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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Gli R-loop costituiscono una classe prevalente di strutture di DNA non-B guidate dalla trascrizione che si verificano in tutti i genomi a seconda sia della sequenza del DNA che della preferenza topologica. Negli ultimi anni, gli R-loop sono stati implicati in una varietà di ruoli adattivi e disadattivi e sono stati collegati all'instabilità genomica nel contesto dei disturbi umani. Di conseguenza, la mappatura accurata di queste strutture nei genomi è di grande interesse per molti ricercatori. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) è descritto qui. Si tratta di una tecnica robusta e riproducibile che consente una mappatura accurata e semiquantitativa dei loop R. Viene anche descritta una recente iterazione del metodo in cui la frammentazione viene realizzata utilizzando la sonicazione (sDRIP-seq), che consente la mappatura specifica del filamento e ad alta risoluzione dei loop R. sDRIP-seq affronta quindi alcune delle limitazioni comuni del metodo DRIP-seq in termini di risoluzione e incagliamento, rendendolo un metodo di scelta per la mappatura R-loop.

Abstract

Gli R-loop costituiscono una classe prevalente di strutture di DNA non-B guidate dalla trascrizione che si verificano in tutti i genomi a seconda sia della sequenza del DNA che della preferenza topologica. Negli ultimi anni, gli R-loop sono stati implicati in una varietà di ruoli adattivi e disadattivi e sono stati collegati all'instabilità genomica nel contesto dei disturbi umani. Di conseguenza, la mappatura accurata di queste strutture nei genomi è di grande interesse per molti ricercatori. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) è descritto qui. Si tratta di una tecnica robusta e riproducibile che consente una mappatura accurata e semiquantitativa dei loop R. Viene anche descritta una recente iterazione del metodo in cui la frammentazione viene realizzata utilizzando la sonicazione (sDRIP-seq), che consente la mappatura specifica del filamento e ad alta risoluzione dei loop R. sDRIP-seq affronta quindi alcune delle limitazioni comuni del metodo DRIP-seq in termini di risoluzione e incagliamento, rendendolo un metodo di scelta per la mappatura R-loop.

Introduzione

Gli R-loop sono strutture di acidi nucleici a tre filamenti che si formano principalmente durante la trascrizione dopo l'ibridazione del trascritto di RNA nascente nel filamento di DNA stampo. Ciò si traduce nella formazione di un ibrido RNA:DNA e provoca lo spostamento del filamento di DNA non stampo in uno stato di loop a singolo filamento. La ricostituzione biochimica 1,2,3,4 e la modellazione matematica5, in combinazione con altre misure biofisiche 6,7, hanno stabilito che è più probabile che gli R-loop si verifichino su regioni che mostrano specifiche caratteristiche favorevoli. Ad esempio, le regioni che mostrano un'asimmetria di filamento nella distribuzione delle guanine (G) e delle citosine (C) in modo tale che l'RNA sia ricco di G, una proprietà chiamata skew GC positivo, sono favorite per formare R-loop quando trascritte a causa della maggiore stabilità termodinamica dell'ibrido DNA:RNA rispetto al duplexDNA 8. Le regioni che hanno sviluppato uno skew GC positivo, come le porzioni precoci di molti geni eucariotici 4,9,10,11, sono inclini a formare R-loop in vitro e in vivo 3,4,12. Lo stress superelicoidale negativo del DNA favorisce anche notevolmente la formazione della struttura13,14 perché gli R-loop assorbono efficacemente tali stress topologici e riportano la fibra di DNA circostante a uno stato di rilassamento favorevole 5,15.

Storicamente, si è ritenuto che le strutture R-loop fossero il risultato di rari e spontanei entanglement dell'RNA con il DNA durante la trascrizione. Tuttavia, lo sviluppo dell'immunoprecipitazione DNA:RNA (DRIP) accoppiato con il sequenziamento del DNA ad alto rendimento (DRIP-seq) ha permesso la prima mappatura dell'intero genoma dei loop R e ha rivelato che tali strutture sono molto più diffuse del previsto nelle cellule umane 4,16. I R-loop si verificano su decine di migliaia di hotspot genici conservati, trascritti nei genomi dei mammiferi, con una predilezione per le isole CpG GC-distorte che si sovrappongono al primo introne dei geni e alle regioni terminali di numerosi geni17. Complessivamente, gli R-loop occupano collettivamente il 3%-5% del genoma nelle cellule umane, in linea con le misurazioni in altri organismi, tra cui lieviti, piante, mosche e topi 18,19,20,21,22.

L'analisi degli hotspot che formano l'anello R nelle cellule umane ha rivelato che tali regioni si associano a specifiche firme della cromatina23. Gli R-loop, in generale, si trovano in regioni con minore occupazione nucleosomica e maggiore densità di RNA polimerasi. Ai promotori, gli R-loop si associano con un aumento del reclutamento di due modificazioni istoniche depositate co-trascrizionalmente, H3K4me1 e H3K36me317. Ai termini genici, gli R-loop si associano a geni strettamente disposti che subiscono un'efficiente terminazione della trascrizione17, coerentemente con le osservazioni precedenti24. È stato anche dimostrato che gli R-loop partecipano all'inizio della replicazione del DNA alle origini di replicazione dei genomi di batteriofago, plasmide, mitocondriale e lievito 25,26,27,28,29,30,31. Inoltre, il 76% dei promotori umani di isole CpG inclini all'R-loop funzionano come origini di replicazione costitutive precoci 32,33,34,35, rafforzando ulteriormente le connessioni tra gli R-loop e le origini di replicazione. Collettivamente, questi studi suggeriscono che gli R-loop rappresentano un nuovo tipo di segnale biologico che può innescare specifici output biologici in modo dipendente dal contesto23.

All'inizio, è stato dimostrato che gli R-loop si formano nelle sequenze di commutazione di classe durante il processo di ricombinazione di commutazione di classe delle immunoglobuline 3,36,37. Si ritiene che tali R-loop programmati avviino la ricombinazione di interruttori di classe attraverso l'introduzione di rotture di DNA a doppio filamento38. Da allora, la formazione dannosa di R-loop, generalmente intesa come il risultato di un'eccessiva formazione di R-loop, è stata collegata all'instabilità genomica e a processi come l'iperricombinazione, le collisioni trascrizione-replicazione, la replicazione e lo stress trascrizionale (per la revisione 39,40,41,42,43). Di conseguenza, una migliore mappatura delle strutture R-loop rappresenta una sfida entusiasmante ed essenziale per decifrare meglio la distribuzione e la funzione di queste strutture in salute e malattia.

L'immunoprecipitazione DNA:RNA (DRIP) si basa sull'elevata affinità dell'anticorpo monoclonale S9.6 per gli ibridi DNA:RNA44. DRIP-seq consente una robusta profilazione dell'intero genoma della formazione di R-loop 4,45. Sebbene utile, questa tecnica soffre di una risoluzione limitata a causa del fatto che gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per ottenere una delicata frammentazione del DNA. Inoltre, DRIP-seq non fornisce informazioni sulla direzionalità della formazione dell'R-loop. Qui, riportiamo una variante di DRIP-seq che consente la mappatura di R-loop ad alta risoluzione in modo specifico per il filamento. Questo metodo si basa sulla sonicazione per frammentare il genoma prima dell'immunoprecipitazione e il metodo è quindi chiamato sDRIP-seq (immunoprecipitazione DNA:RNA di sonicazione accoppiata con sequenziamento ad alto rendimento) (Figura 1). L'uso della sonicazione consente una maggiore risoluzione e limita le distorsioni di frammentazione enzimatiche osservate negli approcci DRIP-seq46. sDRIP-seq produce mappe R-loop che sono in forte accordo con i risultati sia di DRIP-seq che del metodo DRIPc-seq ad alta risoluzione precedentemente descritto in cui le librerie di sequenziamento sono costruite dai filamenti di RNA di strutture R-loop immunoprecipitate45.

Di fronte a una pletora di metodi tra cui scegliere, gli utenti potrebbero chiedersi quale particolare approccio basato su DRIP sia preferibile per le loro esigenze. Offriamo i seguenti consigli. DRIP-seq, nonostante i suoi limiti, è tecnicamente più semplice ed è il più robusto (rendimenti più elevati) di tutti e tre i metodi discussi qui; Rimane quindi ampiamente utile. Sono stati pubblicati numerosi set di dati DRIP-seq, che forniscono un utile punto di confronto per nuovi set di dati. Infine, la pipeline di analisi bioinformatica è più semplice in quanto i dati non sono incagliati. Si raccomanda ai nuovi utenti di iniziare ad affinare le proprie capacità di mappatura R-loop con DRIP seguito da reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e DRIP-seq. sDRIP-seq rappresenta un grado di difficoltà tecnica leggermente superiore: le rese sono leggermente ridotte a causa della sonicazione (discussa di seguito) e il processo della libreria di sequenziamento è leggermente più complesso. Tuttavia, il guadagno della strandedness e della risoluzione più elevata è inestimabile. Si noti che sDRIP-seq catturerà sia ibridi RNA:DNA a due filamenti che R-loop a tre filamenti. A causa delle fasi di costruzione della libreria, DRIP-seq non catturerà ibridi RNA:DNA a due filamenti. Il DRIPc-seq è il più impegnativo dal punto di vista tecnico e richiede una maggiore quantità di materiali di partenza. In cambio, offre la massima risoluzione e incagliabilità. Poiché le librerie di sequenziamento sono costruite dalla porzione di RNA di R-loop o ibridi, DRIPc-seq può soffrire di una possibile contaminazione dell'RNA, soprattutto perché S9.6 possiede un'affinità residua per dsRNA 19,47,48. sDRIP-seq consente la mappatura ad alta risoluzione specifica del filamento senza preoccuparsi della contaminazione dell'RNA, poiché le librerie di sequenziamento derivano da filamenti di DNA. Nel complesso, questi tre metodi rimangono utili e presentano diversi gradi di complessità e avvertimenti leggermente diversi. Tutti e tre, tuttavia, producono set di dati altamente congruenti48 e sono altamente sensibili al pretrattamento con RNasi H, che rappresenta un controllo essenziale per garantire la specificità del segnale45,49. Si noti che, data la selezione delle dimensioni imposta alle librerie di sequenziamento, saranno esclusi piccoli ibridi (stimati <75 bp), come quelli che si formano transitoriamente attorno a siti di priming di replicazione del DNA a filamento ritardato (primer Okazaki). Allo stesso modo, poiché tutti i metodi DRIP comportano la frammentazione del DNA, gli R-loop instabili che richiedono il superavvolgimento del DNA negativo per la loro stabilità andranno persi5. Pertanto, gli approcci DRIP possono sottostimare i carichi R-loop, specialmente per R-loop brevi e instabili che possono essere meglio catturati utilizzando approcci in vivo 45,48. Si noti che gli R-loop possono anche essere profilati in modo indipendente da S9.6 a copertura profonda, ad alta risoluzione e in modo specifico per filamento su singole molecole di DNA dopo il trattamento con bisolfito di sodio12. Inoltre, sono state impiegate strategie che utilizzano un enzima RNasi H1 cataliticamente inattivo per mappare i loop R nativi in vivo, evidenziando brevi e instabili R-loop che si formano principalmente ai promotori in pausa 50,51,52.

Protocollo

Il seguente protocollo è ottimizzato per la linea cellulare umana di Ntera-2 coltivata in coltura, ma è stato adattato con successo senza modifiche a una serie di altre linee cellulari umane (HEK293, K562, HeLa, U2OS), cellule primarie (fibroblasti, cellule B) e in altri organismi con piccole modifiche (topi, mosche).

1. Raccolta e lisi cellulare

  1. Coltura di cellule Ntera-2 con confluenza del 75%-85%. Assicurarsi che la conta cellulare ottimale sia compresa tra 5 e 6 milioni di cellule con una conta vitale del >90% per avviare qualsiasi procedura DRIP.
  2. Lavare le cellule una volta con 1x PBS, aggiungere 1,5 mL di Tripsina-EDTA 1x, quindi incubare per 2 minuti a 37 °C fino a quando le cellule non si dissociano dal piatto.
  3. Aggiungere 5 mL di terreno caldo e pipettare bene per risospendere le cellule in una sospensione di una singola cellula. Trasferire il contenuto in una nuova provetta da 15 ml e pellettare delicatamente le cellule a 300 x g per 3 minuti.
  4. Lavare le cellule una volta con 5 mL di 1x PBS e pellettare delicatamente le cellule a 300 x g per 3 minuti.
  5. Risospendere completamente le cellule in 1,6 mL di tampone TE (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Aggiungere 5 μL di proteinasi K (20 mg/mL di soluzione madre) e 50 μL di SDS (soluzione madre al 20%) e capovolgere delicatamente le provette cinque volte fino a quando la soluzione non diventa viscosa. Non tentare di pipettare la soluzione, ma solo mescolare per inversione.
  6. Incubare le provette per una notte a 37 °C.

2. Estrazione del DNA

  1. Versare il lisato di DNA in una provetta di gel ad aggancio di fase ad alta densità da 15 mL pre-centrifugata e aggiungere 1 volume (1,6 mL) di alcol isoamilico fenolo/cloroformio (25:24:1). Capovolgere delicatamente cinque volte e centrifugare a 1.500 x g per 5 minuti.
  2. Aggiungere 1/10 di volume di acetato di sodio 3 M (NaOAc) (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% a una nuova provetta da 15 mL. Versare la fase acquosa superiore dal tubo di gel ad aggancio di fase e capovolgere delicatamente fino a quando il DNA non è completamente precipitato (fino a 10 minuti).
  3. Avvolgere i fili di DNA utilizzando una punta da 1.000 μL a foro largo e trasferirli in una provetta pulita da 2 mL, facendo attenzione a non trasportare il surnatante residuo.
  4. Lavare il DNA aggiungendo 1,5 ml di etanolo all'80% e capovolgere delicatamente la provetta cinque volte. Incubare per 10 min.
  5. Ripetere il passaggio precedente due volte. Non centrifugare durante le fasi di lavaggio. Rimuovere con cura la maggior quantità possibile di etanolo pipettandolo dopo l'ultimo lavaggio, cercando di non disturbare il DNA.
  6. Lasciare asciugare completamente il DNA all'aria mentre si capovolge il tubo. Questo passaggio può richiedere 30 minuti -1 ora a seconda della quantità di DNA.
  7. Aggiungere 125 μL di tampone TE direttamente sul pellet di DNA per frammentare il DNA attraverso la digestione con l'enzima di restrizione o 100 μL di tampone TE per tagliare il DNA attraverso la sonicazione. Conservare in ghiaccio per 1 ora e risospendere delicatamente il DNA pipettandolo alcune volte con un puntale da 200 μL a foro largo. Lasciare in ghiaccio per 1 ora prima di iniziare la fase di frammentazione.

3. Frammentazione del DNA

NOTA: Per il DRIP-seq basato su enzimi di restrizione, seguire il passaggio 3.1. Per il DRIP-seq basato sulla sonicazione, andare al passaggio 3.2.

  1. Frammentazione dell'enzima di restrizione (RE)
    1. Digerire il DNA genomico risospeso (molto viscoso) utilizzando un cocktail di RE secondo le istruzioni del fornitore.
      1. Aggiungere 0,1 mM di spermidina alla reazione finale. Utilizzare un cocktail di 4-5 enzimi con 30 U di ciascun enzima in un volume totale di 150 μl.
        NOTA: Il cocktail iniziale per DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 è stato sviluppato per generare una lunghezza media del frammento di 5 kilobasi. Evita qualsiasi interferenza con la metilazione CpG e risparmia le regioni ricche di GC del genoma. Sono possibili anche altri cocktail16). Questi cocktail sono adatti sia per il genoma umano che per quello del topo, ma possono essere regolati secondo necessità.
      2. Incubare la miscela di reazione per una notte a 37 °C.
        NOTA: La miscela di DNA post-digestione non deve più essere viscosa. L'eventuale viscosità residua in questa fase è indicativa di una digestione incompleta.
      3. Se osservato, aggiungere altri 10 U di ciascun enzima e incubare per altre 2-4 ore a 37 °C.
        NOTA: Gli utenti potrebbero non digerire l'intero pellet nel caso in cui abbiano raccolto più cellule di quanto raccomandato qui.
    2. Pipettare delicatamente il DNA digerito durante la notte (150 μL) in una provetta leggera in gel ad aggancio di fase da 2 mL pre-centrifugata. Aggiungere 100 μL di acqua e un volume (250 μL) di alcol isoamilico fenolo/cloroformio (25:24:1). Capovolgere delicatamente cinque volte e centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti.
    3. Aggiungere 1,5 μL di glicogeno, 1/10 di volume di NaOAc 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% a una nuova provetta da 1,5 mL. Pipettare il DNA dalla provetta del gel ad aggancio di fase e mescolare capovolgendo cinque volte. Incubare per 1 ora a -20 °C.
    4. Centrifugare a 16.000 x g per 35 min a 4 °C. Lavare il DNA con 200 μl di etanolo all'80% e centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
    5. Asciugare il pellet all'aria e aggiungere 50 μl di tampone TE al pellet. Lasciare il tubo sul ghiaccio per 30 minuti e risospendere delicatamente il DNA.
    6. Misurare la concentrazione (OD260) del DNA frammentato utilizzando uno spettrofotometro.
    7. Facoltativo ma consigliato: caricare 1 μg di DNA digerito su un gel di agarosio allo 0,8% insieme a un marcatore dimensionale per verificare che la digestione sia completa. Far funzionare il gel per un'ora a 100 V.
      NOTA: Se incompleto, è possibile aggiungere un ulteriore enzima. Una digestione incompleta può portare alla perdita di risoluzione dopo l'immunoprecipitazione.
    8. Dopo questa fase, trattare 10 μg di DNA digerito con 4 μL di ribonucleasi H (RNasi H) per 1-2 ore a 37 °C per garantire che il segnale recuperato dopo l'immunoprecipitazione derivi da ibridi DNA:RNA. Quindi, procedere all'immunoprecipitazione S9.6 (passaggio 4).
      NOTA: I DNA digeriti possono essere conservati congelati a -80 °C per un massimo di un mese senza una significativa perdita di resa.
  2. Sonicazione
    1. Sonicare tutto o parte del DNA estratto in una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL in un volume totale di 100 μL. Eseguire 15-20 cicli di 30 s ON / 30 s OFF su un sonicatore (centrifugare dopo 5, 10 e 15 cicli per garantire una sonicazione omogenea).
    2. Misurare la concentrazione (OD260) di DNA sonicato su uno spettrofotometro.
      NOTA: A questo punto, la viscosità del DNA dovrebbe essere scomparsa.
    3. Eseguire un gel di agarosio per confermare la distribuzione dimensionale del DNA sonicato (300-500 bp).
      NOTA: L'eccessiva sonicazione del DNA può portare a una significativa riduzione della resa derivante dalla rottura e dalla dissociazione delle strutture R-loop.
    4. Dopo questa fase, trattare 10 μg di DNA sonicato con 4 μL di RNasi H per 1-2 ore a 37 °C per garantire che il segnale recuperato dopo l'immunoprecipitazione derivi da ibridi DNA:RNA. Quindi, procedere all'immunoprecipitazione S9.6 (passaggio 4).

4. Immunoprecipitazione S9.6

NOTA: Le fasi di immunoprecipitazione sono simili indipendentemente dal fatto che il DNA sia stato frammentato attraverso RE o sonicazione.

  1. Preparare tre provette e aliquotare 4,4 μg di DNA frammentato in un volume finale di 500 μl di tampone TE per provetta. Conservare 50 μl (1/10 del volume) da ciascuna provetta per utilizzarla successivamente come DNA di ingresso.
  2. Aggiungere 50 μl di tampone legante 10x (100 mM NaPO4 pH 7, 1,4 M NaCl, 0,5% Triton X-100) e 10 μl di anticorpo S9.6 (1 mg/mL) ai 450 μl di DNA diluito.
  3. Incubare per una notte a 4 °C su un rotatore per miniprovette a 7-10 giri/min.
  4. Per ogni provetta, lavare 50 μL di perlina di agarosio Protein A/G con 700 μL di tampone legante 1x capovolgendo le provette su un mini-rotatore a 7-10 giri/min a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare le perline a 1.100 x g per 1 minuto e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.
  5. Aggiungere il DNA del passaggio 4.3 ai 50 μL di perle e incubare per 2 ore a 4 °C invertendo a 7-10 giri/min su un mini-rotatore.
  6. Centrifugare le perline per 1 minuto a 1.100 x g e scartare il surnatante.
  7. Lavare le perle con 750 μL di tampone legante 1x capovolgendo a 7-10 giri/min su un mini-rotatore per 15 minuti. Centrifugare per 1 minuto a 1.100 x g ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.
  8. Aggiungere 250 μl di tampone di eluizione (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,5% SDS) e 7 μl di proteinasi K (20 mg/mL stock) alle perle e incubare con rotazione a 55 °C (12 giri/min) per 45 min.
  9. Centrifugare le perline per 1 minuto a 1.100 x g. Trasferire il surnatante in una provetta leggera in gel ad aggancio di fase da 2 mL pre-centrifugato e aggiungere un volume (250 μL) di alcol isoamilico fenolo/cloroformio (25:24:1). Capovolgere le provette cinque volte e centrifugare per 10 minuti a 16.000 x g a temperatura ambiente.
  10. Aggiungere 1,5 μL di glicogeno, 1/10 di volume di NaOAc 3M (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% a una nuova provetta da 1,5 mL. Pipettare il DNA dalla provetta del gel ad aggancio di fase e mescolare capovolgendo cinque volte. Incubare per 1 ora a -20 °C.
  11. Centrifugare a 16.000 x g per 35 min a 4 °C. Lavare il DNA con 200 μl di etanolo all'80% e centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  12. Asciugare i pellet all'aria e aggiungere 15 μL di Tris-Cl 10 mM (pH 8) in ciascuna provetta. Lasciare i tubi in ghiaccio per 20 minuti e risospendere delicatamente. Combinare il contenuto delle tre provette in un'unica provetta (45 μL).
  13. Controllare l'efficienza del DRIP mediante qPCR utilizzando 5 μL di DNA risospeso da 45 μL (vedere Risultati rappresentativi). Diluire i 5 μl in 10 μl di acqua e utilizzare 2 μl per reazione.

5. Fase di pre-libreria solo per DNA sonicato

NOTA: La sonicazione porta il filamento ssDNA spostato degli anelli R a rompersi. Pertanto, le strutture R-loop a tre filamenti vengono convertite in ibridi DNA:RNA a due filamenti dopo la sonicazione. Di conseguenza, questi ibridi DNA:RNA devono essere riconvertiti in DNA a doppio filamento prima della costruzione della libreria. Qui, viene impiegata una seconda fase di sintesi del filamento. Un approccio alternativo che è stato utilizzato con successo consiste nell'eseguire invece una legatura del DNA a singolo filamento seguita da una sintesi del secondo filamento53.

  1. Ai 40 μL di DNA DRRIP'ed del passaggio 4.12, aggiungere 20 μL di tampone 5x secondo filamento (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl), 10 mM di miscela dNTP (dATP, dCTP, dGTP e dTTT o dUTP se l'utente prevede di ottenere il sequenziamento DRIP specifico del filamento), 1 μL di 16 mM NAD, e 32 μL di acqua. Mescolare bene e incubare per 5 minuti con ghiaccio.
  2. Aggiungere 1 μL di DNA polimerasi I (10 unità), 0,3 μL di RNasi H (1,6 unità) e 0,5 μL di E. coli DNA ligasi. Mescolare e incubare a 16 °C per 30 min.
  3. Pulire immediatamente la reazione utilizzando perline paramagnetiche con un rapporto di 1,6x. Eluire il DNA in 40 μL di Tris-Cl 10 mM (pH 8).

6. Fase di sonicazione pre-libreria solo per RE DNA

NOTA: DRIP porta al recupero di frammenti RE che sono spesso lunghi kilobasi e quindi non adatti per la costruzione immediata di librerie.

  1. Per ridurre le dimensioni del materiale per la costruzione della libreria, sonicare il DNA immunoprecipitato in una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL. Eseguire 12 cicli di 15 s ON / 60 s OFF su un sonicatore (centrifugare dopo sei cicli per garantire una sonicazione omogenea). Procedere al passaggio 7.
    NOTA: Il materiale immunoprecipitato trasporta ancora gli anelli R a tre filamenti che rispondono alla sonicazione in modo diverso rispetto al DNA a doppio filamento fiancheggiante.
  2. Passaggio opzionale: per uniformare i profili DRRIP, trattare il materiale immunoprecipitato con 1 μL di RNasi H in 1x tampone RNasi H per 1 ora a 37 °C prima della sonicazione.

7. Costruzione della biblioteca

  1. Eseguire la riparazione finale aggiungendo ai 40 μl del passaggio 4.12 (frammentazione RE) o del passaggio 5.3 (taglio per sonicazione) 5 μl di tampone del modulo di riparazione terminale 10x, 2,5 μl di ATP 10 mM e 2,5 μl di enzima del modulo di riparazione finale (50 μl in totale). Mescolare bene e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Includere 1 μg di DNA di input RI-digerito e sonicato (DRIP) o sonicato (sDRIP) per creare librerie di sequenziamento di controllo corrispondenti al DNA di input.
  2. Pulire la reazione utilizzando perle paramagnetiche (rapporto 1,6x) ed eluire in 34 μL di 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  3. Eseguire l'A-tailing aggiungendo 5 μL di tampone 2, 10 μL di 1 mM dATP e 1 μL di Klenow exo- (50 μL in totale). Mescolare bene e incubare la miscela per 30 minuti a 37 °C.
  4. Pulire la reazione utilizzando perle paramagnetiche (rapporto 1,6x) ed eluire in 12 μL di Tris-Cl 10 mM (pH 8).
  5. Adattatori Ligate aggiungendo 15 μL di tampone di legatura rapida 2x, 1 μL di adattatori da 15 μM e 2 μL di ligasi rapida (30 μL in totale). Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  6. Pulire la reazione utilizzando perle paramagnetiche (rapporto 1x) ed eluire in 20 μL di Tris-Cl 10 mM (pH 8).
  7. Se è stata eseguita la tranciatura per sonicazione ed è stata utilizzata la dUTP nella fase 5.1, aggiungere 1,5 μL (1,5 U) di Uracil N-glicosilasi e incubare per 30 minuti a 37 °C per ottenere una DRIP specifica per il filamento.
  8. La PCR amplifica 10 μL della libreria dal passaggio 6.6 o 6.7. Aggiungere 1 μL di primer PCR 1.0 P5 (vedere la Tabella dei materiali), 1 μL di primer PCR 2.0 P7 (vedere la Tabella dei materiali), 15 μL di master mix e 3 μL di acqua. Mescola bene.
  9. In un termociclatore, eseguire il programma come mostrato nella Tabella 1.
  10. Procedere a una pulizia in due fasi della libreria utilizzando perline paramagnetiche. Per prima cosa, utilizzare un rapporto di 0,65x per rimuovere i frammenti oltre i 500 bp. Conserva il surnatante. Procedere con un rapporto 1x sul surnatante per rimuovere i frammenti inferiori a 200 bp. Eluire in 12 μL di 10 mM di Tris-HCl (pH 8).

8. Controllo di qualità

  1. Per controllare gli arricchimenti R-loop con qPCR su due loci negativi e tre positivi utilizzando il metodo Pfaffl, utilizzare 1 μL della libreria di clean-up del passaggio 6.10. Diluire 1 μL della libreria in 10 μL di acqua e utilizzare 2 μL per locus.
  2. Controlla la distribuzione delle dimensioni della libreria ripulita dal passaggio 6.10 utilizzando un kit DNA ad alta sensibilità.

Risultati

Il DRIP e il sDRIP possono essere analizzati tramite qPCR (Figura 2A) e/o sequenziamento (Figura 2B). Dopo la fase di immunoprecipitazione, la qualità dell'esperimento deve essere prima confermata mediante qPCR su loci di controllo positivi e negativi, nonché con controlli trattati con RNasi H. I primer corrispondenti ai loci utilizzati di frequente in più linee cellulari umane sono forniti nella Tabella 2. I...

Discussione

Qui sono descritti due protocolli per mappare le strutture R-loop in qualsiasi organismo che utilizza l'anticorpo S9.6. DRIP-seq rappresenta la prima tecnica di mappatura R-loop a livello di genoma sviluppata. È una tecnica semplice, robusta e riproducibile che consente di mappare la distribuzione dei loop R lungo qualsiasi genoma. La seconda tecnica, denominata sDRIP-seq, è anch'essa robusta e riproducibile, ma raggiunge una risoluzione e una specificità del filamento più elevate gr...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Il lavoro nel laboratorio di Chedin è sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (R01 GM120607).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tube High density Maxtract phase lock gelQiagen129065
2 mL tube phase lock gel lightVWR10847-800
Agarose A/G beadsThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
Index adaptersIlluminaCorresponds to the TrueSeq Single indexes
Klenow fragment (3’ to 5’ exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext End repair moduleNew England BioLabsE6050
PCR primers for library amplificationprimer 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
PCR primers for library amplificationPCR primer 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3’)
Phenol/Chloroform Isoamyl alcohol 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mixThermoFisher ScientificF548S
Quick Ligation KitNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AntibodyKerafastENH001These three sources are equivalent
S9.6 AntibodyMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AntibodyAbcamab234957

Riferimenti

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  5. Stolz, R., et al. Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (13), 6260-6269 (2019).
  6. Duquette, M. L., Handa, P., Vincent, J. A., Taylor, A. F., Maizels, N. Intracellular transcription of G-rich DNAs induces formation of G-loops, novel structures containing G4 DNA. Genes & Development. 18 (13), 1618-1629 (2004).
  7. Carrasco-Salas, Y., et al. The extruded non-template strand determines the architecture of R-loops. Nucleic Acids Research. 47 (13), 6783-6795 (2019).
  8. Huppert, J. L. Thermodynamic prediction of RNA-DNA duplex-forming regions in the human genome. Molecular Biosystems. 4 (6), 686-691 (2008).
  9. Hartono, S. R., Korf, I. F., Chedin, F. GC skew is a conserved property of unmethylated CpG island promoters across vertebrates. Nucleic Acids Research. 43 (20), 9729-9741 (2015).
  10. Green, P., Ewing, B., Miller, W., Thomas, P. J., Green, E. D. Transcription-associated mutational asymmetry in mammalian evolution. Nature Genetics. 33 (4), 514-517 (2003).
  11. Polak, P., Arndt, P. F. Transcription induces strand-specific mutations at the 5' end of human genes. Genome Research. 18 (8), 1216-1223 (2008).
  12. Malig, M., Hartono, S. R., Giafaglione, J. M., Sanz, L. A., Chedin, F. Ultra-deep Coverage Single-molecule R-loop Footprinting Reveals Principles of R-loop Formation. Journal of Moleclar Biology. 432 (7), 2271-2288 (2020).
  13. Masse, E., Phoenix, P., Drolet, M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 272 (19), 12816-12823 (1997).
  14. Drolet, M., et al. The problem of hypernegative supercoiling and R-loop formation in transcription. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 8, 210-221 (2003).
  15. Chedin, F., Benham, C. J. Emerging roles for R-loop structures in the management of topological stress. The Journal of Biological Chemistry. 295 (14), 4684-4695 (2020).
  16. Ginno, P. A., Lim, Y. W., Lott, P. L., Korf, I., Chedin, F. GC skew at the 5' and 3' ends of human genes links R-loop formation to epigenetic regulation and transcription termination. Genome Research. 23 (10), 1590-1600 (2013).
  17. Sanz, L. A., et al. conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  18. El Hage, A., Webb, S., Kerr, A., Tollervey, D. Genome-wide distribution of RNA-DNA hybrids identifies RNase H targets in tRNA genes, retrotransposons and mitochondria. PLoS Genetics. 10 (10), 1004716 (2014).
  19. Hartono, S. R., et al. The affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs impacts the accurate mapping of R-loops in fission yeast. Journal of Molecular Biology. 430 (3), 272-284 (2018).
  20. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes & Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  21. Alecki, C., et al. RNA-DNA strand exchange by the Drosophila Polycomb complex PRC2. Nature Communications. 11 (1), 1781 (2020).
  22. Xu, W., et al. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature Plants. 3 (9), 704-714 (2017).
  23. Chedin, F. Nascent connections: R-Loops and chromatin patterning. Trends in Genetics: TIG. 32 (12), 828-838 (2016).
  24. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J., Gromak, N. Human senataxin resolves RNA/DNA hybrids formed at transcriptional pause sites to promote Xrn2-dependent termination. Molecular Cell. 42 (6), 794-805 (2011).
  25. Kreuzer, K. N., Brister, J. R. Initiation of bacteriophage T4 DNA replication and replication fork dynamics: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. Virology Journal. 7, 358 (2010).
  26. Carles-Kinch, K., Kreuzer, K. N. RNA-DNA hybrid formation at a bacteriophage T4 replication origin. Journal of Molecular Biology. 266 (5), 915-926 (1997).
  27. Masukata, H., Tomizawa, J. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62 (2), 331-338 (1990).
  28. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  29. Stuckey, R., Garcia-Rodriguez, N., Aguilera, A., Wellinger, R. E. Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5779-5784 (2015).
  30. Lee, D. Y., Clayton, D. A. Initiation of mitochondrial DNA replication by transcription and R-loop processing. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30614-30621 (1998).
  31. Xu, B., Clayton, D. A. A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription at a phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Molecular and Cellular Biology. 15 (1), 580-589 (1995).
  32. Cadoret, J. C., et al. Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15837-15842 (2008).
  33. Sequeira-Mendes, J., et al. Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in mammalian cells. PLoS Genetics. 5 (4), 1000446 (2009).
  34. Picard, F., et al. The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells. PLoS Genetics. 10 (5), 1004282 (2014).
  35. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genetics. 10 (5), 1004319 (2014).
  36. Huang, F. T., Yu, K., Hsieh, C. L., Lieber, M. R. Downstream boundary of chromosomal R-loops at murine switch regions: implications for the mechanism of class switch recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5030-5035 (2006).
  37. Huang, F. T., et al. Sequence dependence of chromosomal R-loops at the immunoglobulin heavy-chain Smu class switch region. Molecular and Cellular Biology. 27 (16), 5921-5932 (2007).
  38. Yu, K., Lieber, M. R. Current insights into the mechanism of mammalian immunoglobulin class switch recombination. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 54 (4), 333-351 (2019).
  39. Crossley, M. P., Bocek, M., Cimprich, K. A. R-Loops as cellular regulators and genomic threats. Molecular Cell. 73 (3), 398-411 (2019).
  40. Santos-Pereira, J. M., Aguilera, A. R loops: new modulators of genome dynamics and function. Nature Reviews. Genetics. 16 (10), 583-597 (2015).
  41. Garcia-Muse, T., Aguilera, A. R Loops: From physiological to pathological roles. Cell. 179 (3), 604-618 (2019).
  42. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J. A double-edged sword: R loops as threats to genome integrity and powerful regulators of gene expression. Genes & Development. 28 (13), 1384-1396 (2014).
  43. Costantino, L., Koshland, D. The Yin and Yang of R-loop biology. Current Opinion in Cell Biology. 34, 39-45 (2015).
  44. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. Journal of Immunological Methods. 89 (1), 123-130 (1986).
  45. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  46. Halasz, L., et al. RNA-DNA hybrid (R-loop) immunoprecipitation mapping: an analytical workflow to evaluate inherent biases. Genome Research. 27 (6), 1063-1073 (2017).
  47. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  48. Chedin, F., Hartono, S. R., Sanz, L. A., Vanoosthuyse, V. Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. The EMBO Journal. 40 (4), 106394 (2021).
  49. Smolka, J. A., Sanz, L. A., Hartono, S. R., Chedin, F. Recognition of RNAs by the S9.6 antibody creates pervasive artefacts when imaging RNA:DNA hybrids. Journal of Cell Biology. 220 (6), 202004079 (2021).
  50. Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D., Chen, L. R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nature Protocols. 14 (5), 1661-1685 (2019).
  51. Yan, Q., Sarma, K. MapR: A Method for Identifying native R-loops genome wide. Current Protocols in Molecular Biology. 130 (1), 113 (2020).
  52. Wang, K., et al. Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor. Science Advances. 7 (8), (2021).
  53. Crossley, M. P., Bocek, M. J., Hamperl, S., Swigut, T., Cimprich, K. A. qDRIP: a method to quantitatively assess RNA-DNA hybrid formation genome-wide. Nucleic Acids Research. 48 (14), 84 (2020).
  54. Svikovic, S., et al. R-loop formation during S phase is restricted by PrimPol-mediated repriming. The EMBO Journal. 38 (3), 99793 (2019).
  55. Yang, X., et al. m(6)A promotes R-loop formation to facilitate transcription termination. Cell Research. 29 (12), 1035-1038 (2019).
  56. Vanoosthuyse, V. Strengths and weaknesses of the current strategies to map and characterize R-Loops. Non-coding RNA. 4 (2), 9 (2018).

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