Preparazione del cuore e del tessuto cerebrale dei roditori per la fotografia macro digitale dopo ischemia-riperfusione

Riepilogo

Qui è presentato un protocollo per la metodologia standardizzata di preparazione del tessuto dei roditori dopo l'esperimento di ischemia-riperfusione e linee guida per stabilire l'illuminazione e le configurazioni della telecamera per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione. Questo metodo è applicabile a tutte le fotografie sperimentali di piccoli organi animali.

Abstract

La fotografia macro è applicabile per l'imaging di vari campioni di tessuto ad alto ingrandimento per eseguire analisi qualitative e quantitative. La preparazione dei tessuti e la successiva acquisizione dell'immagine sono fasi eseguite immediatamente dopo l'esperimento di ischemia-riperfusione (IR) e devono essere eseguite in modo tempestivo e con la dovuta cura. Per la valutazione del danno indotto da IR nel cuore e nel cervello, questo documento descrive la colorazione a base di cloruro di tetrazolio (TTC) a base di 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio cloruro (TTC) seguita da macrofotografia. La fotografia macro scientifica richiede un'illuminazione controllata e una configurazione di imaging appropriata. La metodologia standardizzata garantisce immagini digitali dettagliate e di alta qualità anche se viene utilizzata una combinazione di una fotocamera digitale e di un obiettivo macro aggiornati e poco costosi. Vengono discusse le tecniche appropriate e i potenziali errori nella preparazione del campione e nell'acquisizione delle immagini e vengono forniti esempi dell'influenza di configurazioni corrette e errate sulla qualità dell'immagine. Vengono forniti suggerimenti specifici su come evitare errori comuni, come la colorazione eccessiva, la conservazione impropria dei campioni e condizioni di illuminazione non ottimali. Questo documento mostra la metodologia appropriata per l'affettamento e la colorazione del cuore e del tessuto cerebrale del ratto e fornisce linee guida per stabilire l'illuminazione e le configurazioni della fotocamera e le tecniche fotografiche per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione.

Introduzione

Per decenni, la fotografia e l'analisi di campioni di cuore e tessuto cerebrale sono state una parte importante degli esperimenti di scienze della vita. Il progresso della scienza e dell'innovazione guida lo sviluppo di microscopi costosi in grado di superrisoluzione. Le fotomicrografie sono ottenute in un ambiente luminoso ben controllato seguendo istruzioni dettagliate. Al contrario, la fotografia macro (con ingrandimento 1:2 o superiore) viene spesso eseguita in un ambiente di luce incontrollata utilizzando impostazioni di imaging inappropriate. Spesso, le tecniche di preparazione del campione e la configurazione della telecamera devono essere sostanzialmente ottimizzate. Di conseguenza, le macro fotografie di qualità limitata sono state ampiamente pubblicate su riviste scientifiche. Una risoluzione e un contrasto dell'immagine insufficienti limitano le possibilità di una quantificazione precisa dell'immagine negli studi IR.

Le procedure sperimentali di infarti ^{miocardici1,2} e ^cerebrali3,4 sono state descritte in dettaglio. Lo scopo di questo studio è quello di fornire una guida passo-passo su come impostare un sistema per la fotografia e l'analisi standardizzata del cuore dei roditori e dei campioni di tessuto cerebrale dopo esperimenti di infarto. Ciò include l'affettamento dei tessuti, la colorazione e la fotografia macro di campioni di cuore e cervello. La preparazione di campioni di tessuto è una parte essenziale dell'esperimento e i risultati dell'analisi planimetrica delle immagini dipendono fortemente dalla qualità delle immagini ^ottenute5.

Questi metodi sono particolarmente utili per eseguire misurazioni e analisi planimetriche di immagini nei tessuti dei roditori e potrebbero essere utili per la macrofotografia scientifica generale. Inoltre, l'alta qualità e la coerenza delle immagini consentono di eseguire l'analisi automatizzata delle fotografie digitali, che aiuta a risparmiare tempo, evitare l'input dell'utente e ridurre al minimo il rischio di errori o distorsioni durante l'analisi delle immagini. Ciò si tradurrà nella generazione di dati robusti e affidabili e aumenterà la traduzione delle scoperte precliniche in nuovi trattamenti antiischemici nelle cliniche.

Protocollo

Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida della Comunità Europea e le leggi e le politiche locali (Direttiva 2010/63/UE), e tutte le procedure sono state approvate dal Servizio Alimentare e Veterinario, Riga, Lettonia.

1. Colorazione e affettatura del cuore

NOTA: Le tecniche descritte in questo protocollo possono essere utilizzate sia dopo i test di danno IR del ratto isolato o del topo perfuso da ^{Langendorff6,7} che dopo i saggi IR del cuore di ratto in ^{vivo8,9,10,11}. Per la colorazione dopo un test di lesione IR in vivo, si presume che il cuore sia asportato, montato su una cannula e brevemente perfuso nella modalità di perfusione di Langendorff.

1. Staccare la cannula cardiaca dalla siringa riempita con soluzione di Krebs-Henseleit e collegarla a una siringa riempita con una soluzione calda (37 °C) di blu di metilene allo 0,1% in soluzione di Krebs-Henseleit. Utilizzare una siringa da 5 ml per i cuori di ratto e una siringa da 1-2 ml per i cuori di topo.
   NOTA: Un'alternativa consiste nel riempire l'apparecchio a pressione o a flusso controllato (ad esempio, Langendorff) con una soluzione contenente colorante blu. Durante la procedura di distacco e montaggio, è essenziale non lasciare bolle d'aria nella cannula e non allentare la sutura utilizzata per la riconceclusione dell'arteria coronaria.
2. Perfondere ulteriormente i cuori di ratto con 4 mL della soluzione di blu di metilene ad una velocità di ~4 mL/min e perfondere i cuori di topo con 1 mL di soluzione di blu di metilene ad una velocità di ~0,5-1 mL/min.
   NOTA: Sulla base dell'esperienza, entrambe le tecniche sono sicure e forniscono una colorazione adeguata; tuttavia, l'utilizzo di una pompa controllata dalla pressione / sistema di pressione idrostatica è un'opzione più dispendiosa in termini di tempo ma più sicura contro l'overstaining per gli scienziati alle prime armi.
3. Scollegare la cannula dalla siringa e rimuovere il cuore dalla cannula.
4. Rimuovere l'eccesso di blu di metilene arrotolando delicatamente il cuore su carta velina. Allentare la legatura intorno all'arteria coronaria aprendo la pinza emostatica e rimuovendo il tubo di plastica dalla sutura chirurgica solo dopo aver rimosso l'eccesso di blu di metilene.
   NOTA: In questa fase, è possibile posizionare il cuore del mouse in un piccolo sacchetto di plastica o in un microtubo centrifugo da 5 ml nel congelatore (-20 °C) per un massimo di 5-10 minuti. Il tempo massimo di congelamento dovrebbe essere determinato sperimentalmente in ogni laboratorio. Il congelamento a breve termine di un cuore di topo può aiutare uno sperimentatore alle prime armi a tagliarlo in fette spesse 1 mm. Il congelamento dei cuori di ratto non è raccomandato. Lo scongelamento per più di 10 minuti a -20 °C deve essere evitato.
5. Posizionare il cuore di ratto colorato in una matrice di acciaio inossidabile (vedere la Tabella dei materiali) per l'affettamento cardiaco (Figura 1A). Quindi, tagliare i ventricoli del cuore in fette spesse 2 mm (mirare a 6-7 fette di un cuore di ratto adulto). Per i cuori di topo, tagliare i ventricoli del cuore in fette spesse 1,5 mm (mirare ad almeno 4 fette di un cuore di topo adulto).
   NOTA: è necessario utilizzare lame di rasoio compatibili con la matrice di affettatura. In generale, le lame di rasoio a bordo singolo compatibili (ad esempio, spessore fino a 0,01 pollici (0,254 mm)) possono essere utilizzate per affettare cuori di ratto. Le lame di rasoio a doppio bordo sono generalmente utilizzate per i cuori di topo e di solito hanno uno spessore fino a 0,004 pollici (0,1 mm).

Figura 1: Matrici per il cuore di ratto e l'affettamento cerebrale. (A) Cuore di ratto, (B) cervello di ratto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Dopo il taglio, trasferire le fette in un tubo di plastica da 15 ml. Aggiungere 5 mL di cloruro di trifeniltetrazolio (TTC) disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) al tubo con le fette di cuore e incubare per 10 minuti a bagnomaria a 37 °C.
7. Dopo l'incubazione in soluzione TTC, lavare le fette di cuore almeno 2-3 volte con PBS e prepararsi per l'acquisizione dell'immagine.

2. Colorazione e affettatura del cervello

1. Dopo l'esperimento di occlusione dell'arteria cerebrale ^media3,12, rimuovere il cervello, compreso il tronco cerebrale, dal cranio e lavarlo in PBS ghiacciato.
2. Scegli la dimensione corretta della matrice di acciaio inossidabile del cervello (vedi la Tabella dei materiali) in base al peso degli animali (Figura 1B). Posiziona il cervello con il suo lato ventrale verso l'alto nella matrice cerebrale.
   NOTA: quando si è seduti nella matrice, la superficie ventrale del cervello deve essere parallela alla superficie superiore dello stampo.
3. Usando le lame, limitare le parti frontali e caudali (2 lame da entrambi i lati) del cervello.
   NOTA: è necessario utilizzare lame di rasoio compatibili con la matrice di affettatura. In generale, una lama di rasoio compatibile a bordo singolo (spessore fino a 0,01 pollici (0,254 mm)) può essere utilizzata per l'affettamento del cervello di ratto.
4. Metti le lame parzialmente (non tagliando completamente il cervello) nei canali tra la prima e l'ultima lama. Quando tutte le lame sono inserite e disposte in parallelo, premere tutte le lame verso il basso con il palmo della mano contemporaneamente per tagliare il cervello in fette coronali di 2 mm.
5. Afferrare saldamente le lame lungo i lati con due dita e rimuoverle insieme al cervello affettato dalla matrice.
6. Disporre le fette di cervello una per una in un vassoio (70 ml, 72 x 72 mm). Quando si dispongono le fette, assicurarsi che la superficie anteriore di ogni fetta sia sempre rivolta verso l'alto.
7. Versare una soluzione calda (+37 °C) di TTC all'1% in PBS sulle fette di cervello e incubarle per 8 minuti a 37 °C al buio.
   NOTA: Le fette di cervello devono essere completamente immerse nella soluzione TTC durante l'incubazione.
8. Dopo l'incubazione in soluzione TTC all'1%, trasferire le fette di cervello nel vassoio di plastica blu per acquisire immagini. Disporre le fette di cervello in ordine sequenziale dalla parte frontale a quella caudale e utilizzare un bisturi per separare gli emisferi nel piano sagittale.
   NOTA: la superficie del vassoio deve essere lavabile, opaca e di un colore che contrasta le fette di cervello (cioè non rosso, bianco o rosa pallido).

3. Fotografia macro

1. Fotografare le fette di tessuto subito dopo la colorazione.
   NOTA: le fette di cuore possono essere conservate in PBS freddo (a +4 °C) o in soluzione di formalina per un massimo di 30 minuti. Le fette di cervello possono essere conservate in formalina per un periodo prolungato (1-2 settimane).
2. Configurare la fotocamera scelta con una batteria carica, una scheda di memoria e un obiettivo collegato su un supporto (Figura 2)
   NOTA: accendere le luci almeno 5-10 minuti prima dell'acquisizione dell'immagine per riscaldare l'apparecchiatura. Le luci a LED raggiungono la piena luminosità in microsecondi.

Figura 2: Fotocamera e luci configurate per la fotografia macro. La fotocamera è perpendicolare alla superficie di imaging per garantire che il piano focale della fotocamera sia parallelo ai campioni. Abbreviazione: LED = diodo emettitore di luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. A seconda delle sorgenti luminose disponibili, selezionare le impostazioni di bilanciamento del bianco appropriate o eseguire la calibrazione della temperatura del colore in base alle istruzioni contenute nel manuale della fotocamera.
   NOTA: La luce LED bianca (temperatura di colore 6.500 K) è la fonte di luce preferita per evitare lo sfarfallio della luce da parte delle lampadine fluorescenti.
4. Passare la fotocamera alla modalità completamente manuale, impostare ISO 100 e apertura su f/10 e regolare la velocità dell'otturatore per un'esposizione ottimale dell'immagine. Assicurarsi che il piano focale della fotocamera sia parallelo alla superficie in cui verrà posizionato il campione.
   NOTA: la funzione istogramma è utile per garantire che le fette di tessuto non siano sovraesposte.
5. Collegare o abilitare un trigger remoto cablato o wireless per evitare vibrazioni della fotocamera quando l'otturatore viene rilasciato.
   NOTA: un'alternativa consiste nell'abilitare una funzione di scatto ritardato, che ritarderà il trigger per 2 o 10 s dopo aver premuto il pulsante di attivazione.
6. Immergere completamente le fette di cuore in un contenitore con PBS.
   NOTA: le diapositive immerse tendono a fluttuare lontano dalla loro posizione. Per ridurre al minimo il galleggiamento delle fette, utilizzare il vassoio più piccolo possibile in cui tutte le fette possono adattarsi e la quantità minima di soluzione di immersione, assicurando che il campione sia completamente immerso. I metodi alternativi includono il posizionamento delle fette tra i vetrini o l'utilizzo di un filtro polarizzatore sulla lente. Un filtro polarizzatore circolare viene fissato all'obiettivo e ruotato fino a quando i riflessi in un display live-view della fotocamera scompaiono.
7. Disporre le fette di cervello in un vassoio asciutto senza PBS o altri liquidi.
   NOTA: un filtro polarizzatore è molto comodo per catturare immagini di fette di cervello.
8. Posizionare il contenitore con le sezioni sotto la fotocamera con l'obiettivo macro e assicurarsi che tutte le sezioni si adattino perfettamente al campo visivo. Assicurarsi che le fette siano sullo stesso piano, cioè non curve o arrotolate.
9. Controllare l'esposizione e regolare le impostazioni della fotocamera, se necessario.
   NOTA: una volta impostato, non modificare l'esposizione e altre impostazioni durante l'intero esperimento.
10. Cattura il numero (o altra identificazione) del campione e visualizza la fetta di tessuto utilizzando un trigger remoto.
    NOTA: un marcatore di dimensioni, ad esempio un righello mm, deve essere incluso nel campo visivo quando è necessaria la quantificazione assoluta della dimensione del campione.
11. Ruota le fette e cattura le loro immagini dall'altro lato.

Risultati

La Figura 3A è una fotografia di una fetta di cuore macchiata di blu di metilene e TTC dopo infarto miocardico, che contiene abbastanza dettagli e informazioni sul colore per ulteriori analisi planimetriche delle dimensioni dell'infarto (Figura 3B). Abbiamo testato come il congelamento del cuore per 24 ore influisce sull'integrità dei tessuti cardiaci (Figura 3C). Il congelamento per un periodo prolungato (>1 h, Figura 3C) riduce la funzione mitocondriale; pertanto, la colorazione TTC del cuore non è rossa ma rosa pallido e il confine tra tessuti necrotici e vitali è sfocato (Figura 3C).

Inoltre, sono stati confrontati due metodi per la riduzione dei riflessi nei campioni. L'immersione è il metodo più efficiente e produce immagini dettagliate con un buon contrasto (Figura 4A). Il secondo metodo è l'uso di un filtro polarizzatore collegato alla lente. Anche il filtro polarizzatore è efficace; tuttavia, il filtro riduce leggermente la risoluzione e il microcontrasto dell'immagine (Figura 4B). Un'immagine di esempio di una fetta di cuore senza immersione o filtro (Figura 4C) contiene molte riflessioni e non è adatta per ulteriori analisi.

Le fette di cervello non sono immerse a causa di problemi di gestione delle fette (fluttuanti). Nell'analisi planimetrica, è importante confrontare il lato non affetto (sano) del cervello (Figura 5A) con il lato affetto da ictus (Figura 5B). Le fette di cervello sono più facili da gestire su una piastra o un vassoio asciutto e un filtro polarizzatore viene utilizzato per rimuovere i riflessi. Un vassoio con sfondo blu viene utilizzato per la fotografia di fette di cervello (selezione dello sfondo descritta in ^precedenza5).

Le impostazioni manuali della fotocamera sono state utilizzate per garantire il pieno controllo dell'esposizione e del bilanciamento del bianco. Le impostazioni della fotocamera devono essere regolate prima o all'inizio dell'esperimento in base alla sorgente luminosa disponibile. Ciò garantisce un'esposizione ottimale e il bilanciamento del bianco di tutte le immagini per consentire un'analisi uniforme (Figura 6A). Le impostazioni automatiche della fotocamera non sono perfette e possono comportare la variazione dei parametri della fotocamera, causando risultati inappropriati e l'introduzione della variabilità da immagine a immagine.

La Figura 6 mostra esempi di immagini sovraesposte (Figura 6B) e sottoesposte (Figura 6C) di fette di cuore. È necessario prestare sufficiente attenzione alle impostazioni corrette di bilanciamento del bianco della fotocamera in modo che corrispondano a una particolare fonte di luce utilizzata nella configurazione della luce della fotocamera. Impostazioni di bilanciamento del bianco errate possono comportare uno spostamento su blu o giallo (Figura 6D) e magenta o verde (Figura 6E) cast nell'immagine.

Figura 3: Immagini di fette cardiache di ratto. (A) La fetta di cuore fresco è stata analizzata nel software ImageProPlus 6.3 utilizzando la segmentazione del colore (B). (C) La colorazione TTC discrimina male tra tessuto vitale e necrotico nella fetta di cuore congelata (congelata per 24 ore). Abbreviazione: TTC = 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio cloruro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Tecniche per la riduzione delle riflessioni. Immagine della fetta di cuore di ratto catturata immersa in PBS (A) e utilizzando il filtro polarizzatore (B). (C) Fetta di cuore con riflessi quando non si utilizza né immersione né filtro. Abbreviazione = PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini di fette di cervello di ratto. Il cervello del ratto è stato tagliato in sette fette e macchiato con TTC dopo ischemia-riperfusione. L'utilizzo del filtro polarizzatore si traduce nell'acquisizione di immagini prive di riflessi. (A) Fette dall'emisfero non danneggiato; (B) Fette dall'emisfero interessato da ictus. Abbreviazione: TTC = 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio cloruro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Immagini di fette di cuore di ratto. Correttamente (A) e in modo errato (B-E) ha catturato le immagini della fetta di cuore. Impostazioni di esposizione errate determinano immagini sovraesposte (B) e sottoesposte (C). Impostazioni di bilanciamento del bianco errate determinano il giallo (D) o il verde nell'immagine (E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La preparazione del cuore dopo IR inizia con la riacclusione delle arterie cardiache del sangue e la perfusione di colorante blu per la discriminazione delle aree a rischio dalle aree non a rischio. I coloranti blu di metilene o blu evans sono più frequentemente utilizzati per questo ^scopo2. Poiché una pressione eccessivamente elevata potrebbe danneggiare le valvole cardiache e, quindi, macchiare parzialmente o completamente le aree a rischio, è meglio perfondere il cuore con un sistema controllato dalla pressione, come l'apparecchio Langendorff o una versione semplificata di una siringa o pompa dotata di un sistema di pressione idrostatica. La perfusione controllata garantirà una pressione fisiologica e il colorante di solito non entrerà nella regione occlusa del cuore. Entrambe le tecniche di controllo della velocità del flusso e della pressione sono salvaguardie contro l'eccessiva colorazione.

Uno degli errori più gravi nella lavorazione dei tessuti vitali è tenere i tessuti in un congelatore per un tempo prolungato prima della colorazione. Il congelamento viene utilizzato principalmente perché i ricercatori vogliono eseguire la colorazione del cuore il giorno dopo l'esperimento IR o più tardi. Inoltre, il congelamento viene utilizzato per facilitare il taglio del cuore. Abbiamo scoperto che il congelamento a breve termine del cuore per un massimo di 5-10 minuti influisce in modo trascurabile sull'integrità dei tessuti cardiaci e facilita il taglio dei tessuti (in particolare per i cuori di topo) in fette sottili. Tuttavia, il congelamento per periodi prolungati danneggia le membrane e diminuisce la vitalità cellulare e la funzione mitocondriale13. Di conseguenza, la colorazione TTC dei mitocondri funzionanti è influenzata e il confine tra tessuti necrotici e vitali è scarsamente delineato (sfocato). Nel complesso, il congelamento degli hart di ratto dovrebbe essere evitato e solo il congelamento a breve termine dei cuori di topo può essere utilizzato per un taglio più facile.

Il passo successivo è la colorazione dei tessuti in soluzione di TTC all'1% a 37 °^C14. La soluzione di colorazione dovrebbe essere prebellica, particolarmente importante per la colorazione delle fette di cervello. Quando si utilizza la soluzione preriscaldata, il tempo di colorazione ottimale per le fette di cuore è di 10 minuti. Un'incubazione più lunga o una temperatura superiore a 37 °C provoca la colorazione marrone dei tessuti cardiaci. Una corretta colorazione dei campioni e un'intensità costante del colore rosso sono importanti per ulteriori analisi delle immagini. Nelle fasi finali prima della fotografia, le fette di tessuto vengono risciacquate 2-3 volte con PBS freddo o un tampone simile per rimuovere TTC e blu di metilene in eccesso dalla soluzione per evitare la fusione blu nella fotografia. Le fette di cuore dovrebbero essere fotografate poco dopo la colorazione per ottenere la migliore qualità dell'immagine. La colorazione cardiaca rimane di buona qualità se conservata fino a 60 minuti nel PBS freddo (+4 °C). Le fette di cervello colorate e i tessuti aortici vengono solitamente conservati in una soluzione di formaldeide neutra al 4% e mantengono una buona qualità per una settimana. La conservazione notturna dei tessuti cerebrali in formalina (+4 °C) non compromette l'intensità del colore del tessuto normale ed è accettabile per l'acquisizione dell'immagine. Tuttavia, la formalina induce gonfiore e destaining delle fette di cuore. Pertanto, la conservazione dei tessuti cardiaci nella formalina non è raccomandata.

Il prossimo passo è l'acquisizione di immagini. Molti laboratori utilizzano scanner piani come strumento di acquisizione delle immagini che dovrebbe sostituire una fotocamera digitale e una configurazione dell'illuminazione. Abbiamo stabilito che la scansione delle fette non fornisce una risoluzione dell'immagine e una separazione dei colori sufficienti e quindi non è adatta per l'imaging di fette di cuore. In particolare, la risoluzione dello scanner è insufficiente per i cuori dei mouse e abbiamo notato una scarsa resa del blu di metilene. Al contrario, uno scanner potrebbe essere un'alternativa a una fotocamera per l'imaging di fette di cervello macchiate solo con TTC o altri coloranti singoli. Per la scansione di fette di tessuto, è essenziale un software di scansione che garantisca impostazioni di esposizione costanti. Nel complesso, uno scanner piano è meno capace e non può sostituire una fotocamera digitale per la maggior parte delle applicazioni di imaging.

Anche lo sfondo dietro gli esemplari è importante. Idealmente, il fondo del vassoio dovrebbe essere di un colore non presente nel campione macchiato. Ad esempio, per quantificare l'area della colorazione blu di metilene e TTC (rosso) in modo automatizzato o semiautomatico, è necessario evitare sfondi bianchi, rossi, blu, gialli e marroni. Pertanto, uno sfondo verde sarebbe preferibile. Tuttavia, la selezione del colore dipende dalle preferenze dell'operatore, che post-elabora l'immagine. Molti scienziati preferiscono uno sfondo bianco perché uno sfondo bianco può essere eliminato nella post-elaborazione delle immagini e convertito in completamente bianco (codice bianco RGB 255.255.255). Quindi, si dovrebbe escludere completamente il bianco dall'elenco dei colori selezionati utilizzati per l'analisi semiautomatica e contare solo le aree necrotiche pallide, che non sono completamente bianche se non sovraesposte. Gli sfondi blu e verdi sono adatti per la fotografia di fette di cervello e aorte.

Lo strumento di imaging ottimale per la fotografia tissutale è una fotocamera digitale reflex o mirrorless con obiettivo intercambiabile a obiettivo singolo con un obiettivo macro compatibile. La cattura di oggetti molto piccoli potrebbe richiedere una combinazione di una fotocamera e un microscopio; tuttavia, un obiettivo macro di solito ha un ingrandimento sufficiente (almeno 1:2) per ottenere immagini dettagliate di un cuore di topo. Molti produttori offrono fotocamere digitali e obiettivi macro a prezzi accessibili per ottenere fotografie ad alta risoluzione e ad alto ingrandimento. Tutte le fotocamere digitali aggiornate hanno caratteristiche e funzioni necessarie per la fotografia macro, tra cui la possibilità di montare su un supporto, un numero elevato di pixel (di solito >20 Mpx), live view, mirror lock-up, funzioni time-lapse, otturatore remoto e la possibilità di impostare manualmente i parametri della fotocamera, garantendo così una velocità dell'otturatore costante, apertura, bilanciamento del bianco e impostazione ISO. Le fotocamere compatte con le caratteristiche sopra menzionate e l'ingrandimento dell'obiettivo di almeno 1: 2 possono essere utilizzate anche per la fotografia macro. A causa delle caratteristiche dell'obiettivo, alcune fotocamere compatte devono essere posizionate in prossimità dell'oggetto e lo sperimentatore deve assicurarsi che il corpo della fotocamera non influisca sull'illuminazione del campione.

Per la fotografia macro con qualsiasi tipo di fotocamera con obiettivo intercambiabile, è necessario un obiettivo macro ad alto ingrandimento (1:1-1:2). Suggeriamo di utilizzare obiettivi macro con una lunghezza focale compresa tra 50 mm e 100 (120) mm o equivalente sul sensore full-frame (24 mm x 36 mm). Le fotocamere con sensore più piccolo hanno dimensioni del sensore diverse e l'ingrandimento deve essere ricalcolato di conseguenza. Per la fotografia di fette di cuore, una distanza ergonomica dell'elemento frontale dell'obiettivo macro da 100 mm al soggetto è di circa 150 mm. Questa impostazione consente agli operatori di tenere tutte le apparecchiature su un tavolo, con un facile accesso ai comandi della telecamera. Un obiettivo macro da 50 mm potrebbe essere preso in considerazione per la fotografia di oggetti più grandi, come le fette di cervello, perché è necessario un campo visivo più ampio per ottenere tutte le fette in una singola fotografia.

Per ottenere immagini nitide ad alta risoluzione, una fotocamera deve essere montata su un supporto robusto, che, insieme a una configurazione leggera, è chiamato supporto per fotocopie fotografiche. Il montaggio della telecamera su un supporto e un trigger remoto (cablato o wireless) elimina le vibrazioni della fotocamera e garantisce una distanza costante dal bersaglio. Una configurazione di illuminazione della telecamera con due sorgenti luminose costanti da entrambi i lati, angolate di circa 30-60 ° rispetto al piano del soggetto, garantisce un'illuminazione sufficiente dei campioni e aiuta a evitare i riflessi allo stesso tempo. La fotocamera deve essere montata con precisione in modo che il sensore sia parallelo al piano del soggetto. Per illuminare uniformemente il campo dell'immagine, entrambe le lampade devono essere ugualmente orientate e posizionate alla stessa distanza dal soggetto. Le sorgenti luminose poste a varie distanze dal soggetto causano un'illuminazione irregolare. Inoltre, le sorgenti luminose lampeggianti sono un motivo per le variazioni nell'esposizione dell'immagine. Nel complesso, è importante posizionare con precisione la fotocamera e le fonti di luce per acquisire con precisione immagini di campioni ben illuminati.

I campioni di tessuto riflettono la luce (glisten), che appare come macchie bianche nelle immagini. Questi punti di riflessione della luce non contengono informazioni utili sul colore e, di conseguenza, queste parti delle immagini non possono essere utilizzate per un'analisi quantitativa accurata delle immagini. I riflessi di luce dalle fette di tessuto possono essere rimossi con vari metodi. Il più efficiente è la full immersion di campioni di tessuto in un contenitore con una soluzione salina o PBS. Un approccio simile è l'inserimento di fette di tessuto sotto (o tra) lastre di vetro. Questo metodo è efficace contro le riflessioni; tuttavia, la risoluzione dell'immagine può essere inferiore a quella delle fotografie di tessuti immersi.

Si può anche usare un filtro polarizzatore montato su una lente per eliminare i riflessi di luce. I filtri polarizzanti circolari sono ampiamente disponibili, ma variano considerevolmente in termini di qualità a seconda del prezzo e i filtri economici possono ridurre significativamente la risoluzione dell'immagine. La luce riflessa può essere filtrata ruotando la parte mobile del filtro polarizzatore ad angolo. L'efficacia del filtro polarizzatore potrebbe essere influenzata da alcune sorgenti luminose (ad esempio, una forte luce LED). Nel complesso, dopo la rimozione del liquido extra, un filtro polarizzatore può eliminare tutti i riflessi dalle fette di cervello; tuttavia, l'immersione del campione nella soluzione tampone è l'approccio più semplice ed economico per le fette di cuore.

Le impostazioni manuali della velocità dell'otturatore, dell'apertura, dell'ISO e del bilanciamento del bianco sono importanti per mantenere il pieno controllo del processo di imaging. Il campione, lo sfondo e le caratteristiche della sorgente luminosa influenzano il sistema di misurazione dell'esposizione della fotocamera in impostazioni automatiche; pertanto, le impostazioni manuali sono necessarie per mantenere costante l'esposizione e il bilanciamento del bianco tra più fotografie durante l'esperimento. Per la fotografia macro, l'impostazione di apertura suggerita è compresa tra f/8 e f/16. Diminuendo l'apertura, la profondità di campo aumenta, il che è utile se l'oggetto non si trova su un singolo piano. Tuttavia, la diffrazione limita la risoluzione totale della fotografia nel caso di aperture più piccole. L'apertura ottimale per la maggior parte degli obiettivi è di solito f/10 perché in questa impostazione, il calo di risoluzione è trascurabile e la profondità di campo è sufficiente. I valori ISO che vanno da 50 a 400 (più basso è meglio) sono in genere ottimali per ridurre al minimo gli artefatti dell'immagine (rumore). La velocità dell'otturatore rimane quindi da modificare per ottenere un'esposizione corretta utilizzando l'apertura menzionata e le impostazioni ISO nelle condizioni di luce esistenti. Le impostazioni manuali sono importanti per un'analisi coerente delle immagini. L'imaging standardizzato garantisce l'uso delle stesse impostazioni di soglia del colore in qualsiasi studio, che richiede l'analisi della segmentazione. Ad esempio, l'analisi semiautomatica da parte del software ImagePro basata su un file di segmentazione con colori predefiniti di blu, rosso e bianco (+ rosa pallido) può essere utilizzata nel corso degli anni se le immagini campione hanno colori coerenti, bilanciamento del bianco ed esposizione.

L'impostazione del bilanciamento del bianco deve essere regolata in base alla temperatura del colore della sorgente luminosa utilizzata per illuminare un campione. Il bilanciamento del bianco può essere selezionato dai preset integrati della fotocamera o utilizzando la calibrazione manuale di un bersaglio grigio. Il vantaggio dell'acquisizione dell'immagine in formato RAW è che il bilanciamento del bianco può essere regolato durante la post-elaborazione software dell'immagine. Poiché i file RAW contengono molte più informazioni rispetto ai file JPEG, la post-elaborazione dei file RAW offre un'eccellente opportunità per la correzione del bilanciamento del colore e dell'esposizione, nonché per ottenere una migliore risoluzione dell'immagine. Poiché la maggior parte delle fotocamere può acquisire file JPEG e RAW contemporaneamente, suggeriamo di acquisire il file RAW e salvarlo come backup.

Nel complesso, questo protocollo descrive una metodologia per l'affettamento e la colorazione del cuore e del tessuto cerebrale del ratto e fornisce linee guida per stabilire l'illuminazione e le configurazioni della fotocamera e le tecniche fotografiche per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione per ulteriori analisi. Questo metodo è applicabile a tutte le fotografie sperimentali di piccoli organi animali.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Sagimed	N/A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	298-96-4
5 mL syringe	Sagimed	N/A
50 mL syringe	Terumo	N/A
Adult Rat Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSRAS001-1
Aortic cannula for mouse heart	ADInstruments	SP3787
Aortic cannula for rat heart	ADInstruments	SP3786
Calcium chloride dihydrate, ≥99%	Acros Organics	207780010
Cover Glass Forceps, Angled	Fine Science Tools	11073-10
Hemostatic forceps	Agnthos	13008-12
Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter	Hoya	HOCPA62
Magnesium chloride hexahydrate	Penta	16330-31000
Methylene Blue	SigmaAldrich	M9140
Mouse Heart Slicer Matrix	Zivic Instruments	HSMS005-1
Polyethylene plastic tubing	BD Intramedic	N/A
Potassium chloride for biochemistry	Acros Organics	418205000
Potassium phosphate, monobasic, ≥99%	Acros Organics	205920025
Rat Heart Slicer Matrix	Zivic Instruments	HSRS001-1
Scissors curved with blunt ends	Agnthos	14013-15
Scissors for cleaning heart	Agnthos	14058-11
Single Edge Razor Blades	Zivic Instruments	BLADE012.1
Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5%	Acros Organics	447100010
Sodium chloride	Fisher bioreagents	BP358-10
Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera	Sony	ILCE6000	Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera
Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS	Sony	SEL90M28G	Important, lens should be compatible with camera
Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS	Sony	2190246141
Surgical blade	Heinz Herenz Hamburg Germany	BS2982
Thermo-Shaker	BioSan	PST-60HL-4
Toothed tissue forceps	Agnthos	11021-12
Toothed tissue forceps for cleaning heart	Agnthos	11023-10
Weigh tray, 70 mL	Sarsted	71,99,23,212