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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il modello di sanguinamento della transezione della vena della coda raffinata (TVT) nei topi anestetizzati è un metodo sensibile in vivo per la valutazione del sanguinamento emofilico. Questo modello di sanguinamento TVT ottimizzato utilizza la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint, perfezionando altri modelli ed evitando la morte come endpoint.

Abstract

I modelli di sanguinamento della coda sono strumenti importanti nella ricerca sull'emofilia, in particolare per la valutazione degli effetti procoagulanti. Il modello di sopravvivenza alla transezione della vena caudale (TVT) è stato preferito in molti contesti a causa della sensibilità a dosi clinicamente rilevanti di FVIII, mentre altri modelli consolidati, come il modello di clip di coda, richiedono livelli più elevati di composti procoagulanti. Per evitare di utilizzare la sopravvivenza come endpoint, abbiamo sviluppato un modello TVT che stabilisce la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint e l'anestesia completa durante l'intero esperimento. In breve, i topi anestetizzati vengono posizionati con la coda immersa in soluzione salina temperata (37 ° C) e dosati con il composto di prova nella vena laterale destra della coda. Dopo 5 minuti, la vena laterale sinistra della coda viene trasettata utilizzando una guida modello, la coda viene restituita alla soluzione salina e tutti gli episodi emorragici vengono monitorati e registrati per 40 minuti durante la raccolta del sangue. Se non si verifica alcun sanguinamento a 10 minuti, 20 minuti o 30 minuti dopo l'infortunio, il coagulo viene sfidato delicatamente pulendo il taglio due volte con un tampone di garza bagnato. Dopo 40 minuti, la perdita di sangue è quantificata dalla quantità di emoglobina sanguinata nella soluzione salina. Questa procedura veloce e relativamente semplice si traduce in sanguinamenti coerenti e riproducibili. Rispetto al modello di sopravvivenza TVT, utilizza una procedura più umana senza compromettere la sensibilità all'intervento farmacologico. Inoltre, è possibile utilizzare entrambi i sessi, riducendo il numero totale di animali che devono essere allevati, nel rispetto dei principi delle 3R. Una potenziale limitazione nei modelli di sanguinamento è la natura stocastica dell'emostasi, che può ridurre la riproducibilità del modello. Per contrastare questo, l'interruzione manuale del coagulo assicura che il coagulo venga sfidato durante il monitoraggio, impedendo all'emostasi primaria (piastrinica) di fermare il sanguinamento. Questa aggiunta al catalogo di modelli di lesioni emorragiche offre un'opzione per caratterizzare gli effetti procoagulanti in modo standardizzato e umano.

Introduzione

I modelli animali sono essenziali per comprendere la patogenesi dell'emofilia e sviluppare e testare regimi di trattamento e terapie. Il topo knock-out fattore VIII (F8-KO) è un modello ampiamente utilizzato per lo studio dell'emofilia A 1,2. Questi topi ricapitolano le caratteristiche chiave della malattia e sono stati ampiamente utilizzati per lo sviluppo di trattamenti, come i prodotti FVIII ricombinanti 3,4,5 e le strategie di terapia genica 6,7.

Esistono vari modelli di lesioni emorragiche per valutare gli effetti farmacologici di diversi composti emostatici in vivo. Uno di questi modelli di coagulazione è il modello di sopravvivenza alla traslazione della vena della coda nei topi 8,9,10,11,12,13,14, che misura la capacità dei topi emofili di sopravvivere al dissanguamento dopo la traslazione della coda. Questo metodo è stato introdotto più di quattro decenni fa15 ed è ancora utilizzato 9,16,17. Tuttavia, il modello utilizza la sopravvivenza come endpoint e richiede l'osservazione degli animali per un periodo fino a 24 ore, durante il quale gli animali sono coscienti e quindi possono provare dolore e angoscia.

Modelli sanguinanti di durata più breve e in anestesia completa sono stati descritti in precedenza, come il modello di clip di coda (noto anche come punta della coda)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Tuttavia, per una completa normalizzazione della perdita di sangue dopo la sfida emorragica, questi modelli richiedono dosi di composti procoagulanti (ad esempio, FVIII) molto più elevate di quelle somministrate clinicamente29. Un diverso modello di lesione in anestesia, il metodo di sanguinamento della vena saphena, è sensibile a dosi più basse di composti procoagulanti30, ma richiede un alto livello di intervento dello sperimentatore poiché i coaguli devono essere interrotti frequentemente (al contrario di 3 volte nel modello presentato).

La standardizzazione verso un protocollo comune per testare nuovi composti procoagulanti faciliterebbe notevolmente il confronto dei dati tra i laboratori 31,32,33. Nei modelli TVT, non esiste ancora un accordo comune sugli endpoint studiati (perdita di sangue 7,26, tempo di sanguinamento 9,34 e tasso di sopravvivenza 35,36) e la lunghezza sperimentale varia tra gli studi13.

Il nostro obiettivo primario è quello di descrivere e caratterizzare un modello ottimizzato con elevata riproducibilità, la possibilità di studiare on-demand e un trattamento profilattico, la sensibilità all'intervento farmacologico equivalente al modello di sopravvivenza, ma non utilizzando la morte o la pre-morte come endpoint. Al fine di ridurre il dolore e l'angoscia, gli animali non dovrebbero essere coscienti durante il sanguinamento e un endpoint più etico deve essere implementato37.

I modelli di clip di coda sono generalmente condotti in una delle due varianti, amputando la punta della coda, ad esempio amputazione di 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 o, in una variante più grave, transettata ad un diametro di coda di circa 1-3 mm 8,22,25 . Ciò provoca un sanguinamento artero-venoso combinato, poiché le vene laterali e dorsali e l'arteria ventrale sono solitamente recise e, in generale, maggiore è l'amputazione, minore è la sensibilità a un composto procoagulante. Inoltre, poiché la punta della coda viene amputata, la lesione artero-venosa viene esposta senza alcun tessuto opposto; quindi, almeno in teoria, è dissimile dai più comuni sanguinamenti emofilici.

Come suggerisce il nome, solo la vena è ferita nei modelli di trasezione della vena della coda come descritto in questo articolo, causando così un sanguinamento esclusivamente venoso. Poiché il vaso non è completamente reciso, la lesione dovrebbe essere più piccola rispetto ai modelli di amputazione e il tessuto intorno al taglio, a cui un coagulo può aderire, viene trattenuto. Inoltre, c'è una pressione sanguigna più bassa nella vena rispetto all'arteria. Questi fattori contribuiscono ad una maggiore sensibilità rispetto ai modelli di amputazione, in modo tale che la normalizzazione del sanguinamento può essere raggiunta con dosi clinicamente rilevanti di terapia sostitutiva, ad esempio con rFVIII nell'emofilia A, che è utile per valutare l'entità e la durata degli effetti del trattamento procoagulante 26,38,39.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dall'Animal Welfare Body di Novo Nordisk A/S e dall'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali, il Ministero danese dell'alimentazione, dell'agricoltura e della pesca. Il metodo ottimizzato di 40 minuti include l'anestesia e il tempo di dosaggio nella progettazione (Figura 1). Per questa procedura sono necessari topi emofili di entrambi i sessi tra le 10-16 settimane di età.

1. Preparativi prima dello studio

  1. Preparare le soluzioni dosatrici nelle concentrazioni corrette.
  2. Iniziare il bagno d'acqua e riscaldare a 37 °C. Riempire le provette centrifughe da 15 ml per la raccolta del sangue con soluzione salina (0,9% NaCl).
  3. Posizionare i tubi salini da 15 ml nei fori della piastra di base riscaldata almeno 15 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
  4. Identifica i topi e registra il loro peso. Evitare di maneggiare i topi più del necessario in quanto ciò può causare stress e influenzare lo studio.
  5. Preparare la postazione di lavoro nella cappa aspirante prima di procedere in modo che tutto sia a portata di mano: tovaglioli, portacocca, garza, siringhe, bisturi, cronometri e carta di notazione del flusso sanguigno.
  6. Posizionare il segno di coda e tagliare i blocchi sulla piastra riscaldante - i blocchi freddi faranno contrarre le vene e quindi influenzeranno il sanguinamento.

2. Anestesia

  1. Eseguire la procedura di anestesia isoflurano all'interno di una cappa aspirante.
  2. Impostare il vaporizzatore a gas su isoflurano inizialmente al 5% in 30% O2/70% N2O nella camera di anestesia con portata 1 L/min. Lasciare un tempo sufficiente per il riempimento della camera di anestesia (circa 5 minuti a seconda del volume della camera e della portata del gas). Garantire un'induzione rapida (meno di un minuto).
  3. Metti i topi nella camera di anestesia fino a quando non perdono conoscenza.
    NOTA: Ciò dovrebbe avvenire entro un minuto o meno se la camera è sufficientemente riempita.
  4. Garantire una corretta anestesia dall'assenza di risposta dolorosa al riflesso del pedale (pizzico fermo della punta).
  5. Posizionare i topi sulla piastra riscaldante, assicurandosi che il naso sia nel cono del naso.
  6. Ridurre l'anestesia a un livello di mantenimento del 2% di isoflurano in 30% O2/70% N2O e posizionare un coperchio di plastica sopra i topi per ridurre la perdita di calore. Applicare un unguento per gli occhi adatto per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  7. Contrassegnare la coda con un diametro di 2,5 mm utilizzando il blocco del segno di coda. Non forzare la coda nella fessura nel blocco - deve adattarsi perfettamente (Figura supplementare 1)
  8. Posizionare la coda nel tubo salino per almeno 5 minuti per garantire una vena della coda calda che sia ottimale per il dosaggio endovenoso (e.v.).

3. Dosaggio della soluzione di prova

  1. Metti un topo nel supporto della coda con il naso in una maschera di anestesia.
  2. Dosare l'animale con il composto di interesse (in questo caso, rFVIII) e avviare immediatamente il cronometro (t = 0).
  3. Riposizionare il mouse sulla piastra riscaldante con la coda nel tubo salino. Ripeti la procedura con gli altri topi.

4. Esecuzione della transezione della vena della coda

  1. Eseguire la traslazione della vena della coda esattamente 5 minuti dopo la somministrazione. Posizionare la coda nel blocco di taglio e ruotare di 90° per esporre la vena (Figura supplementare 2).
  2. Eseguire il taglio sul lato opposto/vena da dove è stata dosata la soluzione di prova.
  3. Disegna la lama del bisturi #11 attraverso la fessura del blocco di taglio che tiene la coda per creare sanguinamento. Reimpostare il cronometro e riportare immediatamente la coda alla soluzione salina.

5. Tempo di osservazione e sfide

  1. Osservare l'emorragia e annotare l'inizio e l'arresto dell'emorragia per 40 minuti; annotalo sulla carta di notazione del flusso sanguigno.
    NOTA: Questa valutazione visiva del sanguinamento può variare leggermente a causa della soggettività.
  2. Il sanguinamento primario deve fermarsi entro 3 minuti dopo il taglio. Se questo non è il caso, squalificare il topo, eutanasizzare e sostituire (il mancato arresto dell'emorragia primaria può indicare una lesione troppo grave o una mancanza di emostasi primaria, come nei topi vWF KO).
  3. Se non c'è sanguinamento a 10 minuti, 20 minuti e 30 minuti dopo l'infortunio, sfidare il taglio della coda come descritto nei passaggi 4-5.
  4. Utilizzare un tampone di garza imbevuto di soluzione salina calda da un tubo separato tenuto a bagnomaria. Sollevare la coda dalla soluzione salina e pulire delicatamente due volte con la garza bagnata in direzione distale sopra il taglio della coda.
  5. Dopo ogni sfida, immergere immediatamente nuovamente la coda nel tubo salino.
  6. A t = 40 min, interrompere la raccolta del sangue rimuovendo la coda dal tubo salino.

6. Prelievo di sangue

  1. Dopo t = 40 min, ottenere campioni di sangue dalla vena sopraorbitale.

7. Eutanasia

  1. Eutanasia dei topi per lussazione cervicale mentre erano ancora in anestesia completa.

8. Trattamento dei campioni

  1. Centrifugare le provette di raccolta del sangue da 15 ml con soluzione salina a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Scartare il surnatante dai tubi da 15 mL, risospesciare il pellet in 2-14 mL di soluzione lisciante per eritrociti (RBC) e quindi diluirlo fino a raggiungere un colore chiaro del caffè.
  3. Notare il volume totale (volume di sangue + volume di soluzione di lisi degli eritrociti (RBC) aggiunto utilizzando i segni di graduazione sul tubo).
  4. Trasferire 2 ml della diluizione in un tubo di emoglobina e conservarlo in frigorifero fino all'analisi dell'emoglobina.
  5. Determinare la perdita di sangue misurando la concentrazione di emoglobina nella soluzione salina. Misurare l'assorbanza a 550 nm su un lettore di micropiastre (Tabella dei materiali).
  6. Convertire l'assorbanza in emoglobina nmol utilizzando una curva standard preparata dall'emoglobina umana (Tabella dei materiali) e correggere la diluizione con soluzione di lisante RBC.

9. Analisi statistiche

  1. Analizzare i dati utilizzando un software appropriato. Qui è stato utilizzato il software GraphPad Prism. Nel corso di una serie di studi, i seguenti metodi statistici sono risultati per funzionare bene.
    NOTA: Per analizzare la perdita di sangue, il tempo di sanguinamento, l'esposizione, la conta piastrinica e l'ematocrito; È stato utilizzato il test ANOVA di Brown-Forsythe e Welch (poiché i dati erano continui ma senza omogeneità di varianza dei residui) applicando il test di Dunnett per adattarsi a confronti multipli. Un test di Pearson è stato utilizzato per testare le correlazioni tra tempo di sanguinamento, perdita di sangue e dosi. Per determinare i valori di ED50 , è stata montata un'equazione di risposta inversa (dose) a quattro parametri sui dati di sanguinamento e perdita di sangue. Per analizzare l'effetto di genere, è stato utilizzato un test ANOVA bidirezionale, applicando la correzione di Bonferroni per adattarsi a confronti multipli. Il livello di significatività è stato definito come P < 0,05. I dati vengono visualizzati come mezzi ± SEM.

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Risultati

Per valutare l'applicabilità del modello ottimizzato, è stato condotto uno studio su topi F8-KO (background genetico C57BL) somministrati con una terapia sostitutiva con fattore VIII ricombinante disponibile in commercio (rFVIII); sono state testate quattro diverse dosi: 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg. Inoltre, abbiamo testato il corrispondente controllo del veicolo (negativo) nei topi F8-KO e nel gruppo wild-type (WT) utilizzando topi C57BL come gruppo di controllo positivo per valutare l'intervallo di risposta...

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Discussione

Questo metodo ottimizzato di transezione della vena della coda (TVT) presenta diversi vantaggi rispetto al metodo di sopravvivenza TVT. Gli animali sono completamente anestetizzati per l'intera durata dello studio, il che rende più facile la manipolazione del topo e aumenta il benessere degli animali. Inoltre, a differenza del modello di sopravvivenza TVT, non è richiesta l'osservazione notturna e questo modello ottimizzato offre la possibilità di misurare la perdita di sangue e osservare il tempo esatto di sanguiname...

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Divulgazioni

Gli autori sono o erano dipendenti e/o azionisti di Novo Nordisk A/S al momento della realizzazione di questa ricerca.

Riconoscimenti

Esther Bloem e Thomas Nygaard sono riconosciuti per il supporto con le misurazioni di FVIII nel plasma. Bo Alsted è riconosciuta per aver disegnato e lavorato la sagoma e i blocchi di taglio.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 Scalpel bladeSwann-Morton503
15 mL centrifuge tubesGreiner Bio-One, Austria188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosingBD Micro-Fine + U-100 insulin syringe320830
AdvateTakeda, JapanRecombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanolHartmann, Soft-Zellin999 979
CentrifugeOmnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawingsSupplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solutionLysebio, ABX Diagnostics906012
Gauze
Haematological analyserSysmexCT-2000iv
Heating lamp on standPhillipsIR250
Heating pad with thermostatCMAmodel 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependentHemoCue, DenmarkHemoCue calibrator, 707037Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction boxSigma Delta Dameca
IsofluraneBaxter26675-46-7
Magnifier with lightsEschenbach
Measuring template (Aluminum)Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawingsSupplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tipsFinnpipette
PhotometerMolecular Devices Corporation, CA, USASpectraMax 340 photometer
Prism SoftwareGraphPad, San Diego, CA, USAVersion 9.0.1
Saline 0.9% NaClFresenius Kabi, Sweden883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suctionVacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostatTYP 3/8 Julabo

Riferimenti

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