 mm e rimuovere con attenzione le meningi con la pinze.
2. Trasferire il tessuto cerebrale in un tubo conico da 50 mL e lavarlo due volte con 20 mL di PBS invertendo delicatamente il tubo.
3. Incubare il tessuto cerebrale in un nuovo tubo conico da 50 mL immergendo il tessuto nella soluzione di dissociazione cellulare (cfr. tabella dei materiali)e DNase I (10 U/mL) per 10 min a 37 .
4. Aggiungere 5 mL di mezzo di coltura cellulare neuronale (vedi Tabella dei materiali)al tessuto cerebrale contenente tubo e dissociare meccanicamente le neurosfere triturando da 20 a 30 volte attraverso una punta di pipet da 1000 per effettuare una sospensione a singola cellula.
5. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare di 70 m per rimuovere i cluster di cellule.
6. Semina la sospensione a cella singola in un flacone T-25 ventilato dotato di 5-10 mL di coltura cellulare neuronale medio integrato con componenti descritti nella tabella 1.
   1. Sterilizzare la soluzione di eparina filtrando attraverso un filtro di 0,2 m. Il supplemento B-27 senza vitamina A è un integratore senza siero per la coltivazione di progenitori neurali e cellule staminali, senza indurre differenziazione.
      NOTA: le cellule progenitrici neurali umane (hNMC) sono isolate dal cervello fetale umano raccolto dal feto abortito. Dopo 7-10 giorni di coltura, le cellule staminali neurali (NSC) formano colonie di neurosfera fluttuanti, mentre altri tipi di cellule rimangono in sospensione come singole cellule o si attaccano al fondo del pallone. Gli hNMC isolati possono essere coltivati come neurosfere in sospensione per diversi mesi^8,16,17.

Quantità	Componente
100 ll	EGF (20 ng/mL)
100 ll	FGF (10 ng/mL)
2 mL	B-27, Meno vitamina A (50X)
1 mL	L-alanyl-L-glutamine (100X) (vedi tabella dei materiali)
4 ll	Eparina (2 g/mL)
96,8 mL	Mezzo di coltura cellulare neuronale (vedi tabella dei materiali)

Tabella 1. Componenti necessari per la produzione di 100 mL di supporti di coltura

2. Passare gli hNPC

1. Raccogliere i supporti contenenti le sfere galleggianti, neurosfere grandi e piccole, e trasferirli in un tubo conico da 50 mL.
   NOTA: A causa di motivi sconosciuti, i tempi per la divisione delle neurosfere sono variabili da 7 a 30 giorni. Tuttavia, in generale, le neurosfere devono essere passaggiate quando raggiungono un diametro maggiore di 700-900 m. Questo è quando il centro della neurosfera inizia a scurirsi, che è considerato come un segno di un alto tasso di morte cellulare¹⁸.
2. Ruotare le neurosfere verso il basso per centrifugazione a 300-400 x g per 3 min.
3. Aspirare con attenzione il superatatore e poi immergere le sfere in 500 -L di reagente di dissociazione delle cellule scongelate (vedi Tabella dei materiali).
   1. Rendere le aliquote del reagente di dissociazione cellulare aggiungendo 500 l per 1,5 mL di microtubi e conservare a -20 gradi centigradi. Per evitare di perdere l'attività enzimatica, scongelare il reagente di dissociazione cellulare tenendo a RT o caldo per 5 min in un bagno di acqua / perline 37 C.
4. A seconda della densità e delle dimensioni delle sfere, incubare le sfere sommerse a 37 gradi centigradi per 5-15 min.
5. Aggiungere 5-10 mL di mezzi di coltura preriscaldati alle neurosfere contenenti 50 mL di tubi conici e centrifugare a 300-400 x g per 5 min per sedimentare le neurosfere.
6. Aspirare il superatante e delicatamente pipetta su e giù, utilizzando una pipetta 1000 L, in 2 mL di mezzi di coltura fino a quando tutte le neurosfere sono in una sospensione a cella singola.
   NOTA: La dissociazione diventerà visibile ad occhio nudo. Prima della dissociazione, le neurosfere sono sotto forma di sfere. Dopo l'immersione nella dissociazione reagente e pipettando su e giù, diventeranno singole cellule.
   1. Contare le cellule e piastrare le singole cellule, da 2 a 3 milioni di cellule per T-25 fiaschetta in 10 mL di mezzi di coltura.
7. Alimenta le cellule ogni 3 giorni sostituendo metà dei mezzi di coltura.
   1. Risolvi le neurosfere appoggiando il pallone in modo che sia sul suo angolo inferiore. Tenere il pallone in posizione per circa 1-2 min fino a quando le neurosfere sedimentano. Poi aspirare metà dei media delicatamente inserendo la pipetta sierologica nei media sopra le neurosfere stabilite. Le cellule dissociate possono aggregarsi per formare sfere dopo 2 o 3 giorni in coltura¹⁹.

3. Congelamento degli hNPC

1. Preparare il mezzo di congelamento delle cellule aggiungendo DMSO ai supporti di coltura a una concentrazione finale del 10% (v/v) o utilizzare il mezzo di crioconservazione disponibile in commercio per i tipi di cellule sensibili (vedere Tabella dei materiali).
2. Ordinare grandi sfere trasferendo i media in un tubo conico 50 mL e lasciando che le sfere si stabilizzano per gravità. Quindi rimuovere e trasferire le grandi neurosfere in un nuovo tubo conico da 50 mL per passare utilizzando una punta di pipet da 200 o 1000 l.
   NOTA: Le neurosfere con un diametro superiore a 900 m sono considerate grandi e quelle con un diametro inferiore a 500 m sono considerate piccole.
3. Ruotare le neurosfere rimanenti verso il basso per centrifugazione a 300-400 x g per 3 min. Rimuovere con attenzione il supernatante.
4. Risospendere fino a 100 sfere in 1 mL di reagente crioconservazione e trasferirlo in un criotubo.
5. Conservare durante la notte a -80 gradi centigradi in un contenitore di congelamento delle cellule (vedere Tabella dei materiali)e spostarlo in azoto liquido il giorno successivo per lo stoccaggio a lungo termine.
   NOTA: È preferibile congelare le neurosfere di piccole e medie dimensioni (di un diametro inferiore a 900 m) ed evitare di congelare le neurosfere di grandi dimensioni (più di 900 m di diametro) o singole cellule. Al fine di ridurre i danni alle cellule durante lo scongelamento del campione, mantenere le cellule dense seminando le neurosfere scongelate in una piccola fiaschetta T25.

4. Differenziazione e trattamento degli hNPC

NOTA: Per indurre la differenziazione, le neurosfere vengono disaggregate in singole cellule, conteggiate e poi semiate su piastre rivestite per 5 giorni. Quindi le cellule differenziate vengono trattate per 24 h con composti di prova prima dell'immunostaining e della quantificazione della fluorescenza.

1. Rivestimento
   1. Aggiungere 200 l di poli-L-lisina (PLL) per pozzo di 4 bicchieri da camera (140 -L per vetrini a 8 camere).
   2. Incubare per 1 h a temperatura ambiente (RT).
   3. Lavare 3x con PBS.
   4. Lasciare asciugare a RT (per circa 30 min).
   5. Aggiungete 150 l di laminina (50 g/mL) per pozzetti di 4 pozzetti in vetro (120 l per pozzetti da camera a 8 pozzetti).
   6. Incubare per 2 h a 37 .
   7. Lavare 3x con PBS.
      NOTA: I vetrini a camera rivestita possono essere conservati a 4 gradi centigradi per 1 mese.
2. Placcatura delle cellule
   1. Contare e placcare 80.000 neurosfere a cellule singole (neurosfere in una sospensione a cella singola) per pozzo di vetrini a 4 camere (70.000 cellule per pozzo di scivolo camera 8-well).
   2. Aggiungere 500 l di supporti di differenziazione per pozzo di 4 camere (250 -L media per pozzo di 8-well diapositive camera).
      1. Per rendere prima il supporto di differenziazione, aggiungere i seguenti componenti nella Tabella 2 a un contenitore sterile e usa e getta per rendere il supporto di induzione neurale (NIM).
      2. Aggiungere i seguenti ingredienti nella tabella 3 a 48,5 mL di NIM realizzati nel passaggio precedente per realizzare i supporti di differenziazione.
   3. Incubare per 5 giorni a 37 gradi centigradi.
   4. Dopo 5 giorni, trattare le cellule per 24 h sostituendo metà dei supporti in ogni pozzo con supporti freschi mescolati con la concentrazione desiderata di composti di prova, compresi i controlli appropriati.

Quantità	Componente
49 mL	DMEM/F-12
0,5 mL	Supplemento N2 (100X)
0,5 mL	MEM aminoacidi non essenziali (100X)
2 ll	Eparin (2 g/mL) (Stock Conc. è 50 mg/mL)

Tabella 2. Componenti necessari per fare 50 mL di NIM

Quantità	Componente
1 mL	B-27 (50X)
500 lL	Antibiotico-antimicotico (100X)
5 ll	Acido retinoico (0,1 m)
50 ll	GDNF (10 g/mL)
50 ll	BDNF (10 g/mL)
5 ll	L'acido ascorbico (0,2 g/mL) (Stock Conc. è 2 mg/mL) NOTA: Consigliato per essere fatto fresco.
48,5 mL	Nim

Tabella 3. Componenti necessari per la creazione di 50 mL di supporti di differenziazione

5. Immunocitochimica (ICC)

NOTA: Le cellule sono fissate con il 4% di formaldeide. La permeabilizzazione e il blocco vengono quindi eseguiti per migliorare la penetrazione e prevenire il legame non specifico degli anticorpi. Le cellule vengono poi incubate con anticorpi primari durante la notte. Successivamente, le cellule vengono incubate con anticorpi secondari etichettati fluorescentmente. Infine, dopo aver usato DAPI per macchiare il nucleo, vengono montati scivoli da camera.

1. Fissazione
   1. Aspirare delicatamente i supporti in ogni pozzo.
   2. Aggiungere 500 l di 4% di formaldeide per vetrini a 4 pozzetti (250 -L per pozzetti a camera 8-well).
   3. Incubare per 15 min a RT.
   4. Lavare delicatamente 2x con 500 gradi l di PBS.
      NOTA: Dopo la fissazione, lasciando 1 mL di PBS in ogni pozzo, i vetrini di coltura possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
2. Permeabilizzazione e blocco delle cellule
   1. Aggiungere i seguenti componenti nella tabella 4 a un contenitore sterile e usa e getta per creare il buffer anticorpo (Ab).
   2. Mescolare i seguenti ingredienti nella tabella 5 con il buffer Ab realizzato nel passaggio precedente per rendere la soluzione di blocco e permeabilizzazione cellulare.
   3. Aggiungere 500 l per pozzetti di 4 camere da camera e incubare per 1 h a RT.
      NOTA: Il buffer Ab può essere memorizzato a 4 gradi centigradi.

Quantità	Componente
1,75 g	NaCl (150 mM)
1,2 g	TrisBase (50 mM)
2 g	BSA 1%
3,6 g	L-lisina (100 mM)
8 g	Azide di sodio (4%)
200 mL	Acqua distillata. NOTA: Sciogliere inizialmente i componenti necessari in 150 mL di acqua, quindi regolare a 200 mL.

Tabella 4. Componenti necessari per la produzione di 200 mL di buffer anticorpo

Quantità	Componente
600 ll	20% Siero di capra
6 ll	0,2% Triton-X100
2394 L L	Buffer anticorpo. NOTA: inizialmente sciogliere i componenti necessari in 2 mL di ab buffer, quindi regolare al pH 7.4. Quindi aggiungere più Ab buffer per regolare al volume finale di 3 mL e filtro sterilizzare.

Tabella 5. Componenti necessari per la realizzazione di 3 mL di permeabilizzazione cellulare e soluzione di blocco

3. Colorazione
   1. Lavare 2x con 500 gradi l di PBS.
   2. Aggiungete l'anticorpo primario diluito, l'anti-tubulina III (1:200) e incubate peruna durante la notte a 4 gradi centigradi (200 gradi l per pozzetti a 4 camere). Diluire l'anticorpo primario in PBS.
   3. Lavare 2x con PBS.
   4. Aggiungere il diluito, in PBS, anticorpo secondario con etichetta fluorescente, Alexa Fluor 488 (1:500), e incubare per 2 h a RT in un luogo protetto dalla luce (250 l per vetrini a 4 camere)
   5. Lavare 2x con PBS.
   6. Aggiungere il diluito, in PBS, DAPI (concentrazione 300 nM) e incubare per 5 min a RT in un luogo protetto dalla luce (300 -L per pozzo di 4-bene diapositive camera).
   7. Lavare 3x con PBS.
   8. Montare le diapositive della camera seguendo le istruzioni riportate di seguito.
      1. Smontare lo scivolo della camera rompendo le linguette di rottura e rimuovendo la guarnizione e la base.
      2. Aggiungere una goccia della soluzione di montaggio (vedere Tabella dei materiali) per pozzo di 4 camere vetrini. Quindi utilizzare una diapositiva di copertura per coprire l'intera diapositiva.
      3. Utilizzando una pinzetta e ad un angolo, posizionare un lato del coperchio scivolare contro il vetrino mentre si entra in contatto con il bordo esterno della goccia di liquido.
      4. Puntare con attenzione il coperchio sulla soluzione di montaggio quando lo si abbassa in posizione. Evitare la creazione di bolle. Prendi una punta di pipetta e premila sul coperchio del coperchio. Le bolle si sposteranno di lato.
         NOTA: La formazione di bolle è inevitabile a volte. Se si verifica, l'immagine intorno a loro fino a quando ci sono alcuni.
      5. Seguire le indicazioni del produttore per il tempo di stagionatura. Evitare di utilizzare soluzioni di montaggio non curing a causa della difficoltà di manipolazione durante l'imaging. In caso contrario, è necessario utilizzare un sigillante coverslip appropriato sui bordi per evitare che il coperchio scivoli durante l'imaging.
      6. Per sigillare la coverslip, utilizzare lo smalto e fare una piccola linea sul bordo della cover slip. Lasciare asciugare lo smalto per circa 2 min.

6. Acquisizione di immagini, escrescenza neurite e quantificazione dell'intensità della fluorescenza

NOTA: Dopo la colorazione, utilizzare un microscopio confocale con un obiettivo 20x e una dimensione dell'immagine di 1024 x 1024 pixel per acquisire le immagini delle cellule trattate. Prendere immagine almeno da due campi per replica biologica per condizione. Quindi utilizzare il software di analisi delle immagini Fiji (ImageJ 1.51u) per la quantificazione della lunghezza neurite. In breve, misurare la lunghezza della neurite più lunga per ogni neurone e dopo aver in media i valori per trattamento, utilizzare il test di sstudente per i gruppi indipendenti per confrontare i mezzi tra gruppi sperimentali e gruppo di controllo.

NOTA: sono disponibili diversi programmi di elaborazione delle immagini commerciali (Imaris, Volocity, Amira) e open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME). Tra questi programmi, ImageJ è diventato lo strumento di scelta per l'analisi biologica delle immagini^20,,21. Il portale ImageJ presso https://imagej.net/Introduction è un'utile fonte di informazioni che fornisce una descrizione approfondita delle funzioni di base e predefinite di ImageJ, tra cui l'elaborazione delle immagini, la colocalizzazione, la deconvoluzione, la registrazione, la segmentazione, il monitoraggio e la visualizzazione.

1. Misurazione della crescita neuronale con il software di analisi delle immagini Fiji
   1. Come illustrato nella Figura 1, aprire l'immagine trascinandola e rilasciandola sul software Fiji o selezionando File Aperto.
   2. Selezionare Analizza . Proprietà Tools (Strumenti) Gestione ROI, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'icona 5^nella barra degli strumenti Straight e passare alla linea a mano libera. Facoltativamente, fare doppio clic sulla stessa icona per modificare lo spessore della linea in 10, quindi tracciare il neurite più lungo, iniziando vicino al corpo della cella e estendendosi fino alla punta del neurite.
   3. Premere Ctrl e T e quindi F per aggiungere la misura a Gestione ROI ed evidenziare il neurone misurato. Selezionare tutti i numeri nel ROI, fare clic su Misura, selezionare tutte le lunghezze calcolate e copiare/incollare in un foglio di calcolo.
2. Misurazione dell'intensità di fluorescenza delle cellule etichettate con il software di analisi delle immagini Fiji
   1. Come illustrato nella Figura 2, dopo aver aperto l'immagine, fare clic sull'icona 4^th nella barra degli strumenti Selezioni a mano libera. Disegnare la forma della cella.
   2. Selezionare Analizza . Impostare Misure e selezionare per i seguenti valori: Area, Densità integrata, Valore grigio medio . Proprietà Analyze . Misura (si apre una finestra pop-up con una pila di valori).
   3. Selezionare un'area accanto alla cella come sfondo (la dimensione non è importante) e quindi selezionare Analizza . Misurare. Selezionare tutti i dati misurati e copiare/incollare in un foglio di calcolo.
      NOTA: Densità integrata (IntDen) è l'elemento utilizzato per determinare le intensità fluorescenti. In questo studio viene misurata l'intensità fluorescente della molecola bersaglio per analizzare inizialmente la sua distribuzione nella cellula e successivamente quantificare l'abbondanza della molecola bersaglio in vari trattamenti. Di conseguenza, l'efficacia dei trattamenti sarà misurata e confrontata con il controllo.

7. Valutazione della neurotossicità

NOTA: la citotossicità dei composti di prova viene valutata in piastre a 384 pozze (vedere Tabella dei materiali)utilizzando un saggio di fattibilità delle cellule luminescenti (vedere Tabella dei materiali). Gli hNMC sono preparati seguendo lo stesso metodo, ad eccezione di lievi modifiche, descritte nella sezione "Differenziazione e trattamento degli hNMC". Successivamente, viene misurato un segnale luminescente generato dal saggio di fattibilità delle cellule luminescenti utilizzando un lettore di microplacia. Il segnale luminescente è proporzionale alla concentrazione cellulare di ATP che a sua volta è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali presenti in ogni pozzo.

1. Rivestimento
   1. Aggiungete 30 l di poli-L-lisina (PLL) per pozzo di 384 pozzetti.
   2. Incubare per 1 h a RT.
   3. Lavare 2x con PBS.
   4. Lasciare asciugare a RT (per circa 30 min).
   5. Aggiungere 30 l di laminina (50 g/mL) per pozzo di 384 pozzetti.
   6. Incubare per 2 h a 37 .
   7. Lavare 2x con PBS.
      NOTA: Le piastre rivestite di 384 pozze possono essere conservate a 4 gradi centigradi per 1 mese.
2. Placcatura delle cellule
   1. Contare e placcare 20.000 neurosfere a cella singola per pozzo di 384 pozzetti in 25 - L di supporti di differenziazione.
   2. Incubare per 5 giorni a 37 gradi centigradi.
   3. Dopo 5 giorni, trattare le cellule per 24 h con composti di prova preparati a 6 volte la concentrazione desiderata finale in volume di 5 gradi (per rendere il volume finale di 30 gradi per pozzo).
3. Saggio di fattibilità cellulare
   1. Aggiungete 30 -L di raddicere per saldatura di 384 pozzetti.
      NOTA: Aggiungere un volume di reagente di saggio di fattibilità cellulare luminescente uguale al volume presente in ogni pozzo. Scongelare la vitalità cellulare luminescente saggio reagente ed equilibrate a RT prima dell'uso.
   2. Agitare su uno shaker piastra per 2 minuti (per mescolare e indurre lisi cellulare).
   3. Ruotare la miscela verso il basso per centrifugazione a 300-400 x g per 30 s.
   4. Incubare la piastra da 384 pozzetto per 10 min in un luogo protetto dalla luce (per stabilizzare il segnale luminescente).
   5. Registrare la luminescenza con un lettore di microplacino.
      NOTA: Utilizzare i controlli appropriati per il saggio di fattibilità, tra cui Velcade (a una concentrazione finale di 10 m) come positivo e HBSS contenente DMSO (con concentrazione finale dello 0,1% o 0,2%) come controllo negativo.

Risultati

Il protocollo presentato nel manoscritto è stato utilizzato con successo in due articoli pubblicati di recente^22,23. La figura 3 mostra l'uso di neuroni derivati da hNPC nell'esaminare l'effetto degli inibitori HDAC come composti epigenetici sull'estensione dei neuriti come marcatore per la escrescenza dei neuriti e la successiva capacità neurogenica dei composti molecolari di piccole dimensioni.

Inoltre...

Discussione

Questo protocollo è uno dei pochi articoli pubblicati che descrivono il test per la lunghezza della neurite al trattamento con composti di prova. Inoltre, descriviamo come utilizzare gli hNPC per un saggio di escrescenza di neurite e una valutazione della neurotossicità. Utilizzando questa valutazione di analisi e neurotossicità della neurite e della neurotossicità sui neuroni derivati dagli hNFC, il potenziale neurogenico di una categoria di composti epigenetici di piccole molecole, inibitori HDAC, nell'indurre la c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well Glass Chamber Slides	Sigma	PEZGS0816
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 594	Invitrogen	R37117
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Anti-β-Tubulin III	Thermo	MA1-118X
B27	Thermo	17504001
B27 - minus vitamin A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI	Thermo	D1306
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
Formaldehyde	Thermo	FB002
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum	Thermo	50062Z
Heparin	Calbiochem	375095
Laminin	Sigma	L2020-1MG
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-25G
L-lysine	Sigma	L5501
MEM non-essential amino acids	Gibco	11140050
mFreSR	StemCell Technologies	5854	Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2	Gibco	17502048
NaCl	Sigma	71376
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
Poly-L-lysine	Sigma	P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Sodium Azide	Sigma	S2002
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin	Thermo	MA5-14532
Tris Base	Sigma	10708976001
Triton X-100	Sigma	X100-100ML