Generazione ed espansione delle linee tumorali primarie e maligne del mesotelioma pleurico

Riepilogo

L'obiettivo di questo documento di metodo è dimostrare una metodologia robusta e riproducibile per l'arricchimento, la generazione e l'espansione di linee cellulari tumorali primarie da mesotelioma pleurico resecato chirurgicamente.

Abstract

Mancano le attuali metodologie per l'espansione delle linee cellulari tumorali primarie da tipi di tumore rari. Questo protocollo descrive i metodi per espandere le cellule tumorali primarie dal mesotelioma pleurico maligno (MPM) resecato chirurgicamente fornendo una panoramica completa del processo dalla digestione all'arricchimento, all'espansione, alla crioconservazione e alla caratterizzazione fenotipica. Inoltre, questo protocollo introduce concetti per la generazione di tumori che possono essere utili per più tipi di tumore come la tripsinizzazione differenziale e l'impatto dei metodi di dissociazione sulla rilevazione di marcatori di superficie cellulare per la caratterizzazione fenotipica. Il principale limite di questo studio è la selezione di cellule tumorali che si espanderanno in un sistema di coltura bidimensionale (2D). Variazioni a questo protocollo, inclusi sistemi di coltura tridimensionali (3D), integratori di supporti, rivestimento di piastre per migliorare l'adesione e metodi di disaggregazione alternativi, potrebbero migliorare questa tecnica e il tasso di successo complessivo della creazione di una linea tumorale. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo di base per stabilire e caratterizzare le cellule tumorali da questo raro tumore.

Introduzione

Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore raro altamente associato all'esposizione all'amianto. Sebbene gli approcci basati sull'immunoterapia abbiano mostrato risultati incoraggianti, c'è una scarsità di opzioni di trattamento disponibili per i pazienti che sviluppano questa malattia e il tasso di sopravvivenza complessivo a 5 anni è basso ^1,2. Sono in corso sforzi in più istituzioni per comprendere meglio questa malattia e identificare nuovi bersagli terapeutici che possono migliorare i risultati dei pazienti. Mentre ci sono più modelli murini di mesotelioma, l'accesso alle cellule tumorali del mesotelioma primario è più limitato³. L'espansione in vitro delle cellule tumorali del mesotelioma primario fornirebbe un prezioso sistema modello che può essere utilizzato per studiare direttamente le cellule tumorali e la loro interazione con le cellule immunitarie autologhe come i linfociti infiltranti il tumore. Mentre ci sono state segnalazioni sull'espansione delle linee di cellule tumorali del mesotelioma primario, queste sono poche e non forniscono una procedura operativa standard dettagliata (SOP). Inoltre, poche linee cellulari sono disponibili da fonti commerciali come American Type Culture Collection (ATCC). Mentre la disponibilità di linee tumorali primarie è limitata, è stato dimostrato che le cellule tumorali possono essere espanse da versamenti pleurici e direttamente dal tessuto tumorale ^4,5. Inoltre, le linee cellulari tumorali espanse hanno dimostrato di preservare il profilo molecolare del tumore originale ^4,5,6.

Il nostro laboratorio sta studiando il microambiente immuno-tumorale del MPM e ha sviluppato un metodo per espandere le linee primarie di cellule tumorali MPM da casi resecati chirurgicamente. Questo metodo è adattato dalla nostra esperienza nello stabilire linee cellulari tumorali di melanoma metastatico primario. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un approccio dettagliato e pratico all'espansione della linea tumorale del mesotelioma primario utilizzando un sistema di modelli 2D e la successiva profilazione fenotipica. Dato il recente successo delle strategie di blocco dei checkpoint mirate a CTLA4 e PD-1 nell'impostazione di prima linea², la capacità di generare molte linee tumorali primarie potrebbe favorire la comprensione di entrambi i meccanismi intrinseci di resistenza del tumore e fornire un importante sistema modello per valutare il riconoscimento delle cellule T, approfondendo così la nostra comprensione della risposta immunitaria nel MPM.

Il principale limite di questo protocollo è che ogni tumore contiene un microambiente diverso e c'è un alto grado di variabilità del successo dell'espansione. Inoltre, questo metodo seleziona le cellule tumorali che possono espandersi in un sistema di coltura 2D. Altri metodi che prevedono la produzione di una coltura sferoide o organoide 3D potrebbero fornire un approccio alternativo che potrebbe consentire un più alto tasso di successo di espansione o comportare la capacità di derivare linee cellulari che non sono in grado di espandersi in un sistema 2D tradizionale. Tali colture 3D hanno dimostrato di essere utili per la generazione di tipi di tumore che sono difficili da espandere, ad esempio il cancro del pancreas⁷.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institution Review Board (IRB) dell'Università del Texas MD Anderson Cancer Center. Ciò riguarda i tumori MPM standard-of-care, resecati chirurgicamente, rimossi a seguito del consenso informato.

1. Preparazione dei mezzi di digestione tumorale e di altri mezzi associati

1. Per preparare i mezzi di digestione tumorale, aggiungere 5 ml di 100% Pen/Strep (Penicillina/Streptomicina) a 500 mL di mezzo sterile Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 in una cappa a flusso laminare.
   1. Trasferire il mezzo in un filtro sterile da 500 mL, 0,22 μm in polietersolfone (PES) per la filtrazione sotto vuoto.
      NOTA: le fasi di filtrazione e aspirazione devono essere eseguite con una pressione di vuoto standard di 75-150 torr.
   2. Etichettare e datare il mezzo di digestione del tumore e conservarlo a 4 °C.
      NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.
2. Per preparare il cocktail enzimatico che digerisce il tumore, aggiungere 2,5 mL di collagenasi al 3% di tipo 1, 1 mL di 1,5 mg/mL di ialuronidasi, 20 μL di 250.000 unità/mL di DNAse da 1 a 16,5 mL di mezzo di digestione in un tubo conico da 50 mL in una cappa a flusso laminare.
   NOTA: Il volume totale del cocktail enzimatico che digerisce il tumore è di 20 ml; tuttavia, sono necessari solo 10 ml per campione di tumore. Pertanto, il cocktail rimanente può essere conservato a -20 °C fino a quando necessario. Non ricongelare le aliquote.
3. Per preparare il mezzo tumorale completo, aggiungere 5 mL di 100% Pen/Strep e 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.
   1. Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 500 mL, 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.
   2. Etichettare e datare il mezzo tumorale completo e conservarlo a 4 °C.
      NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.
4. Per preparare il mezzo sierico ridotto per la fame, aggiungere 5 mL di 100% Pen/Strep e 5 mL di FBS a 500 mL di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.
   1. Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 500 mL, 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.
   2. Etichettare e datare il mezzo a siero ridotto e conservarlo a 4 °C.
      NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.
5. Per preparare il mezzo di congelamento, aggiungere 5 mL di dimetilsolfossido (DMSO) a 45 ml di FBS in una cappa a flusso laminare.
   1. Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 50 ml e 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.
   2. Etichettare e datare cinque tubi conici da 15 mL.
   3. Trasferire 10 mL di mezzo di congelamento in ciascun tubo e conservare i tubi a -20 °C.
6. Per preparare un mezzo privo di antibiotici per il test del micoplasma, aggiungere 50 ml di FBS a 500 ml di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.
   1. Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 50 ml e 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.
   2. Etichettare e datare il mezzo privo di antibiotici e conservarlo a 4 °C.
      NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.
7. Per preparare il tampone di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per l'analisi fenotipica, aggiungere 16,6 ml di albumina sierica bovina sterile a 500 ml di soluzione salina sterile tamponata con 1x fosfato (PBS) in una cappa a flusso laminare.
   1. Etichettare e datare il buffer FACS e conservarlo a 4 °C.
      NOTA: il buffer FACS non richiede la sterilizzazione del filtro finché entrambi i componenti sono conservati sterili. Il buffer FACS può essere conservato prima dell'apertura per 6 mesi a 4 °C.

2. Digestione del tessuto tumorale

1. Trasferire 10 ml di cocktail enzimatico che digerisce il tumore dalla fase 1.2 a un tubo di dissociazione.
2. Trasferire il pezzo di tessuto tumorale in un coperchio sterile a 6 pozzetti usando un bisturi sterile.
   NOTA: La quantità di mezzo che viene trasferita con il tessuto tumorale è sufficiente per l'elaborazione.
   1. Rimuovere tutto il tessuto adiposo, il tessuto necrotico e / o i coaguli di sangue utilizzando un nuovo bisturi sterile e una pinza.
      NOTA: Il tessuto adiposo è normalmente di aspetto giallastro e semisolido. Il tessuto necrotico è più scuro del tessuto circostante in apparenza e molto morbido; sia il tessuto grasso che quello necrotico si rompono facilmente. Il tessuto sanguinante appare rosso vivo e può rilasciare sangue nel mezzo quando manipolato. Una volta rimosso, il tessuto tumorale risultante dovrebbe mantenere la forma ed essere pallido o rosa, a seconda del tipo di tessuto.
   2. Tagliare l'intero tessuto tumorale in 1 mm³ piccoli frammenti. Per garantire che il tessuto non si asciughi, aggiungere 500 μL di 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) sterile al tessuto tumorale.
3. Trasferire frammenti tumorali nel tubo di dissociazione contenente 10 ml di cocktail enzimatico che digerisce il tumore (fase 2.1). Chiudere saldamente il tubo, posizionarlo con il cappuccio verso il basso sul dissociatore tissutale e aggiungere l'apparato riscaldante applicandolo come un manicotto sul tubo di dissociazione e premendo per fare clic per fare clic su di esso in posizione.
   NOTA: La capacità massima per ogni tubo è di 4 g di tumore e 10 ml di volume.
4. Selezionare l'impostazione preprogrammata sul dissociatore 37C_h_TDK_1. Controllare lo stato dopo 10 minuti per assicurarsi che non vi sia alcun errore di intasamento come indicato dalla luce rossa lampeggiante.
   NOTA: questo programma lavora a 1.865 giri/min per 1 ora con temperatura accesa a 37 °C.
   NOTA: se si verifica l'intasamento, rimuovere il tubo di dissociazione e ruotarlo manualmente per rimuovere qualsiasi tessuto catturato nel coperchio; quindi sostituire il tubo sul dissociatore e riprendere il programma.
5. Dopo la digestione di 1 ora, rimuovere il tubo di dissociazione e metterlo in una cappa a flusso laminare. Filtrare il tumore digerito posizionando un filtro a cellule da 70 μm sopra un tubo conico da 50 ml e pipettando il tumore digerito utilizzando una pipetta da 10 ml sul filtro. Se il filtro si intasa, passare a un nuovo filtro.
   1. Risciacquare il tubo di dissociazione con 10 ml di mezzi di digestione tumorale freschi e passare il lavaggio attraverso il filtro.
   2. Rimuovere il filtro da 70 μm ed eliminarlo.
   3. Portare il volume totale a 40 ml con mezzo di digestione tumorale.
6. Centrifugare a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.
7. Utilizzando una pipetta aspirante da 2 ml collegata a una fonte di vuoto, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet e risospescere le cellule utilizzando 10 mL di mezzo tumorale completo sterile.
8. Ripetere il passaggio 2.6.
9. Aspirare il surnatante come descritto al punto 2.7. Risospesere le cellule in 3 mL di mezzo tumorale sterile completo e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra sterile a 6 pozzetti.
10. Tenere la piastra in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂.
11. Dopo 24 ore, trasferire il mezzo usato dal tumore digerito in ben 1 a un nuovo pozzo (bene 2) nella stessa piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 3 ml di terreno tumorale completo sterile al pozzo 1.
12. Trasferire il mezzo usato dai pozzetti 1 e 2 e combinarlo nel pozzo 3 nella stessa piastra a 6 pozzetti 24 ore dopo il passaggio 2.11. Aggiungere 3 ml di mezzo tumorale completo sterile nei pozzetti 1 e 2.
13. Aspirare il mezzo da tutti e 3 i pozzetti e pipettare 3 mL di mezzo tumorale completo in ciascun pozzetto 48 ore dopo il passaggio 2.12.

3. Generazione della linea cellulare tumorale primaria

1. Utilizzando un microscopio a fase invertita, determinare la percentuale di contaminazione da fibroblasti nella coltura di passaggio precoce.
   NOTA: I fibroblasti sono generalmente lunghi e irregolari e hanno una membrana cellulare mal definita. Appaiono sottili o piatti su una scala Z.
   1. Se la contaminazione dei fibroblasti è superiore al 20% delle cellule nella coltura a passaggio precoce, continuare la coltura dopo aver sostituito il mezzo completo con un mezzo sierico ridotto.
   2. Ripetere la sostituzione con mezzo sierico ridotto nel passaggio 3.1.1 due volte a settimana per 3-4 settimane.
   3. Quando la coltura raggiunge l'80% di confluenza, passare le cellule dividendo 50:50 in 2 nuovi pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Continuare a passare 50:50 in mezzi sierici ridotti una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
   4. Ripetere il passaggio 3.1.3 per un massimo di 4 settimane, passando in palloni di coltura più grandi secondo necessità dividendo 50:50 una volta che la coltura raggiunge l'80% di confluenza. Se la popolazione di fibroblasti non è ridotta al 10% o meno, continuare al passo 3.2 per tentare il metodo di tripsinizzazione differenziale per rimuovere la contaminazione da fibroblasti. In caso contrario, procedere al passaggio 3.3.
2. Per arricchire le cellule tumorali, sciacquare delicatamente il pozzetto con 1x PBS per rimuovere il siero contenente il mezzo.
   1. Aggiungere la tripsina come segue: 1 mL per pozzetto se in una piastra a 6 pozzetti, 2 mL per un matraccio T25, 3 mL per un pallone T75.
   2. Posizionare la piastra o il matraccio a 6 pozzetti in un'incubatrice a 37 °C per 1 minuto. Rimuovere la piastra o il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le cellule sono parzialmente sollevate o galleggianti, rimuovere delicatamente le cellule sospese e solo la tripsina. Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 ml contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo.
      NOTA: questa raccolta parziale di celle basata sulle proprietà di adesione è la prima di più frazioni.
   3. Ripetere i passaggi 3.2.1 e 3.2.2 fino a quando tutte le celle non vengono sollevate o vengono rimosse 4 frazioni.
   4. Centrifugare tutte le frazioni indipendenti a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.
   5. Aspirare il surnatante come descritto nel passaggio 2.7 e risospesare le cellule utilizzando 5 mL di terreno sterile a ridotto siero.
   6. Placcare le celle in un matraccio T25 per ogni frazione e porre i palloni in un'incubatrice a 37 °C.
   7. Valutare la coltura dopo 48 ore per determinare quale frazione è arricchita per le cellule tumorali rispetto ai fibroblasti. Scartare i palloni ricchi di fibroblasti. Se la contaminazione da fibroblasti è <10%, continuare l'espansione nel mezzo tumorale completo e procedere alla fase 4. Se la contaminazione da fibroblasti è del 10-30%, ripetere i passaggi 3.1.2-3.1.4. Se la contaminazione dei fibroblasti è superiore al 30%, ripetere i passaggi 3.2-3.2.7.
3. Se pochi o nessun fibroblasto viene rilevato all'interno della coltura di passaggio precoce, continuare a passare le cellule in mezzo tumorale completo dividendo 50:50 una volta che le cellule sono confluenti all'80% nella loro piastra o pallone a 6 pozzetti.

4. Espansione della linea cellulare tumorale primaria a passaggio precoce

1. Una volta che la coltura tumorale primaria contiene il 10% o meno di contaminazione da fibroblasti, aspirare il mezzo e sostituirlo con un mezzo tumorale completo sterile due volte a settimana.
   NOTA: il volume medio ottimale per un T25 è di 5 ml; T75 è di 12 ml; T150 è di 25 ml.
   1. Passare la coltura 50:50 in palloni più grandi secondo necessità una volta raggiunta l'80% di confluenza nel piatto o nel pallone.
      NOTA: potrebbe essere necessario passare la coltura a un rapporto più elevato a seconda della sua crescita. Regola in modo che la cultura raggiunga l'80% di confluenza ogni 3-5 giorni.
2. Passaggio fino a quando la cultura è al passaggio 4 o superiore. Una volta che la coltura è confluente all'80% in un minimo di due palloni T75, continuare con la fase 5.

5. Caratterizzazione e banking di linee cellulari tumorali primarie consolidate

1. Crioconservare un pallone T75 come congelamento a passaggio precoce. Per il test del micoplasma dei restanti palloni T75, continuare con il punto 5.2.
   1. Per la crioconservazione delle cellule a passaggio precoce, scongelare 1 tubo di terreno di congelamento aliquotato preparato nella fase 1.5.
   2. Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione lavando prima la piastra con 1x PBS come descritto nel passaggio 3.2 e aggiungendo tripsina come descritto nel passaggio 3.2.1.
   3. Mettere il matraccio in un'incubatrice a 37 °C per 3 minuti. Rimuovere il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le cellule si sollevano o galleggiano, rimuovere delicatamente le cellule sospese e la tripsina. Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 ml contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo.
      NOTA: Se le cellule rimangono aderenti dopo 3 minuti, riposizionare il pallone nell'incubatrice per altri 2 minuti.
   4. Mescolare bene il tubo pipettando delicatamente e rimuovere 20 μL per il conteggio.
   5. Centrifugare il tubo a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   6. Mentre le cellule girano, contare utilizzando un protocollo di conteggio specifico per il laboratorio come il blu di tripano o l'acridina arancione / ioduro di propidio (AO / PI).
   7. Risospesere le cellule dopo centrifugazione in mezzo di congelamento con un minimo di 2 × 10⁶ celle/1 mL di terreno di congelamento.
   8. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare dal punto 5.1.7 a crioviali premarcati da 1,5 mL.
   9. Posizionare i criocerali in una camera di congelamento a velocità controllata e trasferirli immediatamente a -80 °C.
   10. Conservare le celle a -80 °C per un massimo di 1 settimana prima di trasferirle in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
2. Dividere un pallone T75 50:50 per il test del micoplasma. Cambiare il mezzo in mezzo privo di antibiotici preparato nel passaggio 1.6.
   1. Dopo 72 ore, scongelare il reagente di rilevamento del micoplasma, il substrato e i controlli a temperatura ambiente per 15 minuti prima del test.
   2. Raccogliere 1 mL del surnatante da ogni coltura da testare e posizionarlo in un tubo conico da 15 mL.
   3. Pellet le celle sospese centrifugando il surnatante a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Caricare 100 μL di supernatanti campione e controlli in una piastra bianca a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di reagente per il rilevamento del micoplasma a ciascun campione e controllo.
   5. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   6. Posizionare la piastra in un lettore di piastre e leggere la luminescenza (lettura A, cioè prima lettura).
      NOTA: il protocollo del produttore del kit mycoplasma indica il mantenimento delle impostazioni predefinite sui lettori di piastre multifunzionali. La lettura è impostata sull'endpoint di luminescenza con un tempo di integrazione di 1 s e un guadagno di 135. Il lettore di piastre utilizza una routine di scalabilità automatica per ottimizzare il segnale di guadagno per ogni esperimento. Il tempo di integrazione di 1 s è predefinito standard. Entrambe le impostazioni vengono utilizzate per regolare l'intensità del segnale luminescente interpretato dal lettore di piastre e potrebbe essere necessario regolarle in base al singolo lettore di piastre.
   7. Rimuovere la piastra dal lettore di piastre e aggiungere 100 μL del substrato di rilevamento del micoplasma a ciascun campione e ai controlli.
   8. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   9. Posizionare la piastra nel lettore di piastre e leggere la luminescenza (lettura B, cioè seconda lettura).
   10. Per determinare la positività al micoplasma, determinare il rapporto tra la lettura B e la lettura A.
       NOTA: i rapporti di positività del micoplasma sono descritti nel protocollo del produttore del kit mycoplasma. Le letture A e B vengono acquisite con le stesse impostazioni e riflettono semplicemente l'ordine di lettura.
       1. Si consideri un rapporto < 1 come micoplasma-negativo.
       2. Considerare un rapporto di 1-1,2 come inconcludente e ripetere il passaggio 5.2.
       3. Considerare un rapporto > 1,2 per essere micoplasma-positivo e monitorare questa coltura; terminare la lingua, se necessario.
3. Caratterizzazione della citometria a flusso di cellule tumorali micoplasma-negative
   1. Rimuovere le cellule tumorali utilizzando il tampone di dissociazione cellulare.
   2. Contare le celle e risospesce le celle a 1 × 10⁶/mL nel buffer FACS dal passaggio 1.7.
   3. Rimuovere 100 μL di sospensione cellulare in singoli tubi per la colorazione superficiale.
   4. Centrifugare a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.
   5. Aspirare il surnatante e bloccare i recettori Fc incubando le cellule in 500 μL di siero di capra al 5% in tampone FACS a temperatura ambiente per 10 minuti.
   6. Aggiungere 2 mL di tampone FACS e centrifugare la sospensione a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   7. Aspirare il surnatante e aggiungere la miscela superficiale di anticorpi (Tabella 1) e tampone FACS in modo che il volume finale sia di 100 μL. Coprire i campioni e macchiarli sul ghiaccio per 30 minuti.
   8. Ripetere il passaggio 5.3.6.
   9. Aspirare il surnatante e fissare le cellule riesuscendo in 200 μL di paraformaldeide (PFA) all'1% più 0,25% di EtOH. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti con i campioni al riparo dalla luce.
   10. Ripetere il passaggio 5.3.6. Risospesare le cellule in 200 μL di tampone FACS per l'acquisizione utilizzando un citometro a flusso appropriato.
       NOTA: Le cellule tumorali del mesotelioma dovrebbero essere positive per mesotelina e N-caderina. Alcuni possono anche esprimere CD90.
4. Espandere nel mezzo tumorale completo e nella banca come descritto nei passaggi 4.1 e 5.1, rispettivamente.

Risultati

Per determinare la contaminazione dei fibroblasti delle colture a passaggio precoce, le cellule vengono valutate utilizzando un microscopio a fase invertita per identificare la frequenza dei fibroblasti rispetto alle altre cellule aderenti presenti. La Figura 1 mostra esempi di aumento della contaminazione da fibroblasti dell'80% (Figura 1A), del 50% (Figura 1B) e del 30% (Figura 1C), rispetto a una col...

Discussione

Mentre questo protocollo è semplice, ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguiti da vicino. Il congelamento del passaggio precoce è importante per preservare la capacità di ripetere il processo di arricchimento delle cellule tumorali se inizialmente non ha successo. La capacità di valutare la contaminazione fibroblastica ad occhio per decidere la corretta tecnica di scissione e fame dei media è vitale per prevenire la crescita eccessiva dei fibroblasti nella coltura. Inoltre, il metodo di tripsinizzazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML