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Resumo

Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas. Utilizando primers específicos de espécies, o CPSDNA foi quantificado por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco.

Resumo

Xenotransplante é um método viável para tratar a falência de órgãos. No entanto, como monitorar efetivamente a rejeição imune do xenotransplante é um problema para médicos e pesquisadores. Este manuscrito descreve um método simples e eficaz para monitorar a rejeição imunológica em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco. O DNA circulante é um biomarcador potencialmente não invasivo para danos nos órgãos. Neste estudo, o DNA específico do suíno circulante (cpsDNA) foi monitorado durante a rejeição do xenoenxerto por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas. Primers específicos de espécies foram então usados para quantificar cpsDNA por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco. O valor deste método sugere que ele pode ser usado como um método simples, conveniente, de baixo custo e menos invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransplante.

Introdução

A falência de órgãos é uma das principais causas de morte1. O transplante de células, tecidos e órgãos é uma forma eficaz de tratar a falência de órgãos2. No entanto, a escassez de órgãos doadores limita a aplicação clínica deste método3,4. Estudos têm demonstrado que os suínos podem ser usados como fonte potencial de órgãos humanos para transplante clínico5,6. No entanto, o transplante de órgãos entre espécies enfrenta perigosa rejeição imunológica. Portanto, é crucial monitorar a rejeição imune da xenotransplante. Atualmente, o acompanhamento clínico da rejeição imunológica depende principalmente dos sinais e sintomas do paciente, bem como de exames laboratoriais (por exemplo, biópsia, análise imunobioquímica e ultrassom)7,8,9. No entanto, esses métodos de monitoramento têm muitas desvantagens. Os sinais e sintomas de rejeição imunológica em pacientes geralmente aparecem no finaldo dia 10, o que não é propício à detecção precoce e intervenção precoce; a biópsia tem a desvantagem de ser invasiva11, o que não é fácil para os pacientes aceitarem; a análise imunobioquímica carece de sensibilidade ou especificidade, e o ultrassom é auxiliar e caro. Portanto, é urgente encontrar um método eficaz e conveniente para monitorar a rejeição imunológica.

O DNA circulante é um tipo extracelular de DNA encontrado no sangue. Mandel e Metais12 relataram pela primeira vez a presença de DNA circulante em sangue periférico em 1948. Sob condições fisiológicas normais, o DNA circulante no sangue de pessoas saudáveis é relativamente baixo na linha de base. No entanto, em algumas patologias, como tumores, infarto do miocárdio, doenças autoimunes e rejeição de transplantes, o nível de DNA circulante no sangue pode ser significativamente aumentado13,14 devido à liberação maciça de DNA circulante causado por apoptose e necrose. A origem do DNA circulante está associada à apoptose e necrose15, características da rejeição do xenoenxerto16.

O DNA circulante tem sido provado ser um biomarcador minimamente invasivo para detectar cânceres17,18,19. O alto sequenciamento do DNA circulante derivado do doador é confiável para a detecção da rejeição após o transplante deórgãos 20,21. No entanto, este método requer uma alta concentração e qualidade de DNA extraído. Os requisitos de DNA, além do alto custo e do consumo de tempo, tornam esse método inelegível para uso clínico de rotina. O DNA circulante derivado do doador pode ser precisamente quantificado por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), que é específico e sensível. Portanto, quantificar o DNA circulante de suínos por qPCR é um método viável para monitorar a rejeição imune da xenotransplante. Isso é menos invasivo, altamente sensível e específico, de baixo custo e economia de tempo. Porcos e seres humanos são geneticamente separados com sequências genômicas bastante diferentes(Figura 1). Portanto, o DNA suíno circulante pode ser liberado no sangue pós-xenotransplante do receptor por causa da rejeição de xenoxe. O CPSDNA poderia ser precisamente quantificado por qPCR com primers específicos de espécies no sangue do receptor. Anteriormente, demonstramos a lógica e a viabilidade do CPSDNA como biomarcador para xenotransplante22,23. Aqui, divulgamos mais dicas e detalhes experimentais. O experimento consiste nos seguintes passos. Em primeiro lugar, foram projetados primers específicos porcina, e o DNA genômico foi isolado, que foram usados para verificar a especificidade dos primers por PCR regular. Em segundo lugar, a construção da curva padrão do CPSDNA e isolação do cpsDNA do sangue amostral. Finalmente, o DNA específico do porco circulante foi quantificado por meio de qPCR.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes do Conselho de Revisão Institucional do Hospital do Segundo Povo de Shenzhen, Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Shenzhen.

1. Projete primers específicos de suínos

  1. Realize a análise blast de genoma inteiro para identificar genes específicos suínos que eram diferentes dos humanos, macacos ou camundongos, usando o software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  2. Projete primers de acordo com 19 genes específicos para porcos(Tabela 1) usando o software do Primer 5.

2. Isolando o DNA genômico

NOTA: O DNA genômico (incluindo sangue de porcos, macacos, humanos voluntários, macacos com enxertos de porco e camundongos com células suínas) foi extraído usando um kit comercial de extração de DNA genômico(Tabela de Materiais).

  1. Coloque 500 μL de todo o sangue de amostras acima em diferentes tubos de microcentrifuuagem, respectivamente.
  2. Adicione 20 μL de protease K e 500 μL de tampão de lise nos tubos de microcentrifuuge acima e, em seguida, agite e misture completamente.
  3. Coloque estes tubos de microcentrifuge em um banho de água a 56 °C por 10 minutos e agite 2-3 vezes durante este processo até que a solução fique clara.
  4. Centrifugar brevemente para remover as contas líquidas da parede interna das tampas do tubo. Adicione 500 μL de álcool etílico anidro e agite bem.
  5. Transfira a mistura para a coluna adsorção, centrífuga a 12.000 rpm (~13.400 x g) por 2 min.
  6. Adicionar 800 μL de solução de enxágue a cada coluna de adsorção; centrífuga por 1 min a 12.000 rpm (~13.400 x g). Coloque as colunas em temperatura ambiente por alguns minutos para secar a solução restante de lavagem.
    NOTA: A solução de enxágue é fornecida pelo fabricante.
  7. Transfira as colunas de adsorção para outro tubo centrífugo limpo, adicione 50 μL de tampão de elução para o meio dos filmes de adsorção e coloque-as em temperatura ambiente por 2-5 minutos. Centrífuga 6.200 x g por 1 min 12.000 rpm (~13.400 x g).
    NOTA: O tampão de elução é fornecido pelo fabricante, mas o tampão TE, contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 0,1 mM EDTA, também pode elutar o DNA.
  8. Armazene a solução de DNA a -20 °C.

3. Verifique a especificidade dos primers

NOTA: As especificidades das espécies dos 19 primers acima foram confirmadas pela PCR, que foi realizada utilizando polimerase (Tabela de Materiais) e primers apresentados na Tabela 1.

  1. Prepare a solução pré-mista de 12,5 μL de 2x PCR premix(Tabela de Materiais),1 μL de primer de 5'(10 μM), 1 μL de primer de 3' (10 μM) e 8,5 μL de ddH2O. Prepare a mistura incluindo 2 amostras extras.
  2. Divida 23 μL de solução pré-misturada em tubos de microcentrífugo de 0,2 mL, adicione 2 μL de DNA genômico e tampa cuidadosamente os tubos. Em seguida, misture e centrifugar ligeiramente.
  3. Coloque os tubos de microcentrifuuge de 0,2 mL no ciclo-ciclo de PCR e realize o seguinte: Denaturação: 95 °C para 5 s; Ressarem: 60 °C para 30 s; extensão:72 °C para 30 s.
  4. Realizar a garose eletroforese da seguinte forma:
    1. Pesar 1,2 g de agarose em um frasco contendo 100 mL de 1x TAE e fervê-lo por 5 min no micro-ondas. Adicione 5 μL de corante nucleicoácido (Tabela de Materiais) no frasco depois de esfriar a cerca de 70 °C. Despeje-o na placa ao longo da borda lentamente, e coloque-o à temperatura ambiente até solidificar em um gel.
    2. Adicione 5 μL de amostra e 2-Log DNA Ladder (0,1-10,0 kb) ou Marcador I (0,1-0,6 kb), que contêm 1 μL de tampão de carregamento de DNA 6x, no gel de agarose. Em seguida, eletroforese a 120 mA até que as bandas sejam separadas.
    3. Visualize o gel de ágar contendo fragmentos de DNA com um imager ultravioleta.
  5. Realize a agarose eletroforesis para isolar fragmentos de DNA amplificados das amostras acima, que foi visualizado em um imager ultravioleta. Utilizando o PCR, foram identificados pela primeira vez os primers específicos para DNA genômico suíno amplificado(Figura 2A). Além disso, foram confirmadas certas especificidades de espécies desses primers que amplificaram especificamente o DNA de porco na coorte de macaco/genômico humano ou na coorte de DNA genômico do camundongo(Figura 2B). Finalmente, dois primers de especificidades de espécies foram ainda comprovados para amplificar especificamente o DNA de porco no patch da artéria de porco para macaco e/ou modelos de transplante de células de porco para rato, respectivamente (Figura 2C)

4. Curva padrão do cpsDNA

  1. Transforme o plasmídeo pMD19-T contendo um fragmento de DNA suíno em DH5a, que poderia ser especificamente amplificado pelo primer #4 ou primer #11(Tabela 1). Tela para bactérias positivas usando 50 μg/mL ampicillin.
    Primer #4 em coorte humano/macaco (para a frente: 5'-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, reverso: 5′-CTTCATTCCTATAAC CCTGT-3′)
    Primer #11 para modelo de mouse (para a frente: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, reverso: 5'-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTC T-3′)
    NOTA: Detalhes de todos os primers podem ser encontrados na Tabela 1.
  2. Colher os plasmídeos acima seguindo o protocolo abaixo.
    1. Isole uma única colônia de uma placa seletiva recém-listrada e inocula uma cultura de 1-5 mL de meio LB contendo o antibiótico seletivo apropriado. Incubar por 12-16 horas a 37 °C com agitação vigorosa (300 rpm).
    2. Centrifugar a 10.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente. Decantar ou aspirar e descartar a mídia cultural.
    3. Adicione 250 μL de Solução I/RNase A. Vortex ou pipet para cima e para baixo para misturar completamente. A ressuspensão completa da pelota celular é vital para obter bons rendimentos.
      NOTA: O RNase A deve ser adicionado à Solução I antes de usar.
    4. Transfira a suspensão para um novo tubo de microcentrifus de 1,5 mL. Adicione 250 μL de Solução II. Inverta e gire suavemente o tubo várias vezes para obter um lise claro. Uma incubação de 2 a 3 minutos pode ser necessária.
      NOTA: Evite uma mistura vigorosa, pois este irá tesourar DNA cromossômico e menor pureza plasmida. Não permita que a reação de lise prossiga por mais de 5 minutos.
    5. Adicione 350 μL da Solução III. Inverta imediatamente várias vezes até que um flocculente branco precipitado se forme.
      NOTA: É vital que a solução seja completamente misturada e imediatamente após a adição da Solução III para evitar precipitação localizada.
    6. Centrifugar em velocidade máxima (≥13.000 x g) por 10 minutos. Uma pelota branca compacta se formará. Prontamente proceda para o próximo passo.
    7. Insira uma mini coluna de DNA em um tubo de coleta de 2 mL.
    8. Transfira o supernante limpo de 4.2.7 aspirando-o cuidadosamente na mini coluna de DNA. Tenha cuidado para não perturbar a pelota e que nenhum detrito celular seja transferido para a mini coluna de DNA.
    9. Centrifugar em velocidade máxima por 1 minuto. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
    10. Adicione 500 μL de buffer HBC. Centrifugar em velocidade máxima por 1 minuto. Descarte o tubo de coleta de filtragem e reutilização.
      NOTA: O buffer HBC deve ser diluído com isopropanol 100% antes de usar.
    11. Adicione 700 μL de buffer de lavagem de DNA. Centrifugar em velocidade máxima por 1 minuto. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
      NOTA: O buffer de lavagem de DNA deve ser diluído com 100% de etanol antes de ser usado.
      1. Opcional: Repita para um segundo passo de lavagem de dna tampão.
    12. Centrifugar a mini coluna de DNA vazia por 2 minutos em velocidade máxima para secar a matriz da coluna.
      NOTA: É importante secar a matriz de mini coluna de DNA antes da eluição. O etanol residual pode interferir nas aplicações a jusante.
    13. Transfira a mini coluna de DNA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpo.
    14. Adicione 30-100 μL de tampão de elução ou água deionizada estéril diretamente ao centro da membrana da coluna.
      NOTA: A eficiência de eluição do DNA da coluna DNA Mini depende do pH. Se usar água deionizada estéril, certifique-se de que o pH esteja em torno de 8,5.
    15. Deixe descansar em temperatura ambiente por 1 minuto.
    16. Centrifugar em velocidade máxima por 1 minuto.
      NOTA: Isso representa aproximadamente 70% do DNA vinculado. Uma segunda elução opcional produzirá qualquer DNA residual, embora em uma concentração menor.
  3. Verifique os plasmídeos acima usando por dupla restrição de digestão enzimída usando EcoR I (15 U/μL) e Bam H1(15 U/μL)22.
    1. Faça os passos de maquiagem no gelo. Prepare o sistema de reação de 1 μL de EcoR I (15 U), 1 μL de Bam H1 (15 U), 2 μL de tampão de 10x, 1 μg de plasmídeo; adicionar ddH2O a 20 μL de volume total, misture bem. Incubar em um banho de água a 37 °C por 2 horas.
    2. Separe os produtos digeridos em 1% de agarose seguido de eletroforese e exponha à luz UV como antes.
  4. Diluir o plasmídeo concentrado em 2 x 1011 cópias/mL para a solução padrão inicial usando ddH2O. Veja o plasmídeo (P2) contendo um fragmento de DNA suíno, por exemplo, de cópias que calculam:
    1. Calcule o número de plasmídeos em 1 mL de solução padrão inicial: N = (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol.
    2. Calcular o peso molecular de P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
    3. Calcule a massa de P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
    4. Calcule o volume de P2: V = m/C = [((2 x 1011)/(6,02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C é a concentração de P2 (ng/μL), que é medida por um espectrofotômetro).
  5. Diluir a solução padrão inicial em 10 vezes em 2 x 1010 cópias/mL, 2 x 109 cópias/mL, 2 x 108 cópias/mL, 2 x 107 cópias/mL..., e 2 x 100 cópias/mL para solução padrão usando ddH2O.
  6. Estabeleça a curva padrão.
    1. Prepare o sistema de reação do qPCR (todas as etapas estão protegidas da luz): Adicione a solução pré-misturada que contém 325 μL de qPCR Mix (Tabela de Materiais),13 μL de primer de 5', 13 μL de primer de 3', e 169 μL de ddH2O em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, que foi então completamente misturado e ligeiramente centrifuuado.
    2. Divida os 40 μL acima da solução pré-misturada em uma tira de 8 tubos e adicione 10 μL de DNA padrão de diferentes concentrações. Cap com cuidado, misture e centrifule ligeiramente.
    3. Coloque a tira de 8 tubos na máquina qPCR seguindo o procedimento mostrado na Figura 3.

5. Isolar o DNA circulante das amostras de sangue

  1. Usando tubos EDTA, coletar amostras de sangue em diferentes pontos de tempo nos modelos de remendo da artéria de porco para macaco e nos modelos de transplante de células de porco para rato.
  2. Coletar amostras de sangue de cerca de 400 μL (dos modelos de remendo da artéria de porco para macaco) ou 100 μL (dos modelos de transplante de células de porco para camundongos) e transferir para tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Remova as células sanguíneas das amostras de sangue por centrifugação a baixa temperatura e alta velocidade (3.000 x g, 4 °C, 5 min).
  3. Transfira o supernante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e remova os detritos celulares por centrifugação a 16.000 x g por 10 minutos.
  4. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Extrair o DNA circulante do supernante acima usando um kit comercial de extração de DNA de soro/circulante seguindo o protocolo 2 do protocolo dos fabricantes de DNA genômico isolante.
  5. Condensar o volume de DNA circulante para 40 μL e armazenar a -20 °C.

6. Quantitação de DNA específico de suíno circulante

  1. Prepare a solução pré-misturada de 25 μL de qPCR Mix(Tabela de Materiais),1 μL de primer de 5', 1 μL de primer de 3', 10 μL de DNA de amostra e 13 μL de ddH2O. Prepare a mistura incluindo 2 amostras extras.
  2. Divida a solução pré-misturada de 40 μL em uma tira de 8 tubos e adicione 10 μL de DNA amostral, seguido de cobertura cuidadosa. Prepare duas reações a mais do que o necessário.
  3. Coloque a tira de 8 tubos na máquina qPCR seguindo o mesmo procedimento da curva padrão. É melhor executar um padrão primeiro para ter certeza de que a reação é fundamental para quantificação com antecedência. O procedimento do sistema de reação do qPCR foi mostrado na Figura 3.

Resultados

Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas(Figura 4). As especificidades das espécies dos 19 primers foram confirmadas pela PCR. Primers específicos de espécies (primer #4 e primer #11) foram então usados para quantificar cpsDNA por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de re...

Discussão

Quantificar o DNA circulante de suínos representa uma abordagem viável para monitorar a rejeição imune da xenotransplante. Gadi et al.24 descobriram que o conteúdo de DNA circulante derivado do doador (ddcfDNA) no sangue de pacientes com rejeição aguda foi significativamente maior do que o de pacientes sem rejeição. Esses estudos sugerem que o DDCFDNA pode ser um biomarcador comum para monitorar danos ao enxerto de órgãos. Nos últimos anos, a QPCR tem sido cada vez mais aplicada à an?...

Divulgações

Os autores não relatam conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de P&D da China (2017YFC1103704), Fundação Shenzhen de Ciência e Tecnologia (JCYJ2017081717216272), Fundos Especiais para a Construção de Hospitais de Alto Nível em Guangdong Província (2019), Projeto de Medicina de Sanming em Shenzhen (SZSM201412020), Fundo para Construção de Disciplina Médica de Alto Nível de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBiowest, Barcelona, Spain111860
BamHI-HFNew England Biolabs, Ipswich, Mass, USAR3136S
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygen Biosciences, Union City, CA, USAMCT-150-C
0.2 mL PCR tubeAxygen Biosciences, Union City, CA, USAPCR-02-C
C57BL/6 MiceMedical Animal Center of Guangdong Province,  China8~10 weeks
CentrifugeThermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USAMicro 21R
2-Log DNA LadderNew England Biolabs, Ipswich, Mass, USAN3200S0.1–10.0 kb
Marker I Tiangen, Beijing, ChinaMD101-020.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)Omega Bio-tek, Norcross, GA, USADNACOL-01
DNA loading bufferSolarbio, Beijing, ChinaD1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IIOmega Bio-tek, Norcross, GA, USAD6942
D6943
EcoR ITakara Bio, Shiga, Japan 1040S
Female Bama mini pigsBGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China2~4 months
Genomic DNA Extraction Kit ⅠTiangen, Beijing, ChinaDP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master MixToyobo, Osaka, JapanQPK-201
Gel Doc XRBio-Rad, Hercules, USA
Male cynomolgus monkeysGuangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China8 years
Nucleic acid dye(Gelred)Biotium, Fremont, USA42003
polymerase(Premix Taq)Takara Bio, Shiga, JapanRR901A
pMD19-T plasmidTakara Bio, Shiga, JapanD102A
qPCR machineApplied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction KitTiangen, Beijing, ChinaDP339
TAEsangon Biotech, Shanghai, ChinaB548101

Referências

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