Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo

Riepilogo

Forniamo un protocollo passo-passo per la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) nei cuori murini.

Abstract

Il segnale elettrico fisiologicamente generato dalle cellule pacemaker nel nodo senoatriale (SAN) viene condotto attraverso il sistema di conduzione, che include il nodo atrioventricolare (AVN), per consentire l'eccitazione e la contrazione di tutto il cuore. Qualsiasi disfunzione di SAN o AVN provoca aritmie, indicando il loro ruolo fondamentale nell'elettrofisiologia e nell'aritmogenesi. I modelli murini sono ampiamente utilizzati nella ricerca sull'aritmia, ma l'indagine specifica su SAN e AVN rimane impegnativa.

Il SAN si trova alla giunzione della crista terminalis con la vena cava superiore e l'AVN si trova all'apice del triangolo di Koch, formato dall'orifizio del seno coronarico, dall'anulus tricuspide e dal tendine di Todaro. Tuttavia, a causa delle dimensioni ridotte, la visualizzazione mediante istologia convenzionale rimane impegnativa e non consente lo studio di SAN e AVN all'interno del loro ambiente 3D.

Qui descriviamo un approccio di immunofluorescenza a montaggio intero che consente la visualizzazione locale di SAN e AVN di topo marcati. La colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero è destinata a sezioni più piccole di tessuto senza la necessità di sezionamento manuale. A tale scopo, il cuore del topo viene sezionato, con tessuto indesiderato rimosso, seguito da fissazione, permeabilizzazione e blocco. Le cellule del sistema di conduzione all'interno di SAN e AVN vengono quindi colorate con un anticorpo anti-HCN4. La microscopia a scansione laser confocale e l'elaborazione delle immagini consentono la differenziazione tra cellule linfonodali e cardiomiociti funzionanti e di localizzare chiaramente SAN e AVN. Inoltre, ulteriori anticorpi possono essere combinati per marcare anche altri tipi di cellule, come le fibre nervose.

Rispetto all'immunoistologia convenzionale, la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero preserva l'integrità anatomica del sistema di conduzione cardiaca, consentendo così l'indagine dell'AVN; soprattutto nella loro anatomia e nelle interazioni con le cellule del miocardio e non miociti circostanti.

Introduzione

Le aritmie sono malattie comuni che colpiscono milioni di persone e sono la causa di una significativa morbilità e mortalità in tutto il mondo. Nonostante gli enormi progressi nel trattamento e nella prevenzione, come lo sviluppo di pacemaker cardiaci, il trattamento delle aritmie rimane impegnativo, principalmente a causa delle conoscenze molto limitate sui meccanismi della malattia sottostante ^1,2,3. Una migliore comprensione sia dell'elettrofisiologia normale che della fisiopatologia delle aritmie può aiutare a sviluppare strategie di trattamento nuove, innovative e causali in futuro. Inoltre, per studiare in modo completo l'aritmogenesi, è importante localizzare e visualizzare il sistema di conduzione cardiaca specifico in modelli animali come il topo, poiché i topi sono ampiamente utilizzati nella ricerca elettrofisiologica.

Le parti principali del sistema di conduzione cardiaca sono il nodo senoatriale (SAN), dove l'impulso elettrico viene generato in cellule pacemaker specializzate, e il nodo atrioventricolare (AVN), che è l'unica connessione elettrica tra gli atri e i ventricoli⁴. Ogni volta che le proprietà elettrofisiologiche di SAN e AVN sono alterate, possono verificarsi aritmie come la sindrome del seno malato o il blocco atrioventricolare che possono portare al deterioramento emodinamico, alla sincope e persino alla morte, sottolineando così il ruolo essenziale di SAN e AVN nell'elettrofisiologia e nell'aritmogenesi⁵.

Studi completi su SAN o AVN richiedono una localizzazione e una visualizzazione precise di entrambe le strutture, idealmente all'interno del loro ambiente fisiologico. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni e della loro posizione all'interno del miocardio funzionante, senza stabilire una chiara struttura macroscopicamente visibile, studiare l'anatomia e l'elettrofisiologia di SAN e AVN è impegnativo. I punti di riferimento anatomici possono essere utilizzati per identificare approssimativamente la regione che contiene SAN e AVN ^6,7,8. In breve, la SAN si trova nella regione inter-cavale dell'atrio destro adiacente alla crista terminale muscolare (TC), l'AVN si trova all'interno del triangolo di Koch stabilito dalla valvola tricuspide, dall'ostio del seno coronarico e dal tendine di Todaro. Finora, questi punti di riferimento anatomici sono stati utilizzati principalmente per localizzare, rimuovere e quindi studiare SAN e AVN come strutture individuali (ad esempio, mediante istologia convenzionale). Per comprendere meglio la complessa elettrofisiologia di SAN e AVN (ad esempio, gli effetti regolatori delle cellule adiacenti del miocardio funzionante), tuttavia, è necessario studiare i sistemi di conduzione all'interno dell'ambiente fisiologico 3D.

La colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero è un metodo utilizzato per studiare le strutture anatomiche in situ preservando l'integrità del tessuto circostante⁹. Sfruttando la microscopia confocale e il software di analisi delle immagini, SAN e AVN possono essere visualizzati con anticorpi marcati con fluorescenza che prendono di mira i canali ionici specificamente espressi in queste regioni.

Questo protocollo seguente spiega i passaggi necessari per eseguire un metodo di colorazione a montaggio intero consolidato per la localizzazione e la visualizzazione del microscopio SAN e AVN. In particolare, questo protocollo descrive come (1) localizzare SAN e AVN in base a punti di riferimento anatomici per preparare questi campioni per la colorazione e l'analisi al microscopio (2) eseguire la colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero dei marcatori di riferimento HCN4 e Cx43 (3) preparare campioni SAN e AVN per la microscopia confocale (4) eseguire l'imaging confocale di SAN e AVN. Descriviamo anche come questo protocollo può essere modificato per includere un'ulteriore colorazione delle cellule miocardiche o non miocitarie circostanti come le fibre nervose autonome che consentono un'indagine approfondita del sistema di conduzione cardiaca all'interno del cuore.

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Protocollo

La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del comitato per la cura e l'etica degli animali dell'Università di Monaco e tutte le procedure intraprese sui topi sono state approvate dal governo della Baviera, Monaco, Germania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). I topi C57BL6/J sono stati acquistati dal Jackson Laboratory.

NOTA: la Figura 1 mostra gli strumenti necessari per l'esperimento. La figura 2 mostra un'illustrazione dell'anatomia cardiaca grossolana. La Figura 3 mostra la posizione di SAN e AVN in un cuore di topo adulto. La figura 4 mostra il campione preparato caricato sulla microscopia confocale.

1. Preparativi

1. Preparare una soluzione di formaldeide al 4% (PFA al 4%) diluendo 10 ml di soluzione di formaldeide al 16% in 30 ml di PBS.
2. Preparare una soluzione di saccarosio al 15% e una soluzione di saccarosio al 30% sciogliendo rispettivamente 15 g e 30 g di polvere di saccarosio in 100 ml di PBS. Dopo che la polvere di saccarosio è completamente sciolta, filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,2 μm prima di conservare a 4 °C.
3. Preparare un gel di agarosio al 3% -4%, aggiungere 3 g o 4 g di polvere di agarosio e 100 ml di 1x TAE (diluito da 50x soluzione madre TAE) in un becher. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e farlo bollire fino a quando l'agarosio è completamente sciolto.
4. Preparare il piatto di dissezione versando delicatamente 30 ml di gel di agarosio (3% -4%) in una capsula di Petri da 100 mm di diametro. Lasciare la capsula di Petri sul banco a temperatura ambiente per raffreddare e indurire.
5. Preparare la soluzione bloccante e la soluzione di lavaggio secondo le ricette fornite nella Tabella 1. Preparare tutte le soluzioni preparate il giorno dell'uso. L'archiviazione a lungo termine non è raccomandata.
6. Preparare le soluzioni anticorpali diluendoli a freddo (4 °C) 1x PBS, proteggere la diluizione dalla luce (ad esempio, avvolgendo un foglio di alluminio) e mantenere le diluizioni su ghiaccio fino all'uso. Diluire gli anticorpi poco prima dell'incubazione. Evitare di lasciare gli anticorpi diluiti a temperatura ambiente.
   NOTA: La diluizione anticorpale appropriata deve essere testata con campioni di tessuto comparabili eseguendo una colorazione immunofluorescente convenzionale. Qui, abbiamo testato gli anticorpi colorando sezioni congelate tagliate a uno spessore di 10 μm.

2. Prelievo di organi e preparazione dei tessuti

1. Anestetizzare il topo mettendolo in una camera di incubazione collegata ad un vaporizzatore di isoflurano. Impostare il vaporizzatore in modo da fornire il 4-5% di isoflurano (96-95% di ossigeno, rispettivamente).
   NOTA: L'anestesia completa è confermata dalla perdita della reazione posturale e del riflesso raddrizzante ruotando delicatamente la camera fino a quando il mouse non viene posizionato sul dorso.
2. Metti il mouse in posizione supina sul tavolo chirurgico. Inserire il naso del topo in una maschera per anestesia collegata a un circuito Bain modificato con la camera d'aria collegata al vaporizzatore isoflurano. Per mantenere l'anestesia, utilizzare l'isoflurano all'1-2% nell'ossigeno ad una portata di 1 L / min. Eliminare il vapore anestetico in eccesso dal mouse attraverso il tubo esterno della maschera e aspirare attraverso un contenitore di carbone attivo, che assorbe il gas anestetico in eccesso.
3. Una volta ottenuta l'anestesia completa, iniettare fentanil per l'analgesia (0,1 μg/25 g di peso corporeo i.p.).
4. Quando il riflesso del pizzico del piede non è rilevabile, fai un taglio netto dal giugulo alla sinfisi usando le forbici dell'iride per rimuovere la pelliccia e la pelle. Fai un altro taglio da sinistra a destra sotto le costole usando le forbici dell'iride per aprire con cura l'addome.
5. Vivi un po 'lo xifoide usando una pinza curva per consentire di tagliare il diaframma da sinistra a destra senza ferire alcun organo. Tagliare la gabbia toracica in una linea ascellare mediale su entrambi i lati usando le forbici dell'iride per capovolgerla cranicamente e consentire l'accesso al cuore.
6. Tagliare la vena cava inferiore e l'aorta toracica discendente a livello del diaframma usando le forbici dell'iride. Forare il cuore con un ago da 27 Gnella zona dell'apice e quindi spingere con attenzione l'ago nel ventricolo sinistro (LV). Iniettare delicatamente 5-10 ml di PBS ghiacciato nel ventricolo sinistro per perfondere il cuore.
   NOTA: Il colore del cuore dovrebbe passare dal rosso al grigio indicando una perfusione riuscita con PBS.
7. Sollevare con attenzione l'apice del cuore usando una pinzetta che consente di tagliare i grandi vasi e di rimuovere il cuore.
8. Asportare il cuore tagliando le grandi arterie e vene il più lontano possibile dal cuore per evitare danni alla vena cava superiore (SVC). Conservare lo SVC poiché servirà come punto di riferimento importante durante la lavorazione successiva.
9. Dopo la rimozione del cuore, spegnere il vaporizzatore isoflurano.
10. Metti il cuore in un piatto di dissezione pieno di PBS ghiacciato al microscopio da dissezione. Dopo aver determinato la parte sinistra / destra e anteriore / posteriore del cuore, girare il cuore con la parte anteriore del cuore nella parte inferiore del piatto (per esporre i grandi vasi che si trovano posteriormente).
11. Immobilizzare il cuore mettendo piccoli spilli attraverso l'apice e l'appendice atriale sinistra (LAA) nell'agarosio sul fondo del piatto di dissezione (Figura 2A). Utilizzando pinzette sottili e forbici, rimuovere con attenzione il tessuto non cardiaco attorno alla SVC e alla vena cava inferiore (IVC) (ad esempio, polmoni, grasso, pericardio) per esporre la regione inter-cavale (Figura 3A).
12. Rimuovere la maggior parte dei ventricoli tagliando parallelamente la scanalatura tra i ventricoli e gli atri con la micro forbice. Conservare una piccola parte del tessuto ventricolare per il successivo carico sull'anello di plexiglas.
13. Per la fissazione e la disidratazione, mettere il campione (contenente gli atri, SVC e IVC) in PFA al 4% per una notte a 4 °C.
14. Il giorno successivo, trasferire il cuore in una soluzione di saccarosio al 15% per 24 ore a 4 °C.
15. Il giorno successivo, trasferire il cuore in soluzione di saccarosio al 30% per 24 ore a 4 °C.
    NOTA: Per la fissazione e la disidratazione nei punti 2.13, 2.14 e 2.15, i campioni vengono lasciati a 4°C senza ulteriore agitazione o oscillazione.

3. Colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero

1. Lavare il cuore in Triton X-100 all'1% diluito in PBS e bloccare e permeabilizzare in soluzione bloccante (Tabella 1) per una notte a 4 °C.
2. Porre il cuore in una provetta da 1,5 mL e incubare con anticorpi coniglio anti-topo connessina-43 (diluizione di 1:200) e HCN4 anti-topo di ratto (diluizione di 1:200) diluiti con soluzione bloccante per 7 giorni a 4 °C.
   NOTA: La concentrazione ottimale di anticorpi primari deve essere testata prima di utilizzare le schede tecniche come orientamento. Anche altri antigeni di interesse potrebbero essere colorati in questa fase, purché la specie ospite dell'antigene primario sia diversa dagli altri. Una maggiore concentrazione di Triton X-100 può aiutare a ottenere una colorazione anticorpale più efficiente come dimostrato prima di¹⁰, ma la concentrazione potrebbe essere determinata individualmente.
3. Dopo 7 giorni, rimuovere la soluzione contenente anticorpi primari usando una pipetta e lavare il cuore con la soluzione di Triton X-100 all'1% 3 volte (ogni volta per 1 ora a temperatura ambiente sullo shaker orbitale).
4. Dopo il lavaggio, incubare il cuore = con Alexa Fluor 488 capra anti-ratto IgG (diluizione di 1:200) e Alexa Fluor 647 capra anti-coniglio IgG (diluizione di 1:200) per 7 giorni a 4 °C.
5. Dopo 7 giorni, rimuovere tutta la soluzione contenente gli anticorpi secondari usando una pipetta. Quindi lavare il cuore usando la soluzione di lavaggio (Tabella 1) 3 volte (ogni volta per 1 ora a temperatura ambiente sullo shaker orbitale).
6. Per colorare i nuclei, incubare il cuore in soluzione DAPI (10 μg/ml) per una notte a 4 °C.
7. Il giorno successivo, lavare il cuore con soluzione di lavaggio 3 volte (ogni volta per 1 ora a temperatura ambiente sullo shaker orbitale).
   NOTA: Per il blocco, la permeabilizzazione, l'incubazione degli anticorpi e la colorazione DAPI nei punti 3.1, 3.2, 3.4 e 3.6, lasciare i campioni allo stato stazionario a 4 °C, non è necessaria alcuna agitazione. Il tessuto colorato potrebbe essere conservato completamente coperto con una soluzione di lavaggio a 4 °C e protetto dalla luce per alcuni giorni fino all'imaging al microscopio confocale.

4. Microscopia confocale

1. Preparare anelli di plexiglas e riempirli con plastilina (Figura 1). Al centro della plastilina si forma un piccolo solco al centro per caricare il cuore. Creare una scanalatura poco profonda, poiché sarebbe più facile acquisire un piano di imaging piatto e regolare lo spazio ed evitare bolle d'aria tra il campione e i vetrini di copertura nel passaggio 4.4.
2. Utilizzare lo stesso campione cardiaco per l'imaging di SAN e AVN in sequenza. Per l'imaging SAN, caricare direttamente il cuore mentre per l'imaging AVN, eseguire prima la microdissezione.
   1. Imaging SAN
      1. Identificare il SAN da punti di riferimento anatomici: si trova sul lato dorsale del cuore all'interno della regione inter-cavale (la regione tra la vena cava superiore e inferiore). La crista terminalis (CT) è la striscia muscolare tra SAN e RAA.
      2. Posizionare il cuore nella scanalatura della plastilina con la parte posteriore del cuore rivolta verso l'alto. Aggiungere PBS sul cuore per spostare tutta l'aria all'interno della cavità fino a quando il cuore è completamente coperto di PBS (di solito sono sufficienti poche gocce di PBS).
      3. Sotto il microscopio a dissezione, premere delicatamente RAA, LAA e le parti rimanenti del ventricolo sinistro nella plastilina per fissare il cuore. Assicurarsi che l'intera regione inter-cavallica e la crista terminalis possano essere chiaramente visibili (non coperte da plastilina). L'area che verrà ripresa è mostrata nella Figura 3A.
   2. Imaging AVN
      1. Dopo aver terminato l'imaging di SAN, raccogliere lo stesso campione e successivamente utilizzarlo per l'imaging AVN. Per la microdissezione AVN, posizionare il cuore = su un piatto di dissezione sotto il microscopio da dissezione.
      2. Orientare il cuore con il lato destro rivolto verso l'alto (comprese le parti rimanenti del ventricolo destro). Mettere dei perni attraverso la parte rimanente della parete libera LV (che ora si trova nella parte inferiore) per immobilizzare il tessuto (Figura 2B).
      3. Tagliare la parete libera RV rimanente verso l'alto attraverso la valvola tricuspide e la vena cava superiore. Quindi capovolgere il RV e l'AR per esporre il setto interventricolare e interatriale. (Figura 3B)
         NOTA: Prestare attenzione a non danneggiare il seno coronarico (CS), in quanto è un importante punto di riferimento anatomico trovare il triangolo di Koch che permette quindi di localizzare l'AVN. Il CS scorre trasversalmente nel solco atrioventricolare sinistro sul lato posteriore del cuore e l'apertura dell'orifizio CS si trova tra IVC e la valvola tricuspide nella parte inferiore del setto interatriale (Figura 3A e B).
      4. Identificare il triangolo di Koch che si trova sulla superficie endocardica dell'atrio destro, delimitato anteriormente dalla linea cerniera del foglietto settale della valvola tricuspide (TV) e posteriormente dal tendine di Todaro. La base è formata dall'orifizio del seno coronarico (Figura 3B). Poiché questa è la regione di destinazione per l'imaging AVN, deve essere chiaramente visibile.
      5. Trasferire il cuore nella scanalatura della plastilina all'interno dell'anello di plexiglas con il triangolo di Koch chiaramente esposto (cioè non coperto da plastilina). Premere delicatamente il tessuto attorno al triangolo di Koch nella plastilina per fissare il campione. Aggiungere PBS sul cuore per spostare tutta l'aria all'interno della cavità fino a quando il cuore è completamente coperto di PBS (di solito sono sufficienti poche gocce di PBS).
3. Applicare il silicone sui bordi degli anelli in plexiglas per permettere di coprire i cuori caricati all'interno degli anelli in plexiglas riempiti di plastilina con slip di copertura.
4. Premere delicatamente il lato posteriore della plastilina per spremere parti del PBS e per attaccare il cuore al vetrino evitando bolle d'aria all'interno dell'area di imaging.
   NOTA: Assicurarsi che le regioni di interesse non siano piegate e coperte durante la pressione sul lato posteriore della plastilina. Un piano di imaging piatto senza sovracompressione del campione è necessario per conservare l'anatomia e per una corretta imaging confocale dei campioni. Per SAN, è importante assicurarsi che la regione inter-cavale sia chiaramente esposta. Per AVN, il triangolo di Koch dovrebbe essere completamente esposto.
5. Mettere i campioni di colorazione a montaggio intero capovolti sulla piattaforma del microscopio confocale. La SAN/AVN esposta attaccata al vetrino di copertura si trova ora sul fondo della piattaforma del microscopio (Figura 4).
   NOTA: Per scattare immagini, utilizziamo il Carl Zeiss LSM800 con Airyscan Unit e il software ZEN 2.3 SP1 nero.
6. Scegli la piastra "BP420-480 + LP605" per l'eccitazione di Alexa Fluor 647 coniugato anti-HCN4. Variare il guadagno master da 650-750.
7. Acquisire un'immagine panoramica dell'intera regione SAN e AVN utilizzando la funzione Tile Scan . Quindi selezionare la regione HCN4-positiva facendo clic e aggiungendo un quadrato sull'immagine panoramica intorno all'area di interesse che verrà scansionata.
8. Controllare i parametri, comprese le piastre e il guadagno master per i canali rimanenti (Alexa Fluor 488 e DAPI) del microscopio confocale e impostarli come descritto al punto 4.6.
9. Regolare lentamente lo stato attivo dall'alto verso il basso del campione per visualizzare in anteprima l'intero campione e impostare il primo e l'ultimo per l'intervallo Z-stack. Impostare un intervallo ottimale per lo stack Z in base allo spessore del campione ottico. Usiamo un obiettivo 20x e 0,8-1 μm come intervallo per Z-stack.
10. Dopo aver impostato correttamente tutti i parametri, eseguire la scansione dell'intera area della SAN e dell'AVN.
11. Eseguire la ricostruzione 3D delle immagini utilizzando un software (ad esempio, Imaris versione 8.4.2).
    1. Seleziona l'elaborazione delle immagini | Sottrazione della linea di base per rimuovere la colorazione dello sfondo.
    2. Selezionate Creazione superficie sull'impostazione per il canale selezionato e la regione di interesse per l'elaborazione.

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Risultati

Utilizzando il protocollo sopra descritto, è possibile eseguire in modo affidabile l'imaging al microscopio confocale di SAN e AVN. La colorazione specifica del sistema di conduzione utilizzando anticorpi fluorescenti mirati a HCN4 e la colorazione del miocardio funzionante utilizzando anticorpi fluorescenti mirati a Cx43 consente la chiara identificazione di SAN (Figura 5, Video 1) e AVN (Figura 6, Video 2) all...

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Discussione

L'anatomia cardiaca è stata tradizionalmente studiata utilizzando sezioni istologiche sottili¹¹. Tuttavia, questi metodi non preservano la struttura tridimensionale del sistema di conduzione e, quindi, forniscono solo informazioni 2D. Il protocollo di colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero qui descritto consente di superare queste limitazioni e può essere utilizzato di routine per l'imaging SAN e AVN.

Rispetto ai metodi standard come l'immunoistochimica...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent Scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL	Eppendorf	Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	VWR	10836-004
Laser Scanning Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Software
Imaris 8.4.2	Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black	Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	Sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	Falcon	352070
5ml Syringe	Braun	4606108V
Cover slips	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	Components of TEA
16% Formaldehyde Solution	Thermo Scientific	28908	use as a 4% solution
Acetic acid	Merck	100063	Components of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Sucrose	Sigma	S1888-1kg
Tris-base	Roche	TRIS-RO	Components of TEA
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	Diluted to 1% in PBS
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL	Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
Oxygen 5 L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Cell Signaling Technology	#4412	diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647	Invitrogen	#A-21247	diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43	Sigma	C6219	diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)	Invitrogen	MA3-903	diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring			Self-designed and 3D printed
Plasticine	Cernit	49655005
Silikonpasten, Baysilone	VWR	291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6	The Jackson Laboratory