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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema microfisiologico in vitro per lo studio del cancro al seno utilizzando il tessuto mammario umano primario con materiali di prima qualità.

Abstract

Il cancro al seno (BC) rimane una delle principali cause di morte per le donne. Nonostante oltre 700 milioni di dollari investiti nella ricerca BC ogni anno, il 97% dei farmaci BC candidati fallisce gli studi clinici. Pertanto, sono necessari nuovi modelli per migliorare la nostra comprensione della malattia. Il programma NIH Microphysiological Systems (MPS) è stato sviluppato per migliorare la traduzione clinica delle scoperte scientifiche di base e promettendo nuove strategie terapeutiche. Qui presentiamo un metodo per generare MPS per i tumori al seno (BC-MPS). Questo modello adatta un approccio precedentemente descritto di coltivare il tessuto adiposo bianco umano primario (WAT) incattando WAT tra fogli di cellule staminali derivate da adiposi (ASC). Nuovi aspetti della nostra BC-MPS includono la semina di cellule BC in tessuto mammario umano non danneggiato (HBT) contenente matrice extracellulare nativa, adipociti maturi, fibroblasti residenti e cellule immunitarie; e l'incastro dell'admixture BC-HBT tra fogli ASC derivati da HBT. Il BC-MPS risultante è stabile in coltura ex vivo per almeno 14 giorni. Questo sistema modello contiene più elementi del microambiente che influenzano BC tra cui adipociti, cellule stromali, cellule immunitarie e matrice extracellulare. Quindi BC-MPS può essere usato per studiare le interazioni tra BC e il suo microambiente.

Dimostriamo i vantaggi della nostra BC-MPS studiando due comportamenti BC noti per influenzare la progressione del cancro e la metastasi: 1) motilità BC e 2) crosstalk metabolico BC-HBT. Mentre la motilità BC è stata precedentemente dimostrata utilizzando l'imaging intravitale, BC-MPS consente l'imaging time-lapse ad alta risoluzione utilizzando la microscopia a fluorescenza per diversi giorni. Inoltre, mentre il crosstalk metabolico è stato precedentemente dimostrato utilizzando cellule BC e pre-adipociti murini differenziati in adipociti immaturi, il nostro modello BC-MPS è il primo sistema a dimostrare questo crosstalk tra adipociti mammari umani primari e cellule BC in vitro.

Introduzione

Ogni anno, più di 40.000 donne negli Stati Uniti muoiono di cancro al seno (BC)1. Nonostante oltre 700 milioni di dollari investiti nella ricerca BC ogni anno, il 97% dei farmaci BC candidati fallisce gli studiclinici 2,3. Sono necessari nuovi modelli per migliorare la pipeline di sviluppo dei farmaci e la nostra comprensione di BC. Il programma NIH Microphysiological (MPS) ha delineato le caratteristiche necessarie per modelli rivoluzionari per migliorare la traduzione della scienza di base in successo clinico4. Questi includevano l'uso di cellule o tessuti umani primari, stabili in coltura per 4 settimane, e l'inclusione dell'architettura dei tessuti nativi e della risposta fisiologica.

Gli attuali modelli BC in vitro, come la coltura bidimensionale delle linee cellulari BC, la co-coltura dell'inserto a membrana e gli sferoidi tridimensionali e gli organoidi, non soddisfano i criteri delle MPS del NIH perché nessuno di questi riassume l'architettura nativa del tessuto mammario. Quando a questi sistemi viene aggiunta una matrice extracellulare (ECM), l'ECM mammario non viene utilizzato; invece, vengono utilizzati gel di collagene e matrici di membrana basale.

Gli attuali sistemi in vivo, come gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), allo stesso modo non soddisfano i criteri delle MPS del NIH perché i tessuti mammari murini differiscono notevolmente dal seno umano. Inoltre, le interazioni sistema immunitario-BC sono sempre più riconosciute come chiave nello sviluppo tumorale, ma i modelli murini immunocompro compromessi utilizzati per generare tumori PDX mancano di cellule T mature, cellule B e cellule natural killer. Inoltre, mentre pdx consente di mantenere ed espandere i tumori del seno primario, i tumori PDX risultanti vengono infiltrati con cellule stromali murine primarie e ECM5.

Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato una nuova MPS mammario umano tridimensionale, ex vivo, che soddisfa i criteri NIH MPS. Il fondamento della nostra MPS mammario è costituito dall'incastro del tessuto mammario umano primario (HBT) tra due fogli di cellule staminali derivate da adiposi (ASC), anche isolate dall'HBT(Figura 1). I pistoni per il trasferimento dei fogli cellulari per sandwich l'HBT può essere stampato in 3D o realizzato con semplici plastiche acriliche (Figura 1H, I). Questa tecnica adatta il nostro approccio precedentemente descritto per coltivare il tessuto adipocite bianco umano primario6,7. La MPS mammario può quindi essere seminata da un modello bc di scelta, che va dalle linee cellulari BC standard ai tumori al seno umani primari. Qui mostriamo che questi BC-MPS sono stabili in coltura per più settimane(Figura 2); includere elementi nativi dell'HBT come adipociti mammari, ECM, endotelio, cellule immunitarie (Figura 3); e ricapitolare le interazioni fisiologiche tra BC e HBT come il crosstalk metabolico (Figura 4). Infine, mostriamo che BC-MPS consente lo studio del movimento ameboide delle cellule BC in tutta l'HBT(Figura 5).

Protocollo

Tutti i tessuti umani sono stati raccolti in conformità con il protocollo #9189 approvato dall'Ufficio del Comitato di Revisione Istituzionale della LSUHSC.

1. Semina di cellule staminali derivate da adiposi (ASC) per fogli cellulari

  1. Acquistare ASC da fonti commerciali o isolare dal tessuto mammario umano primario seguendo i protocollistabiliti 8,9. Sementi di ASC mammari umani a densità del 70% (~80.000 cellule/cm2 superficie) su piastre di coltura tissutale standard a 6 porri nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 10% e 1% penicillina/streptomicina (BC-MPS Media). Assicurarsi che gli ASC da utilizzare per formare i fogli cellulari siano inferiori al passaggio 10.
    1. Per ogni pozzo del sistema microfisiologico del cancro al seno (BC-MPS) che verrà generato, cellule di semi in 1 pozzo di coltura tissutale standard e 1 pozzo di dimensioni simili su placca plastica di coltura tissutale rivestita in poli(N-isopropilacrylamide) (pNIPAAm). Una piastra da 6 pozzi di BC-MPS richiederà una coltura tissutale standard 6 piastra del pozzo (in basso) e una piastra rivestita con pNIPAAm (in alto). Le piastre pNIPAAm possono essere acquistate da fonti commerciali o possono essere rivestite in laboratorio10,11,12.
  2. ASC di coltura in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO2. Cambia i supporti ogni 2-3 giorni in un armadietto per la biosicurezza.
  3. Cultura gli ASC fino a diventare confluenti al 100% e formare un modello striato. A seconda della confluenza in cui sono stati seminati, ci saranno 7-10 giorni. I fogli cellulari confluenti sono necessari per ancorare il tessuto mammario adiposo vivace.

2. Preparazione delle forniture necessarie per BC-MPS

  1. Per preparare la gelatina per piatti a 6 porvili fare una soluzione di gelatina al 12% in H2O distillato. Mescolare 19 g di gelatina di tipo B (resistenza al gel di ~225 Bloom) e 125 ml di H2O in una bottiglia di supporto di vetro da 250 ml. Aggiungere 1,6 mL di 1 M NaOH alla soluzione per neutralizzare il pH.
  2. Autoclavare la soluzione sotto un ciclo liquido per 25 minuti per sterilizzare la soluzione.
  3. Lasciare raffreddare la soluzione a 37 °C. In un armadio sterile per la biosicurezza aggiungere 16 mL di soluzione di sale bilanciato sterile 10x Hanks (HBSS) alla soluzione per ottenere un volume finale di 160 mL.
    NOTA: La soluzione di gelatina può essere utilizzata immediatamente o conservata a temperatura ambiente per un uso successivo. La gelatina preparata è stabile a temperatura ambiente per 1 mese. Se saranno necessari solo pochi pistoni, è possibile realizzare una soluzione da 10 mL e filtrare sterilemente lo stesso giorno della realizzazione di BC-MPS come descrittoin precedenza 7.
    1. Per preparare la soluzione di gelatina mediante sterilizzazione del filtro, diluire 1 ml di 10x HBSS con 9 ml di H2O per fare una soluzione DI HBSS 1x in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 100 μL di 1 M NaOH a ciascun tubo da 10 ml, quindi aggiungere 0,7 g di gelatina alla soluzione. Mescolare vigorosamente la soluzione per sciogliere la gelatina.
    2. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 75 °C per 20 minuti tremando ogni 5 minuti. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro siringa da 0,22 μm per filtrare la soluzione di gelatina. Filtrare la soluzione di gelatina direttamente sui pistoni in un armadio per la biosicurezza.
  4. Stampa 3D o utilizzare un semplice acrilico per realizzare i pistoni utilizzati per il trasferimento dei fogli cellulari. Assicurarsi che i pistoni si adattino liberamente alla dimensione desiderata del pozzo. Un pistone stampato in 3D standard è mostrato nella figura 1. Gli stantuffo possono essere progettati utilizzando software di progettazione standard attrezzato per computer come TinkerCad e stampati utilizzando stampanti 3D a filamento compatibili con l'acido polilattico (PLA)13,14.
  5. Per preparare un rack per tenere i pistoni posizionare un rack per tubi da 15 ml in un armadio per la biosicurezza. Posizionare i pistoni a testa in giù nel rack, in modo che il fondo dei pistoni sia rivolto verso l'alto. Posizionare una scatola di plastica con un coperchio per il trasporto di BC-MPS nell'armadio per la biosicurezza. Si consiglia di che la scatola sia lunga almeno 35,5 cm x 28 cm di larghezza x 8,25 cm di altezza per adattarsi a 4 piastre di BC-MPS. Rimuovere il coperchio dalla scatola e spruzzare il rack, i pistoni e la scatola con 70% EtOH.
  6. Preparare lamette e forcep sterili in autoclave o mettendole in un armadio di biosicurezza e lavandole con 70% EtOH.
  7. Spruzzare i pistoni e la scatola con 70% EtOH e accendere la luce UV nell'armadio di biosicurezza per almeno 30 minuti per sterilizzare le forniture.

3. Preparare i pistoni di gelatina e applicare sui fogli delle cellule superiori

  1. Se la soluzione di gelatina è stata preparata in precedenza, scaldarla in un bagno d'acqua a 37 ° C per scioglierla.
  2. Pipettare la soluzione di gelatina sugli stantuffo nell'armadio di biosicurezza utilizzando una pipetta sierologica da 5 o 10 mL. Uno stantuffo per 1 pozzo di una piastra da 6 po 'richiederà ~ 2,5 mL di gelatina.
  3. Una volta che la gelatina si è solidificata sui pistoni (~ 30-45 min) spostare le piastre ASC rivestite con pNIPAAm nell'armadio di biosicurezza. Posizionare delicatamente i pistoni nei pozzi delle piastre ASC rivestite con pNIPAAm in modo che la gelatina contatti gli ASC. Posizionare una rondella metallica (~7,5 g) sullo stantuffo per appesantire lo stantuffo in modo che la gelatina sia a diretto contatto con la lastra cellulare ASC. Lasciare i pistoni sui fogli cellulari ASC a temperatura ambiente per 30 minuti.
  4. Spostare delicatamente la piastra con i pistoni nella scatola sterile nell'armadio di biosicurezza e posizionare il coperchio su di esso. Spostare la scatola in un frigorifero a 4 °C per 30 minuti. Se non è disponibile un frigorifero a 4 °C, posizionare la piastra sul ghiaccio in un secchio di ghiaccio nell'armadio per la biosicurezza per 30 minuti.

4. Preparazione delle linee cellulari tumorali

  1. Sementi le linee cellulari tumorali in un piatto standard di coltura tissutale T75 e tienile in coltura in modo che siano ~80% confluenti il giorno in cui BC-MPS verrà elaborato. (~200.000 cellule tumorali saranno necessarie per BC-MPS). Far crescere le cellule tumorali nei media normali.
    NOTA: Per identificare e isolare le cellule tumorali si raccomanda che le cellule siano trasfette da una proteina fluorescente per distinguerle dagli ASC e dal tessuto mammario. Il numero di cellule tumorali necessarie per BC-MPS è stato ottimizzato per le cellule MCF7 e MDA-MB-231. Altre linee cellulari potrebbero richiedere un'ulteriore ottimizzazione.
  2. Il giorno in cui la BC-MPS è in fase di preparazione spostare il pallone contenente le cellule tumorali nell'armadietto della biosicurezza. Aspirare il supporto dal pallone. Lavare il pallone con 5 ml di PBS.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco cellulare al pallone contenente le cellule tumorali e quindi incubare il pallone in un incubatore di 37 °C fino a quando le cellule non si sono staccate (~ 2-5 min).
  4. Nell'armadio della biosicurezza aggiungere 9 ml di PBS al pallone, trasferire le cellule in PBS in un tubo conico da 15 ml e contare il numero di cellulare usando un emocitometro.
  5. Centrifugare le cellule tumorali a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Rimosoppo le celle nei supporti BC-MPS in modo che ci siano 2 x 106 celle/mL.
  7. Mettere le cellule tumorali in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando non sono pronte per essere aggiunte al tessuto umano.

5. Trattamento del tessuto mammario umano

  1. In un armadio di biosicurezza lavare il tessuto mammario umano (HBT) 3x con 10 mL di PBS sterile.
  2. Utilizzare forcelle sterili e una lama di rasoio per tritare grossolanamente la BC-MPS e cercare di rimuovere quanta più fascia e tessuto connettivo possibile. La mancata rimozione del tessuto connettivo può comportare che lo strato superiore asc non ancora correttamente l'HBT.
    NOTA: La fascia e il tessuto connettivo possono essere identificati dal suo aspetto bianco o chiaro rispetto al colore giallo del tessuto adiposo.
  3. Una volta rimosso il tessuto connettivo, utilizzare una lama di rasoio sterile per tritare finemente il tessuto fino a quando non ha una consistenza liquida omogenea. Il tessuto viene tritato finemente quando può essere facilmente pipettato utilizzando una punta sierologica da 25 mL.
  4. Utilizzare una lama sterile per tagliare la punta da una punta della pipetta p1000 per facilitare la pipetta dell'HBT tritato.
  5. In un tubo da 1,5 ml mescolare l'HBT tritato, le linee cellulari tumorali e i supporti BC-MPS (per 1 pozzo di una piastra di 6 pozzetti questo richiede 200 μL di HBT tritato, 100 μL di supporti BC-MPS e 100 μL di cellule tumorali).
  6. Spostare la piastra ASC che verrà utilizzata per il foglio di cellule inferiori dall'incubatore all'armadio di biosicurezza. Aspirare il supporto dalla piastra ASC inferiore. Pipettare la miscela al centro del pozzo della piastra ASC inferiore utilizzando una punta di pipetta p1000 con l'estremità distale tagliata dal passo 5.4
  7. Spostare la scatola contenente la piastra ASC superiore con i pistoni su di essa nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere delicatamente i pistoni di gelatina dalla piastra rivestita con pNIPAAm e posizionarla sopra la miscela HBT. Aggiungere i supporti BC-MPS al pozzo (per 1 pozzo di una piastra a 6 porsi aggiungere 2 mL di supporti). Spostare con cura le piastre ASC inferiori con la miscela BC-MPS e i pistoni nella scatola di plastica sterile e posizionare il coperchio della scatola per il trasporto.
    NOTA: Il coperchio della piastra a 6 po porsi non si adatta di nuovo alla piastra ASC mentre i pistoni sono su. Occorre fare attenzione ad evitare di contaminare la cultura.
  8. Incubare la piastra inferiore nella scatola in un'incubatrice a 37 ° C fino a quando la gelatina non si è sciolta e lo strato ASC superiore ha iniziato ad aderire allo strato inferiore (~ 30 min).
  9. Spostare la scatola con le piastre nell'armadio per la biosicurezza. Rimuovere delicatamente i pistoni dalle piastre inferiori. Il tessuto con le cellule tumorali sarà ancorato al fondo del pozzo.
  10. Riposizionare il coperchio della piastra a 6 pozzi sulla piastra inferiore e incubare a 37 °C per sciogliere completamente la gelatina e consentire allo strato superiore di ancorarsi completamente allo strato inferiore (~ 30-60 min).
  11. Spostare delicatamente le piastre in un armadio di biosicurezza e aspirare il supporto con una pipetta sierologica da 10 mL. Aggiungere 2 mL di supporti freschi ad ogni pozzo. Aspirare dal bordo del pozzo e pipettare sul bordo del pozzo per evitare di slogare il tessuto.
  12. Mantenere il BC-MPS a 37 °C e 5% CO2 per il periodo di tempo desiderato e cambiare supporto ogni 2-3 giorni.

6. Digestione di BC-MPS per l'analisi

  1. Quando il BC-MPS è pronto per essere analizzato, spostare la piastra nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere i supporti con una pipetta sierologica per evitare lo slogaggio accidentale di qualsiasi tessuto.
  2. Aggiungere 1 volume di PBS a ciascun pozzo.
  3. Rimuovere il PBS con una pipetta sierologica.
  4. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare ad ogni pozzo. Spostare la piastra di nuovo nell'incubatrice e incubare a 37 °C per 5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi. In un armadio di biosicurezza, utilizzare un raschietto cellulare per staccare completamente le cellule e il tessuto dalla piastra di coltura.
  5. Trasferire la soluzione con il tessuto in un tubo conico da 15 ml utilizzando una pipetta sierologica. Aggiungere 2 ml di PBS ad ogni pozzo per raccogliere tutte le celle rimanenti e trasferire questa soluzione al tubo conico. Se le celle sono fluorescenti, avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
  6. Incubare il tubo a 37 °C sotto agitazione costante in uno shaker orbitale a 1 x g per 10-20 minuti per dissociare completamente le cellule dal tessuto.
  7. In un armadio di biosicurezza utilizzare una pipetta sierologica per interrompere eventuali grumi di cellule rimanenti nel tubo e filtrare il campione attraverso un colino tissutale da 250 μm in un nuovo tubo da 15 ml. Pipettare lentamente la soluzione attraverso il colino in modo che non trabocca.
  8. Risciacquare il colino con 1 mL PBS per raccogliere tutte le cellule ancora nel colino.
  9. Centrifugare i campioni a 500 x g a temperatura ambiente per 5 min. Dopo la centrifugazione, gli adipociti galleggiano sullo strato superiore della soluzione mentre le cellule tumorali e gli ASC saranno mescolati insieme in un pellet nella parte inferiore del tubo.
  10. Per isolare gli adipociti versare delicatamente lo strato superiore in un nuovo tubo o, in alternativa, tagliare la punta da una punta della pipetta p1000 e trasferire lo strato superiore su un nuovo tubo. Centrifugare nuovamente il campione a 500 x g per 5 minuti e utilizzare una siringa e un ago per rimuovere la soluzione dal basso degli adipociti in modo che rimangano solo gli adipociti. Gli adipociti sono ora pronti per l'analisi
  11. Dopo aver rimosso gli adipociti dalla soluzione, separare gli ASC e le cellule tumorali l'uno dall'altro per l'analisi se le cellule tumorali sono state precedentemente trasfette con una proteina fluorescente. Aspirare la soluzione rimanente dal tubo contenente gli ASC e le cellule tumorali senza interrompere il pellet cellulare. Risospendare il pellet nei supporti PBS o BC-MPS e utilizzare la citometria del flusso per ordinare le cellule in base alla fluorescenza.

Risultati

Stabilità nella cultura
BC-MPS è un sistema microfisiologico stabile che può essere coltivato in vitro per un massimo di almeno 14 giorni. Un'immagine a campo luminoso dei fogli cellulari ASC è stata scattata con ingrandimento 100x per visualizzare il modello striato del foglio confluente (Figura 2A). I fogli cellulari ASC sono stabili in coltura per almeno 4 settimane. BC-MPS a 14 giorni di coltura in un pozzo di una piastra a 6 poggi...

Discussione

Sono necessari nuovi sistemi per modellare il cancro al seno umano per sviluppare una migliore comprensione della malattia. Lo sviluppo di sistemi microfisiologici umani per modellare le impostazioni delle malattie che includono ECM nativo e cellule stromali aumenterà il potere predittivo degli studi preclinici. Il modello BC-MPS qui presentato è un sistema di nuova sviluppo che supera i limiti dei modelli precedenti consente la valutazione di BC nel suo ambiente HBT nativo. Questo sistema può essere utilizzato con li...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare il Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core e il Tulane Histology Core per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant e dalla National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AccumaxInnovative Cell Technologies1333Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
AccutaseCorning25-058-CICell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16ozNational Scientific Supply CoMPCE-T016For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasksCorning430641UFor culturing ASCs
Conical Tubes 15mL ThermoScientific339650
Curved ForcepsThermoScientific1631T5For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ GlutamaxGibco10567-014For culturing ASCs and BC-MPS
FBS QualifiedGibco26140-079
GelatinSigmaG9391
HBSS 10xGibco14185-052
NaOHSigma221465
Nunc UpCell 6 well platesThermoScientific174901Top ASC cell sheet
PBSGibco10010-023
Pen/Strep 5,000UGibco15070-063
Petri Dish 150 cmFisherBrandFB0875714For holding tissue while mincing 
Razor BladesVWR55411-055Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um ThermoScientific87791For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well platesCorning3506Bottom ASC cell Sheet
Weights/WashersBCP FastenersBCP672For weighing plungers down 1/2" inner diameter

Riferimenti

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