Studio di modelli sperimentali di donazione di organi per il trapianto di polmone

Riepilogo

Il presente studio mostra la creazione di tre diversi modelli di donazione polmonare (donazione post-morte cerebrale, donazione post-morte circolatoria e donazione post-shock emorragico). Confronta i processi infiammatori e i disturbi patologici associati a questi eventi.

Abstract

I modelli sperimentali sono strumenti importanti per comprendere i fenomeni eziologici coinvolti in vari eventi fisiopatologici. In questo contesto, diversi modelli animali sono utilizzati per studiare gli elementi che innescano la fisiopatologia della disfunzione primaria del trapianto dopo il trapianto per valutare potenziali trattamenti. Attualmente, possiamo dividere i modelli di donazione sperimentale in due grandi gruppi: donazione dopo morte cerebrale e donazione dopo arresto circolatorio. Inoltre, gli effetti deleteri associati allo shock emorragico dovrebbero essere considerati quando si considerano modelli animali di donazione di organi. Qui, descriviamo la creazione di tre diversi modelli di donazione polmonare (donazione post-morte cerebrale, donazione post-morte circolatoria e donazione post-shock emorragico) e confrontiamo i processi infiammatori e i disturbi patologici associati a questi eventi. L'obiettivo è quello di fornire alla comunità scientifica modelli animali affidabili di donazione polmonare per lo studio dei meccanismi patologici associati e la ricerca di nuovi bersagli terapeutici per ottimizzare il numero di innesti vitali per il trapianto.

Introduzione

Rilevanza clinica
Il trapianto d'organo è un'opzione terapeutica consolidata per diverse patologie gravi. Negli ultimi anni, sono stati raggiunti molti progressi nei campi clinici e sperimentali del trapianto d'organo, come una maggiore conoscenza della fisiopatologia della disfunzione primaria del trapianto (PGD) e progressi nelle aree della terapia intensiva, dell'immunologia e della farmacologia ^1,2,3. Nonostante i risultati e i miglioramenti nella qualità delle relative procedure chirurgiche e farmacologiche, il rapporto tra il numero di organi disponibili e il numero di riceventi in lista d'attesa rimane una delle principali sfide ^2,4. A questo proposito, la letteratura scientifica ha proposto modelli animali per lo studio di terapie che possono essere applicate ai donatori di organi per trattare e/o conservare gli organi fino al momento del trapianto 5,6,7,8.

Imitando i diversi eventi osservati nella pratica clinica, i modelli animali consentono di studiare i meccanismi patologici associati e i rispettivi approcci terapeutici. L'induzione sperimentale di questi eventi, nella maggior parte dei casi isolati, ha generato modelli sperimentali di donazione di organi e tessuti che sono ampiamente indagati nella letteratura scientifica sui trapianti d'organo 6,7,8,9. Questi studi impiegano diverse strategie metodologiche, come quelle che inducono la morte cerebrale (BD), lo shock emorragico (HS) e la morte circolatoria (CD), poiché questi eventi sono associati a diversi processi deleteri che compromettono la funzionalità degli organi e dei tessuti donati.

Morte cerebrale (BD)
La BD è associata ad una serie di eventi che portano al progressivo deterioramento di diversi sistemi. Di solito si verifica quando si verifica un aumento acuto o graduale della pressione intracranica (ICP) a causa di un trauma cerebrale o di un'emorragia. Questo aumento dell'ICP promuove un aumento della pressione sanguigna nel tentativo di mantenere un flusso sanguigno cerebrale stabile in un processo noto come riflesso di Cushing^10,11. Questi cambiamenti acuti possono provocare disfunzioni cardiovascolari, endocrine e neurologiche che compromettono la quantità e la qualità degli organi donati, oltre ad avere un impatto sulla morbilità e sulla mortalità post-trapianto 10,11,12,13.

Shock emorragico (HS)
L'HS, a sua volta, è spesso associata ai donatori di organi, poiché la maggior parte di loro è vittima di traumi con una significativa perdita di volume del sangue. Alcuni organi, come i polmoni e il cuore, sono particolarmente vulnerabili all'HS a causa dell'ipovolemia e della conseguente ipoperfusione tissutale¹⁴. L'HS induce lesioni polmonari attraverso l'aumento della permeabilità capillare, l'edema e l'infiltrazione di cellule infiammatorie, meccanismi che insieme compromettono lo scambio gassoso e portano al progressivo deterioramento dell'organo, facendo deragliare di conseguenza il processo di donazione ^6,14.

Morte circolatoria (MC)
L'uso della donazione post-CD è cresciuto in modo esponenziale nei principali centri mondiali, contribuendo così all'aumento del numero di organi prelevati. Gli organi recuperati da donatori post-MC sono vulnerabili agli effetti dell'ischemia calda, che si verifica dopo un intervallo di scarso (fase agonica) o di assenza di afflusso di sangue (fase asistolica)^8,15. L'ipoperfusione o l'assenza di flusso sanguigno porterà all'ipossia tissutale associata alla brusca perdita di ATP e all'accumulo di tossine metaboliche nei tessuti¹⁵. Nonostante il suo attuale utilizzo per il trapianto nella pratica clinica, permangono molti dubbi sull'impatto dell'uso di questi organi sulla qualità dell'innesto post-trapianto e sulla sopravvivenza del paziente¹⁵. Pertanto, anche l'uso di modelli sperimentali per una migliore comprensione dei fattori eziologici associati alla MC è in crescita 8,15,16,17.

Modelli sperimentali
Esistono vari modelli sperimentali di donazione di organi (BD, HS e CD). Tuttavia, gli studi spesso si concentrano su una sola strategia alla volta. C'è una notevole lacuna negli studi che combinano o confrontano due o più strategie. Questi modelli sono molto utili nello sviluppo di terapie che cercano di aumentare il numero di donazioni e di conseguenza diminuire la lista d'attesa dei potenziali riceventi. Le specie animali utilizzate a questo scopo variano da studio a studio, con modelli suini che sono più comunemente selezionati quando l'obiettivo è una traduzione più diretta con la fisiologia morfofologica umana e meno difficoltà tecniche nella procedura chirurgica a causa delle dimensioni dell'animale. Nonostante i benefici, le difficoltà logistiche e i costi elevati sono associati al modello suino. D'altra parte, il basso costo e la possibilità di manipolazione biologica favoriscono l'utilizzo di modelli di roditori, consentendo al ricercatore di partire da un modello affidabile per riprodurre e trattare le lesioni, nonché di integrare le conoscenze acquisite nel campo del trapianto d'organo.

Qui, presentiamo un modello di roditore di morte cerebrale, morte circolatoria e donazione di shock emorragico. Descriviamo i processi infiammatori e le condizioni patologiche associate a ciascuno di questi modelli.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati conformi al Comitato Etico per l'Uso e la Cura degli Animali da Esperimento della Facoltà di Medicina dell'Università di San Paolo (numero di protocollo 112/16).

1. Raggruppamento degli animali

1. Assegnare in modo casuale dodici ratti maschi di Sprague Dawley (250-300 g) a uno dei tre gruppi sperimentali (n=4) per analizzare e confrontare gli effetti associati ai modelli animali.
2. Assegnare gli animali al gruppo di shock emorragico (HS, n=4): animali sottoposti a cateterismo vascolare con induzione di shock emorragico + mantenimento per 360 min + estrazione del blocco cardiopolmonare + preparazione del campione per l'analisi.
3. Assegnare gli animali al gruppo di morte cerebrale (BD, n=4): animali sottoposti a morte cerebrale + mantenimento per 360 min + estrazione del blocco cardiopolmonare + preparazione del campione per l'analisi.
4. Assegnare gli animali al gruppo di morte circolatoria (CD, n=4): animali sottoposti a cateterismo vascolare + induzione della morte circolatoria + sospensione della ventilazione + ischemia a temperatura ambiente per 180 min + preparazione del campione per l'analisi.

2. Anestesia e preparazione prechirurgica

1. Mettere il ratto in una camera chiusa con isoflurano al 5% per 1-4 minuti. Confermare la corretta anestesia controllando il riflesso di pizzicamento della punta. In assenza di reazioni riflesse (nessuna retrazione della zampa), eseguire l'intubazione orotracheale (angiocath 14-G) con l'ausilio di un laringoscopio pediatrico.
2. Con un ventilatore meccanico precedentemente regolato (FiO₂ 100%, volume corrente 10 mL/kg, 90 cicli/min e PEEP 3,0 cmH₂O), collegare il catetere tracheale al ventilatore e regolare la concentrazione di anestetico al 2%.
   NOTA: Tutte le procedure relative ai modelli animali hanno seguito lo stesso protocollo anestetico descritto in questa sezione.
3. Rimuovere il pelo dalle regioni di interesse (testa, collo, petto e addome). Quindi, utilizzando una garza, disinfettare il campo operatorio e la coda dell'animale. La disinfezione viene eseguita con tre cicli alternati di una soluzione alcolica di scrub clorexidina digluconato.
4. Taglia la punta della coda dell'animale, posiziona il pollice e l'indice sulla base della coda, quindi premili e allontanali dalla base. Raccogliere un campione di sangue periferico (20 μL) attraverso la coda per la conta leucocitaria totale⁸.
   NOTA: Questa procedura deve essere eseguita prima dell'inizio della tracheostomia e immediatamente alla fine di ogni protocollo (BD e HS - dopo 360 min).
5. Utilizzare una pipetta di precisione per diluire il sangue raccolto in 380 μL (1:20) di soluzione di Turk (acido acetico glaciale 99%). Una volta diluito, pipettare il campione di sangue in una camera Neubauer e posizionarlo al microscopio (40x). Eseguire la conta leucocitaria totale nei quattro quadranti laterali della camera.

3. Tracheostomia

1. Con l'aiuto di apposite forbici e pinze, eseguire la dissezione longitudinale della trachea cervicale, partendo dal terzo medio del collo fino all'intaglio soprasternale (incisione di 1,5 cm). Dopo l'incisione della pelle e del tessuto sottocutaneo, sezionare i muscoli cervicali fino a quando la trachea non è esposta.
2. Posizionare una legatura di seta 2-0 sotto la trachea.
3. Usando le microforbici, tracheostomizzare il terzo superiore della trachea per ottenere una ventilazione uniforme. Tagliare orizzontalmente la trachea tra due anelli cartilaginei per accogliere il diametro di una cannula metallica (3,5 cm).
4. Inserire il tubo di ventilazione e fissarlo con legature predisposte.
5. Collegare il tubo di ventilazione al sistema di ventilazione per animali di piccola taglia.
6. Ventilare il ratto con un volume corrente di 10 ml/kg, una velocità di 70 cicli/min e una PEEP di 3 cmH₂O.

4. Cateterismo dell'arteria e delle vene femorali

1. Esporre il triangolo femorale attraverso una piccola incisione (1,5 cm) nella regione inguinale. Identificare e isolare i vasi femorali. Per questa procedura, utilizzare uno stereomicroscopio (ingrandimento 3,2x).
2. Posizionare due legature di seta 4-0 sotto i vasi sanguigni (vena o arteria), una distale e l'altra prossimale. Chiudere la legatura più distale, quindi fare un nodo preregolato nella legatura prossimale e tirare.
3. Inserire il catetere attraverso una piccola incisione preformata nei vasi. Fissare la cannula per evitare lussazioni.
   NOTA: Realizzare i cateteri da un estensore neonatale di 20 cm saldato mediante riscaldamento a un catetere endovenoso periferico adatto al calibro della rete venosa dell'animale, prevenendo così il rigurgito del contenuto ematico. Lubrificare la cannula con eparina, evitando la formazione di trombi e complicazioni durante la misurazione della pressione arteriosa media (MAP).
4. Collegare il catetere arterioso a un trasduttore di pressione e a un sistema di monitoraggio dei segni vitali per registrare la pressione arteriosa media (MAP). Il trasduttore deve essere posizionato a livello del cuore dell'animale. Registrare la MAP ogni 10 minuti.
5. Posizionare il catetere siringa (3 ml) nella vena, mirando all'idratazione e al dissanguamento quando necessario.

5. Induzione da shock emorragico

1. Attraverso l'accesso venoso e con una siringa eparinizzata, prelevare piccoli volumi di sangue fino a raggiungere valori di MAP di 50 mmHg, instaurando così uno shock emorragico.
   NOTA: Raccogliere un'aliquota di 2 ml di sangue ogni 10 minuti nella prima ora dell'esperimento e ogni 30 minuti nelle ore successive.
2. Mantenere la pressione stabile a circa 50 mmHg per un periodo di 360 minuti. A tal fine, rimuovere o aggiungere aliquote di sangue se la pressione aumenta o diminuisce, rispettivamente.
3. Metti una fonte di calore nelle vicinanze per evitare l'ipotermia.
   NOTA: In questo caso viene utilizzata una lampada riscaldante.
4. Al termine del protocollo, prelevare il blocco polmonare alla capacità polmonare totale (TLC) e congelarlo in azoto liquido o metterlo in una soluzione di fissaggio per ulteriori studi.
   NOTA: Con l'aiuto di un ventilatore per animali di piccola taglia, è possibile accedere ai parametri ventilatori durante il protocollo. Nel presente studio, questi parametri sono stati valutati immediatamente prima dell'induzione dell'HS (basale) e 360 minuti dopo (finale).

6. Induzione della morte circolatoria

1. Per indurre la morte circolatoria, somministrare 150 mg/kg di tiopentale di sodio attraverso la linea venosa. Quindi spegnere il sistema di ventilazione.
2. Si noti la progressiva diminuzione della MAP fino a raggiungere 0 mmHg. Da questo punto, considera l'inizio del periodo di ischemia calda e inizia il conteggio del tempo. L'animale deve rimanere a temperatura ambiente (circa 22 °C) per 180 min.
3. Al termine del protocollo, ricollegare i polmoni al ventilatore meccanico e prelevare il blocco polmonare presso TLC per la raccolta. Congelare con azoto liquido o metterlo nella soluzione di fissazione per ulteriori studi.

7. Induzione della morte cerebrale

1. Metti il ratto in posizione prona.
2. Rimuovere la pelle dal cranio usando le forbici chirurgiche. Praticare un foro calibro 1 mm, 2,80 mm anteriormente e 10,0 mm ventrale alla bregma e 1,5 mm lateralmente alla sutura sagittale.
3. Inserire l'intero catetere a palloncino nella cavità cranica e assicurarsi che il palloncino sia preriempito con soluzione fisiologica (500 μL).
4. Con l'aiuto di una siringa, gonfiare rapidamente il catetere.
5. Confermare la morte cerebrale osservando un brusco aumento della MAP (riflesso di Cushing), l'assenza di riflessi, la midriasi bilaterale e l'apnea. Dopo la conferma, interrompere l'anestesia e tenere l'animale in ventilazione meccanica per 360 minuti.
6. Posizionare una fonte di calore nelle vicinanze per evitare l'ipotermia.
7. Al termine del protocollo, prelevare il blocco polmonare presso TLC per la raccolta e congelarlo in azoto liquido o metterlo in una soluzione di fissaggio per ulteriori studi.
   NOTA: Con l'aiuto di un ventilatore per animali di piccola taglia, è possibile accedere ai parametri ventilatori durante il protocollo. Nel presente studio, abbiamo valutato questi parametri immediatamente prima dell'induzione BD (Basale) e dopo 360 minuti (Finale).

Risultati

Pressione arteriosa media (MAP)
Per determinare le ripercussioni emodinamiche di BD e HS, la MAP è stata valutata per 360 minuti del protocollo. La misurazione basale è stata raccolta dopo la rimozione della pelle e la perforazione del cranio e prima della raccolta di aliquote di sangue per gli animali sottoposti a BD o HS, rispettivamente. Prima dell'induzione di BD e HS, la MAP basale dei due gruppi era simile (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; ANOVA a due vie). Dopo l'insufflazio...

Discussione

Negli ultimi anni, il crescente numero di diagnosi di morte cerebrale l'ha portata a diventare il più grande fornitore di organi e tessuti destinati al trapianto. Questa crescita, però, è stata accompagnata da un incredibile aumento delle donazioni dopo la morte circolatoria. Nonostante la sua natura multifattoriale, la maggior parte dei meccanismi scatenanti delle cause di morte iniziano dopo o accompagnano il trauma con un'estesa perdita di contenuto ematico ^4,18<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers