Differenziazione dei monociti in macrofagi fenotipicamente distinti dopo il trattamento con esosomi derivati dalle cellule staminali del sangue del cordone ombelicale umano (CB-SC)

Riepilogo

L'applicazione esosoma è uno strumento emergente per lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa. Stabiliamo un protocollo di isolamento esosoma ad alta purezza per isolare gli esosomi dalle nuove cellule staminali identificate chiamate CB-SC per studi meccanicistici. Cocoliamo anche esosomi derivati dal CB-SC con monociti umani, portando alla loro differenziazione in macrofagi fenotipicamente distinti.

Abstract

La terapia con educatore di cellule staminali (SCE) è un nuovo approccio clinico per il trattamento del diabete di tipo 1 e di altre malattie autoimmuni. La terapia SCE fa circolare le cellule mononucleari del sangue del paziente isolato (ad esempio linfociti e monociti) attraverso una macchina di aferesi, co-coltura le cellule mononucleari del sangue del paziente con cellule staminali derivate dal sangue del cordone ombelicale aderenti (CB-SC) nel dispositivo SCE, quindi restituisce queste cellule immunitarie "istruite" al sangue del paziente. Gli esosomi sono vescicole extracellulari di dimensioni nanometriche tra 30\u2012150 nm esistenti in tutti i mezzi di coltura biofluida e cellulare. Per esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari alla base della terapia SCE e determinare le azioni degli esosomi rilasciati da CB-SC, studiamo quali cellule fagocitizzano questi esosomi durante il trattamento con CB-SC. Co-coltivando esosomi derivati dal CB-SC con cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC), abbiamo scoperto che gli esosomi derivati dal CB-SC sono stati prevalentemente ripresi da monociti positivi al CD14 umano, portando alla differenziazione dei monociti nei macrofagi di tipo 2 (M2), con morfologia simile al mandrino ed espressione dei marcatori molecolari superficiali associati all'M2. Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione degli esosomi derivati da CB-SC e il protocollo per la co-coltura di esosomi derivati da CB-SC con monociti umani e il monitoraggio della differenziazione M2.

Introduzione

Le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (CB-SC) sono un tipo unico di cellule staminali identificate dal sangue del cordone ombelicale umano e si distinguono da altri tipi noti di cellule staminali come le cellule staminali mesenchimali (MSC) e le cellule staminali ematopoietiche (HSC)¹. Sulla base delle loro proprietà uniche di modulazione immunitaria e della loro capacità di aderire strettamente alla superficie delle piastre di Petri, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia designata come terapia di educatore delle cellule staminali (SCE) negli studi^{clinici 2,3}. Durante la terapia SCE, le cellule mononucleari del sangue periferico di un paziente (PBMC) vengono raccolte e circolate attraverso un separatore cellulare e co-coltivate con CB-SC aderente in vitro. Queste cellule "istruite" (PBMC trattato con CB-SC) vengono quindi restituite alla circolazione del paziente in un sistema a circuito chiuso. Studi clinici hanno già dimostrato la sicurezza clinica e l'efficacia della terapia SCE per il trattamento di malattie autoimmuni tra cui diabete di tipo 1 (T1D)^2,4 e alopecia areata (AA)⁵.

Gli esosomi sono una famiglia di nanoparticelle con diametri che vanno da 30\u2012150 nm ed esistono in tutti i mezzi di coltura biofluida e^{cellulare 6}. Gli esosomi sono arricchiti con molte molecole bioattive tra cui lipidi, mRNA, proteine e microRNA (miRNA) e svolgono un ruolo importante nelle comunicazioni da cellula a cellula. Negli ultimi tempi, gli esosomi sono diventati più attraenti per i ricercatori e le aziende farmaceutiche a causa delle loro potenzialità terapeutiche nelle^{cliniche 7,8,9}. Recentemente, i nostri studi meccanicistici hanno dimostrato che gli esosomi rilasciati da CB-SC contribuiscono alla modulazione immunitaria della terapia SCE¹⁰.

Qui descriviamo il protocollo per esplorare il meccanismo della terapia SCE che prende di mira i monociti da esosomi rilasciati da CB-SC. In primo luogo, gli esosomi rilasciati dal CB-SC sono stati isolati dai supporti condizionati derivati da CB-SC utilizzando metodi di ultracentrifugazione e convalidati dalla citometria del flusso, dalla western blot (WB) e dalla diffusione dinamica della luce (DLS). In secondo luogo, gli esosomi derivati dal CB-SC sono stati etichettati con un colorante lipofilo fluorescente verde: Dio. In terzo luogo, sono stati co-coltivati con PBMC per esaminare le percentuali positive di esosomi derivati da CB-SC con etichetta Dio alle diverse sottopopolazioni di PBMC per citometria a flusso. Questo protocollo fornisce indicazioni per studiare l'azione degli esosomi alla base della modulazione immunitaria delle cellule staminali.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana presso Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Le unità di sangue del mantello buffy umano sono state acquistate dal New York Blood Center (New York, NY). Le unità di sangue del cordone ombelicale umano sono state raccolte da donatori sani e acquistate dalla banca del sangue Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Sia il New York Blood Center che Cryo-Cell hanno ricevuto tutti gli accreditamenti per le raccolte e le distribuzioni di sangue, con l'approvazione dell'IRB e i moduli di consenso firmati dai donatori.

1. Coltura cellulare e preparazione del mezzo condizionato derivato da CB-SC

1. Trasferire 25 ml di sangue del cordone ombelicale(tabella dei materiali)su 20 ml di mezzo gradiente di densità (γ = 1,077) in un tubo conico da 50 ml.
2. Centrifuga a 1.690 x g per 20 min a 20 °C in un rotore a benna oscillante senza freno.
3. Trasferire con cura lo strato di cellule mononucleari (strato di buffy) in un nuovo tubo conico da 50 ml. Riempire il tubo conico con soluzione salina tamponata dal fosfato (PBS) a 40 mL. Mescolare e centrifugare a celle a pellet a 751 x g per 10 min a 20 °C.
4. Scartare il supernatante e aggiungere 15 mL di tampone di lisi ACK (Tabella dei materiali) al pellet cellulare. Sospendere di nuovo le celle tramite pipettazione. Quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Questo passaggio rimuove i globuli rossi.
5. Riempire il tubo conico con 25 ml di PBS. Centrifuga a 751 x g per 5 min e scarta il supernatante per ottenere cellule mononucleari a pellet.
6. Lavare 2x con 40 mL di PBS per rimuovere il buffer di lysis rimanente.
7. Centrifuga a 751 x g per 5 minuti per pellettizzare le cellule.
8. Scartare le cellule mononucleari del sangue del cordone ombelicale supernatanti e ri-sospendere con 10 ml di mezzo privo di siero definito chimicamente (tabella deimateriali)per tubo.
9. Unire le cellule mononucleari del sangue del cordone ombelicale a un unico tubo.
10. Prendere 20 μL di sospensione cellulare e mescolare con 20 μL di soluzione blu trypan 0,4%(tabella dei materiali)in un tubo da 1,5 ml.
11. Caricare nello scivolo della camera e quantificare il numero di cella e la vitalità della cella con un contatore di celle automatizzato.
    NOTA: La sospensione cellulare viene diluita a 1:10 se la concentrazione cellulare è superiore a 1 x 10⁷ celle/mL.
12. Semina cellule mononucleari in 150 mm x 15 mm Piastre di Petri a 1 x 10⁶ cellule/mL, 25 mL/piatto in mezzo di coltura cellulare privo di siero definito chimicamente.
13. Incubare a 37 °C in condizioni di CO_{2 dell'8%} per 10\u201214 giorni fino a quando CB-SC raggiunge più dell'80% di confluenza.
14. Scartare il supernatante e lavare con 15 mL di PBS per piastra di Petri; quindi, rimuovere il PBS.
    NOTA: CB-SC è attaccato saldamente alle piastre di Petri.
15. Ripetere il passaggio 1.14 due volte.
16. Aggiungere 25 mL di mezzo privo di siero definito chimicamente per piastra di Petri.
17. Incubare a 37 °C in condizioni di CO_{2 dell'8%} per 3\u20124 giorni.
18. Raccogliere il mezzo condizionato derivato da CB-SC in tubi conici da 50 ml.

2. Caratterizzazione di CB-SC

1. Staccare CB-SC tubazionando 10 mL di tampone di dissociazione cellulare a base di PBS su e giù con una punta della pipetta da 5 mL(Tabella dei materiali).
2. Centrifugare a 1.690 x g per 5 min per le celle a pellet e sospendere di nuovo in 200 μL di PBS.
3. Fissare e permeabilizzare le cellule per la colorazione intracellulare tramite kit di preparazione della colorazione(Tabella dei materiali).
4. Aggiungere 5 μL di fc blocker(Tabella dei materiali)per campione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Il bloccante Fc inibisce il legame non specifico quando si macchia con gli anticorpi.
5. Aggiungere anticorpi monoclonali anti-umano del topo coniugati a fluorescenza tra cui CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 e Galectina 9 a 25 μg/mL(Tabella dei materiali)a 100 μL volume di cellule. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con protezione dalla luce.
6. Dopo la colorazione, lavare le celle con 1 mL di PBS e centrifugare a 751 x g per 10 min per le celle a pellet.
7. Sospendere di nuovo le celle con 200 μL di PBS e trasferirsi in un tubo da 5 ml.
8. Eseguire la citometria del flusso per convalidare l'espressione dei marcatori specifici associati a CB-SC sopra.

3. Isolamento degli esosomi derivati dal CB-SC

1. Centrifugare il mezzo condizionato raccolto dal passo 1.18 a 300 x g per 10 min a 4 °C. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo conico da 50 ml.
2. Centrifugare il supernatante raccolto dal passo 3.1 a 2.000 x g per 20 min a 4 °C. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo conico da 50 ml.
3. Centrifugare il supernatante raccolto dal passo 3.2 a 10.000 x g per 30 min a 4 °C. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo conico da 50 ml.
   NOTA: Il rotore ad angolo fisso viene utilizzato in modo che i pellet cellulari siano precipitati sul lato del tubo. Contrassegnare il lato del cappuccio e disegnare un cerchio sul lato del tubo in cui è previsto il pellet.
4. Supernaganti filtranti raccolti dal passo 3.3 con un filtro da 0,22 μm(Tabella dei materiali).
5. Trasferire 15 mL di supporti in ogni unità filtrante centrifuga da 10 kDa(Tabella dei materiali).
6. Centrifuga a 4.000 x g per 30 min per isolare i mezzi esosomi concentrati.
7. Trasferire gli esosomi concentrati in un tubo ultracentrifugo. Quindi, il pellet esosomi a 100.000 x g per 80 min a 4 °C.
8. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo gli esosomi del pellet in 10 mL di PBS.
9. Centrifuga a 100.000 x g per 80 min a 4 °C per raccogliere il pellet di esosomi.
10. Sospendere di nuovo il pellet di esosomi in 200 μL di PBS tubazioni su e giù.

4. Caratterizzazione di esosomi derivati da CB-SC

1. Quantificazione della concentrazione proteica totale della preparazione esosoma mediante kit di dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA)
   1. Pipetta 10 μL di ogni campione di albumina standard e isolato esosoma isolato preparato nel passaggio 3.10 in una piastra da 96 porci in duplicato.
   2. Aggiungere 200 μL del reagente di lavoro dal kit BCA ad ogni pozzo. Mescolare accuratamente il contenuto della piastra sullo shaker della piastra per 10 s.
      NOTA: Reagente di lavoro (WR): reagente a 50 parti A con reagente in 1 parte B.
   3. Coprire le piastre con un foglio e incubarle a 37 °C per 30 minuti.
   4. Raffreddare le piastre a temperatura ambiente (RT).
   5. Misurare l'assorbanza del campione a 562 nm tramite un lettore di piastre.
2. Preparazione e colorazione di esosomi per citometria a flusso
   1. Catturare gli esosomi aggiungendo 20 μL di perline magnetiche CD63 anti-umane (dimensioni 4,5 μm)(tabella dei materiali)in 25 μg di esosomi derivati dal CB-SC preparati nella fase 3.10 in totale 100 μL volume di PBS.
   2. Incubare il tubo durante la notte (18\u201222 h) a 4 °C sullo shaker a 800 giri/min.
   3. Centrifugare il tubo a 300 x g per 30 s per raccogliere il campione nella parte inferiore del tubo.
   4. Aggiungere 300 μL di tampone di isolamento (0,1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS) e mescolare delicatamente mediante pipettazione.
      NOTA: Questo passaggio lava gli esosomi legati alle perline.
   5. Posizionare il tubo su un supporto magnetico per 1 minuto (Tavolo dei materiali) e scartare il supernatante.
   6. Ripetere i passaggi 4.2.4\u20124.2.5.
   7. Sospendere di nuovo gli esosomi legati al tallone con 400 μL di tampone di isolamento.
   8. Aliquota 100 μL di esosomi legati al tallone ad ogni tubo.
   9. Aggiungere anticorpi coniugati a fluorescenza (CD9-FITC, CD81-PE e CD63-FITC rispettivamente a 25 μg/mL) a ciascun tubo di flusso con esosomi catturati con perline CD63.
      NOTA: gli IgG abbinati all'isotipo fungono da controlli negativi.
   10. Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente con protezione dalla luce sullo shaker a 800 giri/min.
   11. Ripetere i passaggi 4.2.4\u20124.2.5.
   12. Sospendere di nuovo gli esosomi legati al tallone in 200 μL di tampone di isolamento e trasferirli a tubi di flusso da 5 ml.
   13. Posizionare i tubi nel carosello campione del citometro a flusso.
   14. Aprire il protocollo per i test esosomi.
   15. Eseguire automaticamente il campione in base al citometro di flusso.
3. Rilevamento esosoma da parte della macchia occidentale
   NOTA: Western blot è un metodo consolidato e non andremo nei dettagli del metodo stesso.
   1. Lisciviare i pellet di esosomi derivati da CB-SC dal passo 3.10 con 100 μL di tampone RIPA, pipetta 20x, quindi mettere sul ghiaccio per 5 min.
   2. Quantificare la concentrazione proteica di glisato esosoma con il kit BCA e caricare 25 μg di proteine per pozzo.
   3. Separare le proteine per elettroforesi gel per 40 min a 150 V.
   4. Trasferire la proteina alla membrana in fluoruro di polivinilidene (PVDF) utilizzando il metodo di trasferimento semi-secco¹¹.
   5. Bloccare la membrana con il 5% di latte non grasso per 30 minuti.
   6. Incubare con 2 μg/mL anti-umano Alix(Table of Materials)e 1 μg/mL anticorpi anti-umani calnexina(Tabella dei materiali).
   7. Rileva la proteina mediante chemiluminescenza con un sistema di imaging digitale.
4. Convalida esosoma mediante diffusione dinamica della luce (DLS)
   1. Diluire 10 μg di campioni esosomi derivati da CB-SC in 1 mL di PBS.
   2. Trasferire gli 1 mL del campione diluito in cuvette semi-micro usa e getta (Tabella dei materiali).
   3. Posizionare la cuvetta nello strumento DLS. Impostare l'indice di rifrazione (RI) su 1,39 per tutto il monitor campione.
   4. Eseguire campioni a 25 °C e acquisire tre misurazioni per frazione per ottenere una distribuzione media delle dimensioni.
5. Convalida esosoma mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
   1. Cappotto formvar su 300 griglie di rame mesh¹² (Tabella dei materiali).
   2. Rafforzare la formvar con lo strato aggiuntivo di carbonio evaporato sulle griglie di rame¹².
      NOTA: Un tale approccio di rivestimento è eccellente per il supporto del campione.
   3. Caricare 10 μL di campioni esosomi sulle griglie e lasciare asciugare all'aria.
   4. Macchie negative di campioni con acetato di uranile per 5 min.
   5. Lavare tre volte con acqua DI e lasciare asciugare all'aria.
   6. Osservare e fotografare i campioni sotto TEM. Impostare la tensione di accelerazione a 200 kV e la dimensione dello spot a 2.

5. Misurare gli esosomi derivati dal CB-SC con etichetta Dio utilizzati da diverse sottopopolazioni di PBMC

1. Etichetta Esosomi derivati da CB-SC con colorante lipofilo fluorescente verde Dio
   1. Trasferire 100 μg di esosomi derivati dal CB-SC (preparati nella fase 3.10) in un tubo di centrifuga da 15 ml.
   2. Diluire il campione con PBS a 5 mL.
   3. Aggiungere il colorante lipofilo fluorescente verde Dio(Table of Materials) finoa quando la concentrazione di lavoro raggiunge i 5 μM.
   4. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce.
   5. Trasferire il campione in un tubo ultracentrifugo.
   6. Centrifuga a 100.000 x g per 80 min a pellet Esosomi derivati da CB-SC con etichetta Dio.
   7. Sospendere di nuovo gli esosomi etichettati in 200 μL di PBS.
2. Preparazione del PBMC umano
   1. Trasferire 25 ml di strato di buffy umana(Tabella dei materiali)oltre 20 ml di mezzo gradiente di densità (γ = 1,077) in un tubo conico da 50 ml.
   2. Ripetere i passaggi da 1.2 a 1.11.
   3. Trasferire 1 x 10⁶ PBMC in una piastra idrofobica a 24 porsi non trattata con tessuti (1 mL/pozzo).
      NOTA: Una piastra non trattata con tessuti è stata utilizzata per evitare l'adesione di monociti.
3. Esosomi co-culturali con etichetta Dio con PBMC
   1. Trasferire 40 μL Esosomi derivati da CB-SC con etichetta Dio preparati al passaggio 5.1.7 a ciascun pozzo contenente PBMC in una piastra da 24 pozza utilizzando una pipetta da 200 μL. Aggiungere lo stesso volume di PBS per controllare i pozzi.
   2. Mescolare pipettando 10x. Incubare per 4 ore.
   3. Raccogliere PBMC trattato con esosoma da 200 μL ed etichettare con Hoechst 33342 per 10 minuti a temperatura ambiente.
   4. Centrifuga a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 100 μL di PBS.
   5. Montare le celle su vetrini al microscopio.
   6. Osservare e fotografare l'interazione di esosomi derivati da CB-SC con PBMC con etichetta Hoechst 33342 utilizzando un microscopio.
   7. Trasferire le celle rimanenti dal passo 5.3.3 in un tubo da 1,5 ml.
   8. Centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 °C. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 200 μL di PBS.
   9. Aggiungere 5 μL di blocco Fc per campione. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   10. Aggiungere anticorpi (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 e CD56 a 25 μg/mL) (Table of Materials) per macchiare PBMC.
       NOTA: gli IgG abbinati all'isotipo fungono da controlli negativi.
   11. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con protezione dalla luce.
   12. Aggiungere 1 mL di PBS e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C per pellettizzare le cellule.
   13. Sospendere di nuovo le cellule con PBS da 200 μL. Aggiungere 5 μL di ioduro di propidio.
   14. Utilizzare la citometria del flusso per valutare il livello di assorbimento esosoma con etichetta Dio in diverse sottopopolazioni di PBMC.

6. Esaminare l'azione degli esosomi derivati dal CB-SC sui monociti

1. Isolamento monociti positivi al CD14 umano
   1. Trasferire 3 x 10⁷ PBMC umano in un tubo da 15 ml.
   2. Centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 °C.
   3. Posizionare la colonna diseparazione ( Tabella dei materiali) nel separatore di magneti ( Tabella deimateriali).
   4. Lavare le colonne di separazione tre volte con 2 mL di tampone di funzionamento a freddo(Tabella dei materiali).
   5. Sospendere di nuovo le cellule in 300 μL di PBS freddo. Aggiungere 60 μL di microperline CD14. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
   6. Aggiungere 6 mL di PBS freddo. Centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 °C.
   7. Sospendere di nuovo le celle a pellet in 500 μL di tampone di funzionamento a freddo.
   8. Trasferire le celle nella colonna di separazione (preparata nel passaggio 6.14) e lasciarle passare.
   9. Lavare la colonna di separazione tre volte con 2 mL di tampone di corsa per lavaggio. Sollevare la colonna dal separatore del magnete e posizionarla in un tubo di centrifuga da 15 ml.
      NOTA: Il tubo da 15 ml deve essere posizionato sul ghiaccio a causa dell'aderenza dei monociti positivi al CD14 al tubo a temperatura ambiente.
   10. Trasferire 2 ml di tampone di funzionamento a freddo nella parte superiore della colonna e isolare le celle positive cd14 nel tubo da 15 ml.
   11. Centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 °C per pellettizzare le cellule positive cd14.
   12. Sospendere di nuovo le cellule con 2 mL di mezzo privo di siero definito chimicamente freddo(Tabella dei materiali).
   13. Trasferire 50 μL di cellule in un tubo da 1,5 ml.
   14. Macchia con 10 μL di CD14 mAb anti-umano coniugato con krome arancione(Tavolo dei materiali)per 20 min.
       NOTA: gli IgG abbinati all'isotipo fungono da controlli negativi.
   15. Aggiungere 1 PBS mL alle celle. Centrifuga a 300 x g per 10 min a celle a pellet.
   16. Sospendere di nuovo le celle in 200 μL di PBS e trasferirla in un tubo da 5 ml. Determinare la purezza dei monociti positivi al CD14 in base alla citometria del flusso.
2. Trattamento di monociti con esosomi derivati da CB-SC
   1. Semi 1 x 10⁶ monociti purificati con mezzo di coltura privo di siero definito chimicamente(Tabella dei materiali)in lamiera a 6 pozzi trattata con coltura tissutale (2 mL/pozzo).
   2. Incubare per 2 ore a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
   3. Scartare il supernatante con pipetta da 1 mL. Aggiungere delicatamente 2 mL di 37 °C di mezzo di coltura senza siero definito chimicamente pre-riscaldato(Tabelladei materiali).
      NOTA: I monociti sono stati aderenti alla piastra entro 2 ore. Le cellule galleggianti sono state identificate come contaminazioni morte o di altre cellule.
   4. Aggiungere esosomi derivati da CB-SC da 80 μg isolati dal passo 3.10 alle colture di monociti in una piastra da 6 pomeri e con un volume totale di 2 mL.
      NOTA: Lo stesso volume di PBS è stato aggiunto ai pozzi di controllo.
   5. Incubare a 37 °C sotto il 5% di CO₂ per 3\u20124 giorni.
   6. Fotografare la morfologia cellulare utilizzando un microscopio invertito al 200× ingrandimento(Tabella dei materiali).
   7. Staccare le celle tubazioni su e giù in 1 mL di un buffer di dissociazione cellulare a base pbs con punta di pipetta da 1 mL.
   8. Raccogliere le restanti cellule attaccate tramite un raschietto cellulare.
      NOTA: Poiché i monociti primari o i macrofagi differenziati si attaccano strettamente, alcune cellule rimangono aderenti al fondo dopo il trattamento con tampone di dissociazione. Pertanto, queste cellule vengono raccolte con un raschietto cellulare.
   9. Raccogliere celle a 1.690 x g per 5 min. Sospendere di nuovo le cellule in 200 μL di PBS.
   10. Aggiungere 5 μL di blocco Fc (25 μg/mL) per bloccare l'associazione non specifica.
   11. Aggiungere anticorpi (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209 a 25 μg/mL, Table of Materials) alle cellule. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
       NOTA: gli IgG abbinati all'isotipo fungono da controllo negativo
   12. Aggiungere 1 mL di PBS alle cellule e centrifugare a 300 x g per 10 min. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo con 200 μL di PBS.
   13. Aggiungere 5 μL di ioduro di propidio per campione (200 μL) e trasferire le celle in un nuovo tubo di flusso da 5 ml.
   14. Eseguire la citometria del flusso e valutare i livelli delle espressioni CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209.

Risultati

Inizialmente, il fenotipo e la purezza del CB-SC sono stati esaminati dalla citometria del flusso con marcatori associati al CB-SC come il leucocitario comune antigene CD45, i fattori di trascrizione specifici delle cellule ES OCT3/4 e SOX2. CB-SC visualizza alti livelli di espressione CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 e galectin 9, ma nessuna espressione di CD34 (Figura 1A). L'analisi della citometria a flusso ha confermato l'espressione di marcatori specifici dell'esosoma, inclusi CD9, CD81 e CD63...

Discussione

L'applicazione di esosomi è un campo emergente per la diagnosi clinica, lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa. Qui presentiamo un protocollo dettagliato riguardante la preparazione di esosomi derivati dal CB-SC e lo studio funzionale degli esosomi sulla differenziazione dei monociti umani. L'attuale protocollo ha dimostrato che gli esosomi funzionali derivati da CB-SC sono isolati dalla centrifugazione sequenziale e dall'ultracentrifugazione con elevata purezza ed espongono la modulazione immunitaria sui mon...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-129
15 ml conical tube	Falcon	352196
24-well plate	Falcon	351147	Non-tissue culture plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)	Millipore sigma	D4292-20MG	Store at 4 °C
300 Mesh Grids	Ted Pella	1GC300
50 mL conical tube	Falcon	352070
6-well plate	Falcon	353046	Tissue culture plate
96-well plate	Falcon	353072	Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer	Lonza	10-548E	100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit	Millipore sigma	UFC901024
Anti-Human Alix	Biolegend	634501	store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin	Biolegend	699401	store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7	BD Bioscience	561356	store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange	Beckman Coulter	B36294	store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE	BD Bioscience	556018	store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5	Beckman Coulter	IM2643U	store at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC	BD Bioscience	551135	store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421	BD Bioscience	564127	store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE	Biolegend	318806	store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue	Biolegend	300431	store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC	Beckman Coulter	IM2427U	store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC	BD Bioscience	555349	store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7	Beckman Coulter	IM3548U	store at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE	Beckman Coulter	IM2073U	store at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE	BD Bioscience	561925	store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	A94686	store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC	Beckman Coulter	B30642	store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC	BD Bioscience	561956	store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	B30646	store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC	ThermoScientic	MA5-16860	store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421	Biolegend	348919	store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660	ThermoScientic	50-5841-82	store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488	ThermoScientic	53-9811-82	store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23227
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A1933
Buffy coat	New York Blood Center		40-60 ml/unit
Cell scraper	Falcon	353085
Disposable semi-micro cuvette	VWR	97000590
Dissociation buffer	Gibco	131510014	100 ml
Dual-Chanber cell counting slides	Bio-Rad	1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent	ThermoFisher Scientific	10606D	store at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media	GE Health	17-1440-03	500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°)	Thermo Scientifc	75003698	Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter		3 lasers 10 Color Max
Human cord blood	Cryo-Cell International		40-100 ml/unit
Human Fc Block	BD Bioscience	564220	store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane	Bio-Rad	1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore Sigma	SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge	Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4	BioExpress	S-3500-1
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	500 ml
Propidium Iodide	BD Bioscience	56-66211E	store at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscope	Nikon instruments Inc	Eclipse Ti2	NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342	Thermo Scientifc	62249	5 ml
Revert microsopy	Fisher scientific	12563518
Rotor 41 Ti	Beckman Coulter	331362	Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge	Thermo Scientifc	75004381
Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientifc	75003655
TC-20 cell counter	Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	331372
X'VIVO 15 Serum-free medium	Lonza	BEBP04-744Q	1000 ml Culture medium, store at 4 °C