Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto

Riepilogo

In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. Utilizzando primer specifici per specie, cpsDNA è stato quantificato da qPCR in modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia.

Abstract

Lo xenotrapianto è un metodo fattibile per trattare l'insufficienza d'organo. Tuttavia, come monitorare efficacemente il rifiuto immunitario dello xenotrapianto è un problema per medici e ricercatori. Questo manoscritto descrive un metodo semplice ed efficace per monitorare il rigetto immunitario nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il DNA circolante è un biomarcatore potenzialmente non invasivo per il danno agli organi. In questo studio, il DNA circolante specifico del maiale (cpsDNA) è stato monitorato durante il rigetto dello xenograft mediante PCR quantitativo in tempo reale (qPCR). In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. I primer specifici per specie sono stati quindi utilizzati per quantificare il cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il valore di questo metodo suggerisce che può essere usato come metodo semplice, conveniente, a basso costo e meno invasivo per monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto.

Introduzione

L'insufficienza d'organo è una delle principali cause di^{morte 1}. Il trapianto di cellule, tessuti e organi è un modo efficace per trattare l'insufficienza^{d'organo 2}. Tuttavia, la carenza di organi donatori limita l'applicazione clinica di questo^{metodo 3,4}. Gli studi hanno dimostrato che i maiali possono essere utilizzati come potenziale fonte di organi umani per il trapianto^{clinico 5,6}. Tuttavia, il trapianto di organi tra specie deve affrontare un pericoloso rifiuto immunitario. Pertanto, è fondamentale monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto. Attualmente, il monitoraggio clinico del rigetto immunitario dipende principalmente dai segni e dai sintomi del paziente, nonché dai test di laboratorio (ad esempio biopsia, analisi immunobiochimica ed ecografia)^7,8,9. Tuttavia, questi metodi di monitoraggio hanno molti svantaggi. I segni e i sintomi del rigetto immunitario nei pazienti di solito^{compaiono alla fine del 10}, il che non favorisce la diagnosi precoce e l'intervento precoce; la biopsia ha lo svantaggio di essere^{invasiva 11}, il che non è facile da accettare per i pazienti; l'analisi immunobiochimica manca di sensibilità o specificità e gli ultrasuoni sono ausiliari e costosi. Pertanto, è urgente trovare un metodo efficace e conveniente per monitorare il rifiuto immunitario.

Il DNA circolante è un tipo extracellulare di DNA trovato nel sangue. Mandel e Metais^{12 riportarono per} la prima volta la presenza di DNA circolante nel sangue periferico nel 1948. In condizioni fisiologiche normali, il DNA circolante nel sangue di persone sane è relativamente basso al basale. Tuttavia, in alcune patologie, come tumori, infarto del miocardio, malattie autoimmuni e rigetto del trapianto, il livello di DNA circolante nel sangue può essere significativamente^{aumentato 13,14} a causa del rilascio massiccio di DNA circolante causato da apoptosi e necrosi. L'origine del DNA circolante è associata all'apoptosi e alla necrosi¹⁵, che sono caratteristiche del rifiuto dello xenografto¹⁶.

Il DNA circolante ha dimostrato di essere un biomarcatore mini-invasivo per il rilevamento dei^{tumori 17,18,19}. Il sequenziamento elevato del DNA circolante derivato dal donatore è affidabile per il rilevamento del rigetto dopo il trapianto di^{organi 20,21}. Tuttavia, questo metodo richiede un'alta concentrazione e qualità del DNA estratto. I requisiti del DNA oltre all'elevato costo e al consumo di tempo rendono questo metodo non idoneo per l'uso clinico di routine. Il DNA circolante derivato dal donatore può essere quantificato con precisione dalla PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), che è allo stesso tempo specifica e sensibile. Pertanto, quantificare il DNA circolante suino mediante qPCR è un metodo fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. Questo è meno invasivo, altamente sensibile e specifico, a basso costo e risparmio di tempo. I suini e gli esseri umani sono geneticamente separati con sequenze genomiche molto diverse (Figura 1). Pertanto, il DNA suino circolante può essere rilasciato nel sangue del ricevente dopo lo xenotrapianto a causa dello xeno-rifiuto. CpsDNA potrebbe essere quantificato con precisione da qPCR con primer specifici per specie nel sangue del ricevente. In precedenza, abbiamo dimostrato la logica e la fattibilità del cpsDNA come biomarcatore per lo xenotrapianto^22,23. Qui, divulghiamo suggerimenti e dettagli più sperimentali. L'esperimento consiste nei seguenti passaggi. In primo luogo, sono stati progettati primer specifici suiini e il DNA genomico è stato isolato, che è stato utilizzato per verificare la specificità dei primer dalla NORMALE PCR. In secondo luogo, costruire la curva standard di cpsDNA e isolare cpsDNA dal sangue campione. Infine, il DNA circolante specifico del maiale è stato quantificato utilizzando qPCR.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti dell'Institutional Review Board of Shenzhen Second People's Hospital, Primo ospedale affiliato dell'Università di Shenzhen.

1. Progettare primer specifici per suini

1. Eseguire l'analisi BLAST dell'intero genoma per identificare geni specifici suiini diversi da quelli di esseri umani, scimmie o topi, utilizzando il software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2. Progettare primer secondo 19 geni specifici del maiale (Tabella 1) utilizzando il software di Primer 5.

2. Isolare il DNA genomico

NOTA: Il DNA genomico (incluso il sangue di maiali, scimmie, esseri umani volontari, scimmie con innesti di maiali e topi con cellule suine) è stato estratto utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico commerciale (Table of Materials).

1. Posizionare rispettivamente 500 μL del sangue intero dei campioni di cui sopra in diversi tubi di microcentrifugo.
2. Aggiungere 20 μL di proteasi K e 500 μL di tampone di lisi nei tubi di microcentrifugo di cui sopra, quindi agitare e mescolare accuratamente.
3. Mettere questi tubi di microcentrifugo in un bagno d'acqua a 56 °C per 10 minuti e agitare 2-3 volte durante questo processo fino a quando la soluzione non diventa chiara.
4. Centrifugare brevemente per rimuovere le perline liquide dalla parete interna dei coperchi del tubo. Aggiungere 500 μL di alcol etilico anidro e agitare accuratamente.
5. Trasferire la miscela nella colonna di adsorbimento, centrifugare a 12.000 giri/min (~13.400 x g)per 2 min.
6. Aggiungere 800 μL di soluzione di risciacquo ad ogni colonna di adsorbimento; centrifuga per 1 min a 12.000 giri/min (~13.400 x g). Posizionare le colonne a temperatura ambiente per alcuni minuti per asciugare la soluzione di risciacquo rimanente.
   NOTA: La soluzione di risciacquo è fornita dal produttore.
7. Trasferire le colonne di adsorbimento in un altro tubo centrifugo pulito, aggiungere 50 μL di tampone di eluizione al centro delle pellicole di adsorbimento e posizionarle a temperatura ambiente per 2-5 minuti. Centrifuga 6.200 x g per 1 min 12.000 giri/min (~13.400 x g).
   NOTA: Il tampone di eluizione è fornito dal produttore, ma il tampone TE, contenente 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 0,1 mM EDTA, può anche eludere il DNA.
8. Conservare la soluzione di DNA a -20 °C.

3. Verificare la specificità dei primer

NOTA: Le specificità delle specie dei 19 primer di cui sopra sono state confermate dalla PCR, che è stata eseguita utilizzando polimerasi(tabelladei materiali) e primer presentati nella tabella 1.

1. Preparare la soluzione premiscelata di 12,5 μL di 2x premiscele PCR (Tabella deimateriali),1 μL di primer da 5' (10 μM), 1 μL di primer 3' (10 μM) e 8,5 μL di ddH₂O. Preparare la miscela includendo 2 campioni extra.
2. Dividere 23 μL di soluzione pre-miscelata in tubi di microcentrifugo da 0,2 ml, aggiungere 2 μL di DNA genomico e limitare accuratamente i tubi. Quindi mescolare e centrifugare leggermente.
3. Posizionare i tubi di microcentrifugo da 0,2 ml nel ciclore PCR ed eseguire le seguenti operazioni: Denaturazione: 95 °C per 5 s; Ricottura: 60 °C per 30 s; estensione:72 °C per 30 s.
4. Eseguire l'elettroforesi dell'agarosio come segue:
   1. Pesare 1,2 g di agarosio in un pallone contenente 100 ml di 1x TAE e far bollire per 5 minuti nel microonde. Aggiungere 5 μL di colorante acido nucleico(Tabella dei materiali)nel pallone dopo che si raffredda a circa 70 °C. Versarlo lentamente nella piastra lungo il bordo e posizionarlo a temperatura ambiente fino a quando non si solidifica in un gel.
   2. Aggiungere 5 μL di campione e scala del DNA a 2 log (0,1-10,0 kb) o marcatore I (0,1-0,6 kb), che contengono 1 μL di tampone di carico del DNA 6x, nel gel di agarosio. Quindi elettroforesco a 120 mA fino a quando le bande non sono separate.
   3. Visualizza il gel di agar contenente frammenti di DNA con un imager ultravioletto.
5. Eseguire l'elettroforesi dell'agarosio per isolare frammenti di DNA amplificati dai campioni di cui sopra, che è stato visualizzato in un imager ultravioletto. Utilizzando la PCR, sono stati identificati per la prima volta i primer specifici per il DNA genomico suino amplificato (Figura 2A). Inoltre, sono state confermate alcune specificità delle specie di questi primer che hanno specificamente amplificato il DNA dei suini nella coorte di genomica scimmia/umana o nella coorte del DNA genomico del topo(figura 2B). Infine, due primer specifici per specie hanno ulteriormente dimostrato di amplificare specificamente il DNA dei suini nel cerotto dell'arteria da maiale a scimmia e/o nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo(figura 2C)

4. Curva standard di cpsDNA

1. Trasformare il plasmide pMD19-T contenente un frammento di DNA suino in DH5a, che potrebbe essere specificamente amplificato dal primer #4 o dal primer #11 (Tabella 1). Schermo per batteri positivi utilizzando 50 μg/mL di ampicillina.
   Primer #4 nella coorte uomo/scimmia (avanti: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, rovescio: 5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′)
   Primer #11 per il modello di mouse (avanti: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, inverso: 5′-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTC T-3′)
   NOTA: I dettagli di tutti i primer sono disponibili nella tabella 1.
2. Raccogliere i plasmidi di cui sopra seguendo il protocollo seguente.
   1. Isolare una singola colonia da una piastra selettiva appena striata e inoculare una coltura di 1-5 mL di mezzo LB contenente l'antibiotico selettivo appropriato. Incubare per 12-16 ore a 37 °C con scuotimento vigoroso (300 giri/min).
   2. Centrifuga a 10.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente. Decantare o aspirare e scartare i mezzi di coltura.
   3. Aggiungere 250 μL di Soluzione I/RNasi A. Vortice o pipetta su e giù per mescolare accuratamente. La sospensione completa del pellet cellulare è vitale per ottenere buone rese.
      NOTA: La RNasi A deve essere aggiunta alla soluzione I prima dell'uso.
   4. Trasferire la sospensione in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 ml. Aggiungere 250 μL della soluzione II. Invertire e ruotare delicatamente il tubo più volte per ottenere un lysate chiaro. Può essere necessaria un'incubazione di 2-3 minuti.
      NOTA: Evitare una miscelazione vigorosa in quanto ciò tagliorà il DNA cromosomico e ridurre la purezza del plasmide. Non lasciare che la reazione dilisi proceda per più di 5 minuti.
   5. Aggiungere 350 μL della soluzione III. Invertire immediatamente più volte fino a 300 forme di precipitato bianco flocculento.
      NOTA: È fondamentale che la soluzione sia miscelata accuratamente e immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione III per evitare precipitazioni localizzate.
   6. Centrifuga alla massima velocità (≥13.000 x g) per 10 minuti. Si formerà un pellet bianco compatto. Procedere prontamente al passaggio successivo.
   7. Inserire una mini colonna dna in un tubo di raccolta da 2 ml.
   8. Trasferire il supernatante cancellato da 4.2.7 aspirandolo attentamente nella mini colonna del DNA. Fare attenzione a non disturbare il pellet e che nessun detriti cellulare venga trasferito nella mini colonna del DNA.
   9. Centrifuga alla massima velocità per 1 minuto. Scartare il filtrato e riutilizzare il tubo di raccolta.
   10. Aggiungere 500 μL di HBC Buffer. Centrifuga alla massima velocità per 1 minuto. Scartare il tubo di raccolta del filtrato e riutilizzarlo.
       NOTA: HBC Buffer deve essere diluito con isopropanolo al 100% prima dell'uso.
   11. Aggiungere 700 μL di DNA Wash Buffer. Centrifuga alla massima velocità per 1 minuto. Scartare il filtrato e riutilizzare il tubo di raccolta.
       NOTA: Il tampone di lavaggio del DNA deve essere diluito con etanolo al 100% prima dell'uso.
       1. Facoltativo: ripetere per una seconda fase di lavaggio del tampone di lavaggio del DNA.
   12. Centrifugare la mini colonna di DNA vuota per 2 minuti alla massima velocità per asciugare la matrice della colonna.
       NOTA: È importante asciugare la matrice della mini colonna del DNA prima dell'eluizione. L'etanolo residuo può interferire con le applicazioni a valle.
   13. Trasferire la mini colonna del DNA in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 ml.
   14. Aggiungere 30-100 μL di tampone di eluizione o acqua deionizzata sterile direttamente al centro della membrana della colonna.
       NOTA: L'efficienza dell'eluizione del DNA dalla colonna DNA Mini dipende dal pH. Se si utilizza acqua deionizzata sterile, assicurarsi che il pH sia intorno alle 8.5.
   15. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
   16. Centrifuga alla massima velocità per 1 minuto.
       NOTA: Questo rappresenta circa il 70% del DNA legato. Una seconda eluizione opzionale produrrà qualsiasi DNA residuo, anche se a una concentrazione inferiore.
3. Verificare i plasmidi di cui sopra utilizzando mediante digestione enzimatica a doppia restrizione utilizzando EcoR I (15 U/μL) e Bam H1(15 U/μL)²².
   1. Eseguire i passaggi di make-up sul ghiaccio. Preparare il sistema di reazione di 1 μL di EcoR I (15 U), 1 μL di Bam H1 (15 U), 2 μL di Tampone 10x, 1 μg di plasmide; aggiungere ddH₂O a 20 μL di volume totale, mescolare accuratamente. Incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 ore.
   2. Separare i prodotti digeriti dell'1% di agarosio seguito da elettroforesi ed esporre alla luce UV come prima.
4. Diluire il plasmide concentrato in 2 x 10¹¹ copie/mL per la soluzione standard iniziale utilizzando ddH₂O. Prendiamo il plasmide (P2) contenente un frammento di DNA suino per esempio di copie che calcolano:
   1. Calcolare il numero di plasmidi in 1 mL di soluzione standard iniziale: N = (2 x 10¹¹)/ (6,02 x 10²³) mol.
   2. Calcolare il peso molecolare di P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
   3. Calcolare la massa di P2: m=N*M= (2 x 10¹¹)/ (6,02 x 10²³) mol x 2810 x 650 g/mol.
   4. Calcolare il volume di P2: V = m/C = [(2 x 10¹¹)/(6,02 x 10²³) x 2810 x 650] g/C. (C è la concentrazione di P2 (ng/μL), misurata da uno spettrofotometro).
5. Diluire la soluzione standard iniziale in serie 10 volte in 2 x 10¹⁰ copie/mL, 2 x 10⁹ copie/mL, 2 x 10⁸ copie/mL, 2 x 10^{7 copie/mL...e} 2 x 10⁰ copie/mL per la soluzione standard utilizzando ddH₂O. Vortex accuratamente durante la diluizione.
6. Stabilisci la curva standard.
   1. Preparare il sistema di reazione di qPCR (tutti i passaggi sono protetti dalla luce): Aggiungere la soluzione premismiata che contiene 325 μL di qPCR Mix(Table of Materials),13 μL di primer 5', 13 μL di primer 3' e 169 μL di ddH₂O in un tubo microcentrifuge da 1,5 mL, che è stato poi accuratamente miscelato e leggermente centrifugato.
   2. Dividere i 40 μL sopra la soluzione pre-miscelata in una striscia a 8 tubi e aggiungere 10 μL di DNA standard di diverse concentrazioni. Cappucciare con cura, mescolare e centrifugare leggermente.
   3. Inserire il nastro a 8 tubi nella macchina qPCR seguendo la procedura illustrata nella figura 3.

5. Isolare il DNA circolante dai campioni di sangue

1. Utilizzando tubi EDTA, raccogliere campioni di sangue in diversi punti di tempo nei modelli di patch dell'arteria da maiale a scimmia e nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo.
2. Raccogliere campioni di sangue di circa 400 μL (dai modelli di patch per arteria da maiale a scimmia) o 100 μL (dai modelli di trapianto di cellule da maiale a topo) e trasferirli a tubi di microcentrifugo da 1,5 ml. Rimuovere le cellule del sangue dai campioni di sangue mediante centrifugazione a bassa temperatura e alta velocità (3.000 x g,4 °C, 5 min).
3. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 16.000 x g per 10 min.
4. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Estrarre il DNA circolante dal supernatante di cui sopra utilizzando un kit di estrazione del DNA siebro/circolante commerciale seguendo il protocollo 2 del protocollo isolante dei produttori di DNA genomico.
5. Condensare il volume del DNA circolante a 40 μL e immagazzinare a -20 °C.

6. Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale

1. Preparare la soluzione premismiata di 25 μL di qPCR Mix(Table of Materials),1 μL di primer da 5', 1 μL di primer 3', 10 μL di DNA campione e 13 μL di ddH₂O. Preparare la miscela includendo 2 campioni extra.
2. Dividere la soluzione pre-miscelata da 40 μL in una striscia a 8 tubi e aggiungere 10 μL di DNA campione, seguita da un'attenta tappatura. Preparare due reazioni in più del necessario.
3. Mettere la striscia a 8 tubi nella macchina qPCR seguendo la stessa procedura della curva standard. È meglio eseguire prima uno standard per assicurarsi che la reazione sia fondamentale per la quantificazione in anticipo. La procedura del sistema di reazione di qPCR è stata illustrata nella figura 3.

Risultati

In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione(figura 4). Le specificità delle specie dei 19 primer sono state confermate dalla PCR. I primer specifici per specie (primer #4 e primer #11) sono stati quindi utilizzati per quantificare cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arte...

Discussione

Quantificare il DNA circolante suina rappresenta un approccio fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. ²⁴ hanno scoperto che il contenuto di DNA circolante derivato dal donatore (ddcfDNA) nel sangue dei pazienti con rigetto acuto era significativamente superiore a quello dei pazienti senza rifiuto. Questi studi suggeriscono che il ddcfDNA può essere un biomarcatore comune per il monitoraggio dei danni da innesto degli organi. Negli ultimi anni, qPCR è stato sempre pi?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest, Barcelona, Spain	111860
BamHI-HF	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	R3136S
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen Biosciences, Union City, CA, USA	MCT-150-C
0.2 mL PCR tube	Axygen Biosciences, Union City, CA, USA	PCR-02-C
C57BL/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province,  China		8~10 weeks
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA	Micro 21R
2-Log DNA Ladder	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	N3200S	0.1–10.0 kb
Marker I	Tiangen, Beijing, China	MD101-02	0.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	DNACOL-01
DNA loading buffer	Solarbio, Beijing, China	D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	D6942
		D6943
EcoR I	Takara Bio, Shiga, Japan	1040S
Female Bama mini pigs	BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China		2~4 months
Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ	Tiangen, Beijing, China	DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo, Osaka, Japan	QPK-201
Gel Doc XR	Bio-Rad, Hercules, USA
Male cynomolgus monkeys	Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China		8 years
Nucleic acid dye(Gelred)	Biotium, Fremont, USA	42003
polymerase(Premix Taq)	Takara Bio, Shiga, Japan	RR901A
pMD19-T plasmid	Takara Bio, Shiga, Japan	D102A
qPCR machine	Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction Kit	Tiangen, Beijing, China	DP339
TAE	sangon Biotech, Shanghai, China	B548101